应用套式聚合酶链反应技术检测孕妇与胎儿巨细胞病毒感染
作者：尚世强 洪文澜 石一复 顾佩宝 余钟声 俞锡林 潘存梅
单位：杭州，310003 浙江医科大学儿童医院(尚世强，洪文澜，余钟声，俞锡林，潘存梅)，妇产科医院(石一复，顾佩宝)
关键词：聚合酶链反应；巨细胞病毒感染；DNA限制酶类
C:\rrx\zhfckzz3\FC3A2.htm 【摘要】 目的 评价套式聚合酶链反应技术(NT-PCR)加限制酶分析在孕妇与胎儿人巨细胞病毒(HCMