化疗栓塞后肝细胞癌细胞凋亡的研究
作者：肖恩华 胡国栋 刘鹏程 胡道予
单位：430030 武汉， 同济医科大学附属同济医院放射科(肖恩华、胡国栋、刘鹏程、胡道予)
关键词：癌，肝细胞；化学栓塞，治疗性；细胞凋亡；流式细胞术；对比研究
中华放射学杂志990303 【摘要】 目的 研究肝细胞癌患者经动脉化疗栓塞(transarterial chemoembolization, TACE)治疗后肿瘤细胞凋亡的情况。方法 用光学显微镜(简称光镜)和流式细胞仪对117例手术切除的肝细胞癌标本进行凋亡检测；其中单纯手术58例，4种介入治疗后二期手术切除59例。结果 流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡率，单纯手术组为1.77%，行介入治疗的A、B、C、D 4个治疗组分别为6.11%、8.71%、13.29%、15.73%，经秩和检验，除C、D组间比较P>0.05，其余两两比较P值均<0.05。末次TACE与手术切除间期<1个月、1～2个月、2～3个月、≥3个月，其平均凋亡率分别为12.7%、13.5%、8.5%、5.2%，与对照组比较P值均<0.05。光镜观察凋亡指数D组高于C组、高于B组、高于A组、高于单纯手术组。结论 细胞凋亡是TACE引起肝癌细胞死亡的另一重要机制，且作用持续时间长。碘油、乙醇、明胶海绵联合栓塞优于单一材料栓塞。
, 百拇医药
A study on apoptosis of hepatocellular carcinoma cells after transarterial chemoembolization XIAO Enhua, HU Guodong, LIU Pengcheng, et al. Department of Radiology, Tongji Hospital Tongji Medical University, Wu Han 430030
【Abstract】 Objective To study apoptosis of hepatocellular carcinoma (HCC) cells after transcatheter arterial chemoembolization. Methods One hundred and seventeen histologically verified HCC specimens were studied. The patients were treated with surgical resection alone (58 cases), second stage surgical resection after four kinds of interventional treatment(59 cases). Microscope and flow cytometry were used to observe the apoptosis. Results Quantification of apoptosis using flow cytometry indicated that the apoptosis index(AI) of HCC cells accounted for 1.77% in first stage resection group, 6.11% in chemotherapy alone,8.71% in chemotherapy combined with iodized oil, 13.29% in chemotherapy combined with iodized oil and spongia gelatini absorbens(Sga), 15.73% in chemotherapy combined with iodized oil, ethanol and Sga. Except for the latter 2 groups with P>0.05, all other comparisons showed P<0.05.H.E staining slides showed typical morphological appearence of apoptosis. AI of HCC cells <1,1-2,2-3 and ≥3 months after TACE was 12.7%、13.5%、8.5%、5.2% respectively. Conclusions Appoptosis is another important mechanism leading to cell death in HCC after TACE. Combined embolization of iodized oil、ethanol、and Sga is superior to that using single material.
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【Key words】 Carcinoma, hepatocellular Chemoembolization, therapeutic ApoptosisFlow cytometry Comparative study
细胞凋亡是不同于细胞坏死的另一种细胞死亡方式[1]。为评价肝细胞癌化疗栓塞后的细胞凋亡，我们用光学显微镜(简称光镜)和流式细胞仪对肝细胞癌一期手术标本和经动脉化疗栓塞(transarterial chemoembolization, TACE)后二期手术标本进行了肿瘤细胞凋亡的检测。
材料与方法
1.标本来源： 选用我院外科手术切除的肝细胞癌标本117例， 一期手术(术前未经其他治疗)58例为对照组，单纯灌注化疗药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)，丝裂霉素C(MMC)，顺1.1-环丁烷二羧酸二氨合铂(卡铂)或顺二氨二氯络铂(顺铂)等后行二期手术者11例为A组；单用碘油抗癌药混合剂行二期手术者8例为B组；碘化油抗癌药混合剂加明胶海绵(Sga)联合栓塞后行二期手术者23例为C组(其中完全坏死6例)；先灌注化疗药物，继而注射无水乙醇碘油乳剂栓塞，最后用明胶海绵栓塞后行二期手术者17例为D组(其中完全坏死6例)。
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2. 光镜观察：117例肿块中央、周边部及交界处分别取材， 常规HE染色，行组织学诊断，对完全坏死者需反复取材。光镜下凋亡细胞的特征包括：(1)散在单个细胞；(2)细胞形态变小，轮廓清楚，常有一环状的空白区；(3) 核染色质浓聚并有聚边的倾向；(4) 出现凋亡小体。以每10个高倍镜视野凋亡细胞超过10个为细胞凋亡阳性病例。
3. 流式细胞仪检测：取无坏死的肝癌组织，切40 μm厚片共5张，置玻璃试管中，加二甲苯3 ml脱蜡，在室温下脱蜡1～2天，再行梯度乙醇水化，每步10分钟，每管加0.5%的胃蛋白酶消化液3～5 ml放入37℃水中置30分钟左右，用缓冲液(PBS)终止消化，离心沉淀(1 500 r/min)5分钟，弃上清液， 再加入PBS漂洗一次。以短时低速离心沉淀(500～800 r/min，计2分钟)去除细胞碎片， 以100目的筛网滤去未消化完的组织片，弃上清液后加入冰冻的质量分数为70%的乙醇中固定，并保存于4℃待测。用溴化啶一步插入DNA荧光染色法，使用荧光激活细胞分选仪(FACS 420型)检测标本，以氩离子激光(488 nm，300 mW功率)作激化光源，细胞DNA发出的荧光信号在多道脉冲分析器(0～255道)中记录，并以组方图和数据表方式在屏幕上显示。
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4.统计学处理：采用秩和检验。
结 果
1. 光镜观察：全部117例均经光镜检查，肿瘤细胞凋亡阳性病例， 对照组为21.05%，A组为27.27%，B组为50.00%，C组为70.59%，D组为75.00%。
2. 流式细胞仪分析： 从对照组随机取11例，A组取7例(另有4例标本太少)，B组取8例，C组取15例(有2例标本太少，另去除6例完全坏死者)，D组取11例(去除6例完全坏死者)，有4例(B组1例，C组2例、D组1例)因技术原因结果不宜统计，共统计48例，凋亡细胞平均数，对照组为1.77%，A组为6.11%，B组为8.71%，C组为13.29%，D组为15.73%。经秩和检验，除C和D组间比较P>0.05外，其余两两比较P值均<0.05。
3.介入次数及术后至二期手术间隔与细胞凋亡的关系：介入治疗，1次31例， 2次2例， 3次3例，4次1例，平均凋亡率分别为12.2%, 9.1%，13.5%，5.9%。末次介入后至二期手术切除间期<1个月18例，1～2个月13例，2～3个月3例， ≥3个月3例，平均凋亡率分别为12.7%, 13.5%, 8.5%，5.2%， 与对照组的1.77%相比P值均<0.05。
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讨 论
到目前为止，TACE是非手术治疗原发性肝细胞癌(PHC)的主要方法，它适用于各种类型的PHC，不管肿瘤的部位、大小、数目，是早期还是进展期，均可引起肿瘤不同程度的坏死和缩小[2]。但TACE对PHC细胞凋亡的影响文献报道甚少。 细胞凋亡是由基因调控的细胞主动消亡的过程， 与肿瘤的发生、发展和治疗密切相关， 其形态学和生化特征与细胞坏死完全不同[1]。凋亡的检测手段有形态学检测、生化方法、免疫学方法及分子生物学技术。本研究中我们采用光镜和流式细胞仪联合检测。 因我们使用的流式细胞仪检测是单激光单染色法， 凡DNA含量小于双倍体的细胞(包括坏死细胞)均可被认为是凋亡细胞，经光镜筛选，选择无坏死的肿瘤组织，可提高结果的准确性。
本研究显示，化疗栓塞组较单纯手术组PHC细胞的凋亡率增高，有显著性差异，说明化疗栓塞除引起肿瘤坏死外，还可通过诱导肿瘤细胞凋亡使肿瘤缩小或退变。化疗栓塞诱导PHC细胞凋亡，在1～2个月达高峰，然后下降，持续到3个月之后，仍比单纯手术组明显增高。由于行2次和4次TACE的病例少(分别为2例和1例)，尚看不出TACE次数与凋亡程度有明显关系。 但行3次治疗者较1次治疗者凋亡率高，提示TACE所致凋亡与治疗次数呈正相关， 有待进一步观察。本组资料显示TACE所致凋亡与治疗方法密切相关。化疗药乙醇或碘化油与明胶海绵联合应用组(C组和D组)PHC细胞的凋亡率高于单纯灌注化疗药(A组)或碘油化疗药栓塞组(B组)， 有显著性差异，说明多材料联合栓塞优于单一材料栓塞。但各组肿瘤细胞的凋亡率尚不高，因此研究开发新的凋亡诱导剂和TACE并用，以便使肿瘤细胞达到更高的凋亡率，是我们面临的新课题。
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化疗栓塞诱导PHC细胞凋亡的途径，有以下几种可能：(1)与栓塞剂合用的化疗药物的作用。大多数抗癌药是通过诱导细胞凋亡发挥细胞毒作用的[3]。或通过损伤DNA诱导凋亡，或使促凋亡基因表达增高，或使凋亡抑制基因失活不表达，从而使凋亡增加[4]。(2)栓塞剂本身的作用。 乙醇可直接损害PHC细胞，并通过其代谢产物与细胞内大分子物质结合而诱导凋亡[5]。(3)TACE可引起肿瘤区缺血，缺氧。缺血是强有力的基因诱导动因，文献报道脑缺血至少可导致80种以上的基因表达，在缺血数分钟，就有即刻早期基因(immediate early gene, IEG)表达[6]。缺氧也可诱导促凋亡基因表达增高[7]。但TACE后肝癌组织的有关基因变化，有待进一步研究。(4)TACE后可引起肿瘤坏死因子等细胞因子表达增高，而这些细胞因子可诱导细胞凋亡[8]。
光镜下可误为凋亡细胞的细胞包括浸润淋巴细胞和中性粒细胞。淋巴细胞常为单个均一圆形或卵圆形的核，缺乏凋亡细胞所具有的簇状的多发不规则的核碎片；中性粒细胞的特征是多叶核，胞浆染色淡，根据光镜下凋亡细胞的特征常可将它们区分[9]。
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总之，肿瘤细胞凋亡和增殖的比例决定肿瘤的生长速度[1]，同时凋亡的进一步研究也为肿瘤治疗、疗效评估提供了新的思路。
本研究为国家“九五”攻关项目课题，批准号：96-907-03-01
参考文献
1 肖恩华， 胡国栋. 细胞凋亡与肝癌(综述). 国外医学临床放射学分册，1999， 22：1-4.
2 Okada S. Transcatheter arterial embolization for advanced hepatocellular carcinoma： the controversy continues. Hepatology, 1998,27:1743-1744.
3 Burger H, Nooter K, Boersma AWM, et al. Expression of p53, bcl-2 and Bax in cisplatin-induced apoptosis in testicular germ cell tumor cell lines. Br J Cancer, 1998, 77:1562-1567.
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4 Hallar S,Basu A, Iroce CM. Serine-70 is one of the critical sites for drug-induced bcl-2 phosphorylation in cancer cells. Cancer Res, 1998, 58:1609-1615.
5 马运目. 肝癌凋亡细胞相关蛋白的表达分析. 临床与实验病理学杂志，1997，13：197-201.
6 Akins PT,Liu PK, Hsu CY,et al.Immediate early gene expression in response to cerebral ischemia. friend or foe? Stroke, 1996, 27:1682-1687.
7 An WG, Kanekal M, Simon MC, et al. Stabilization of wild-type p53 by hypoxia-inducile factor 1α. Nature，1998,392:405-408.
, 百拇医药
8 Seraldi G, Shaklec CL, Simon B, et al. Keratinocyte growth factor protects murine hepatocytes from tumr necrosis factor-induced apoptosis in vivo and in vitro. Hepatology, 1998, 27:1584-1591.
9 Biscotti CV, Hart WR. Apoptotic bodies, a consisent morphologic feature of endo cerueal adenocarcinoma in situ. Am J Pathol , 1998, 22:434-439.
(收稿：1998-07-27 修回：1998-12-16), http://www.100md.com
单位：430030 武汉， 同济医科大学附属同济医院放射科(肖恩华、胡国栋、刘鹏程、胡道予)
关键词：癌，肝细胞；化学栓塞，治疗性；细胞凋亡；流式细胞术；对比研究
中华放射学杂志990303 【摘要】 目的 研究肝细胞癌患者经动脉化疗栓塞(transarterial chemoembolization, TACE)治疗后肿瘤细胞凋亡的情况。方法 用光学显微镜(简称光镜)和流式细胞仪对117例手术切除的肝细胞癌标本进行凋亡检测；其中单纯手术58例，4种介入治疗后二期手术切除59例。结果 流式细胞仪检测肿瘤细胞的凋亡率，单纯手术组为1.77%，行介入治疗的A、B、C、D 4个治疗组分别为6.11%、8.71%、13.29%、15.73%，经秩和检验，除C、D组间比较P>0.05，其余两两比较P值均<0.05。末次TACE与手术切除间期<1个月、1～2个月、2～3个月、≥3个月，其平均凋亡率分别为12.7%、13.5%、8.5%、5.2%，与对照组比较P值均<0.05。光镜观察凋亡指数D组高于C组、高于B组、高于A组、高于单纯手术组。结论 细胞凋亡是TACE引起肝癌细胞死亡的另一重要机制，且作用持续时间长。碘油、乙醇、明胶海绵联合栓塞优于单一材料栓塞。
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A study on apoptosis of hepatocellular carcinoma cells after transarterial chemoembolization XIAO Enhua, HU Guodong, LIU Pengcheng, et al. Department of Radiology, Tongji Hospital Tongji Medical University, Wu Han 430030
【Abstract】 Objective To study apoptosis of hepatocellular carcinoma (HCC) cells after transcatheter arterial chemoembolization. Methods One hundred and seventeen histologically verified HCC specimens were studied. The patients were treated with surgical resection alone (58 cases), second stage surgical resection after four kinds of interventional treatment(59 cases). Microscope and flow cytometry were used to observe the apoptosis. Results Quantification of apoptosis using flow cytometry indicated that the apoptosis index(AI) of HCC cells accounted for 1.77% in first stage resection group, 6.11% in chemotherapy alone,8.71% in chemotherapy combined with iodized oil, 13.29% in chemotherapy combined with iodized oil and spongia gelatini absorbens(Sga), 15.73% in chemotherapy combined with iodized oil, ethanol and Sga. Except for the latter 2 groups with P>0.05, all other comparisons showed P<0.05.H.E staining slides showed typical morphological appearence of apoptosis. AI of HCC cells <1,1-2,2-3 and ≥3 months after TACE was 12.7%、13.5%、8.5%、5.2% respectively. Conclusions Appoptosis is another important mechanism leading to cell death in HCC after TACE. Combined embolization of iodized oil、ethanol、and Sga is superior to that using single material.
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细胞凋亡是不同于细胞坏死的另一种细胞死亡方式[1]。为评价肝细胞癌化疗栓塞后的细胞凋亡，我们用光学显微镜(简称光镜)和流式细胞仪对肝细胞癌一期手术标本和经动脉化疗栓塞(transarterial chemoembolization, TACE)后二期手术标本进行了肿瘤细胞凋亡的检测。
材料与方法
1.标本来源： 选用我院外科手术切除的肝细胞癌标本117例， 一期手术(术前未经其他治疗)58例为对照组，单纯灌注化疗药物5-氟尿嘧啶(5-Fu)，丝裂霉素C(MMC)，顺1.1-环丁烷二羧酸二氨合铂(卡铂)或顺二氨二氯络铂(顺铂)等后行二期手术者11例为A组；单用碘油抗癌药混合剂行二期手术者8例为B组；碘化油抗癌药混合剂加明胶海绵(Sga)联合栓塞后行二期手术者23例为C组(其中完全坏死6例)；先灌注化疗药物，继而注射无水乙醇碘油乳剂栓塞，最后用明胶海绵栓塞后行二期手术者17例为D组(其中完全坏死6例)。
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2. 光镜观察：117例肿块中央、周边部及交界处分别取材， 常规HE染色，行组织学诊断，对完全坏死者需反复取材。光镜下凋亡细胞的特征包括：(1)散在单个细胞；(2)细胞形态变小，轮廓清楚，常有一环状的空白区；(3) 核染色质浓聚并有聚边的倾向；(4) 出现凋亡小体。以每10个高倍镜视野凋亡细胞超过10个为细胞凋亡阳性病例。
3. 流式细胞仪检测：取无坏死的肝癌组织，切40 μm厚片共5张，置玻璃试管中，加二甲苯3 ml脱蜡，在室温下脱蜡1～2天，再行梯度乙醇水化，每步10分钟，每管加0.5%的胃蛋白酶消化液3～5 ml放入37℃水中置30分钟左右，用缓冲液(PBS)终止消化，离心沉淀(1 500 r/min)5分钟，弃上清液， 再加入PBS漂洗一次。以短时低速离心沉淀(500～800 r/min，计2分钟)去除细胞碎片， 以100目的筛网滤去未消化完的组织片，弃上清液后加入冰冻的质量分数为70%的乙醇中固定，并保存于4℃待测。用溴化啶一步插入DNA荧光染色法，使用荧光激活细胞分选仪(FACS 420型)检测标本，以氩离子激光(488 nm，300 mW功率)作激化光源，细胞DNA发出的荧光信号在多道脉冲分析器(0～255道)中记录，并以组方图和数据表方式在屏幕上显示。
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4.统计学处理：采用秩和检验。
结 果
1. 光镜观察：全部117例均经光镜检查，肿瘤细胞凋亡阳性病例， 对照组为21.05%，A组为27.27%，B组为50.00%，C组为70.59%，D组为75.00%。
2. 流式细胞仪分析： 从对照组随机取11例，A组取7例(另有4例标本太少)，B组取8例，C组取15例(有2例标本太少，另去除6例完全坏死者)，D组取11例(去除6例完全坏死者)，有4例(B组1例，C组2例、D组1例)因技术原因结果不宜统计，共统计48例，凋亡细胞平均数，对照组为1.77%，A组为6.11%，B组为8.71%，C组为13.29%，D组为15.73%。经秩和检验，除C和D组间比较P>0.05外，其余两两比较P值均<0.05。
3.介入次数及术后至二期手术间隔与细胞凋亡的关系：介入治疗，1次31例， 2次2例， 3次3例，4次1例，平均凋亡率分别为12.2%, 9.1%，13.5%，5.9%。末次介入后至二期手术切除间期<1个月18例，1～2个月13例，2～3个月3例， ≥3个月3例，平均凋亡率分别为12.7%, 13.5%, 8.5%，5.2%， 与对照组的1.77%相比P值均<0.05。
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讨 论
到目前为止，TACE是非手术治疗原发性肝细胞癌(PHC)的主要方法，它适用于各种类型的PHC，不管肿瘤的部位、大小、数目，是早期还是进展期，均可引起肿瘤不同程度的坏死和缩小[2]。但TACE对PHC细胞凋亡的影响文献报道甚少。 细胞凋亡是由基因调控的细胞主动消亡的过程， 与肿瘤的发生、发展和治疗密切相关， 其形态学和生化特征与细胞坏死完全不同[1]。凋亡的检测手段有形态学检测、生化方法、免疫学方法及分子生物学技术。本研究中我们采用光镜和流式细胞仪联合检测。 因我们使用的流式细胞仪检测是单激光单染色法， 凡DNA含量小于双倍体的细胞(包括坏死细胞)均可被认为是凋亡细胞，经光镜筛选，选择无坏死的肿瘤组织，可提高结果的准确性。
本研究显示，化疗栓塞组较单纯手术组PHC细胞的凋亡率增高，有显著性差异，说明化疗栓塞除引起肿瘤坏死外，还可通过诱导肿瘤细胞凋亡使肿瘤缩小或退变。化疗栓塞诱导PHC细胞凋亡，在1～2个月达高峰，然后下降，持续到3个月之后，仍比单纯手术组明显增高。由于行2次和4次TACE的病例少(分别为2例和1例)，尚看不出TACE次数与凋亡程度有明显关系。 但行3次治疗者较1次治疗者凋亡率高，提示TACE所致凋亡与治疗次数呈正相关， 有待进一步观察。本组资料显示TACE所致凋亡与治疗方法密切相关。化疗药乙醇或碘化油与明胶海绵联合应用组(C组和D组)PHC细胞的凋亡率高于单纯灌注化疗药(A组)或碘油化疗药栓塞组(B组)， 有显著性差异，说明多材料联合栓塞优于单一材料栓塞。但各组肿瘤细胞的凋亡率尚不高，因此研究开发新的凋亡诱导剂和TACE并用，以便使肿瘤细胞达到更高的凋亡率，是我们面临的新课题。
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化疗栓塞诱导PHC细胞凋亡的途径，有以下几种可能：(1)与栓塞剂合用的化疗药物的作用。大多数抗癌药是通过诱导细胞凋亡发挥细胞毒作用的[3]。或通过损伤DNA诱导凋亡，或使促凋亡基因表达增高，或使凋亡抑制基因失活不表达，从而使凋亡增加[4]。(2)栓塞剂本身的作用。 乙醇可直接损害PHC细胞，并通过其代谢产物与细胞内大分子物质结合而诱导凋亡[5]。(3)TACE可引起肿瘤区缺血，缺氧。缺血是强有力的基因诱导动因，文献报道脑缺血至少可导致80种以上的基因表达，在缺血数分钟，就有即刻早期基因(immediate early gene, IEG)表达[6]。缺氧也可诱导促凋亡基因表达增高[7]。但TACE后肝癌组织的有关基因变化，有待进一步研究。(4)TACE后可引起肿瘤坏死因子等细胞因子表达增高，而这些细胞因子可诱导细胞凋亡[8]。
光镜下可误为凋亡细胞的细胞包括浸润淋巴细胞和中性粒细胞。淋巴细胞常为单个均一圆形或卵圆形的核，缺乏凋亡细胞所具有的簇状的多发不规则的核碎片；中性粒细胞的特征是多叶核，胞浆染色淡，根据光镜下凋亡细胞的特征常可将它们区分[9]。
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总之，肿瘤细胞凋亡和增殖的比例决定肿瘤的生长速度[1]，同时凋亡的进一步研究也为肿瘤治疗、疗效评估提供了新的思路。
本研究为国家“九五”攻关项目课题，批准号：96-907-03-01
参考文献
1 肖恩华， 胡国栋. 细胞凋亡与肝癌(综述). 国外医学临床放射学分册，1999， 22：1-4.
2 Okada S. Transcatheter arterial embolization for advanced hepatocellular carcinoma： the controversy continues. Hepatology, 1998,27:1743-1744.
3 Burger H, Nooter K, Boersma AWM, et al. Expression of p53, bcl-2 and Bax in cisplatin-induced apoptosis in testicular germ cell tumor cell lines. Br J Cancer, 1998, 77:1562-1567.
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4 Hallar S,Basu A, Iroce CM. Serine-70 is one of the critical sites for drug-induced bcl-2 phosphorylation in cancer cells. Cancer Res, 1998, 58:1609-1615.
5 马运目. 肝癌凋亡细胞相关蛋白的表达分析. 临床与实验病理学杂志，1997，13：197-201.
6 Akins PT,Liu PK, Hsu CY,et al.Immediate early gene expression in response to cerebral ischemia. friend or foe? Stroke, 1996, 27:1682-1687.
7 An WG, Kanekal M, Simon MC, et al. Stabilization of wild-type p53 by hypoxia-inducile factor 1α. Nature，1998,392:405-408.
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8 Seraldi G, Shaklec CL, Simon B, et al. Keratinocyte growth factor protects murine hepatocytes from tumr necrosis factor-induced apoptosis in vivo and in vitro. Hepatology, 1998, 27:1584-1591.
9 Biscotti CV, Hart WR. Apoptotic bodies, a consisent morphologic feature of endo cerueal adenocarcinoma in situ. Am J Pathol , 1998, 22:434-439.
(收稿：1998-07-27 修回：1998-12-16), http://www.100md.com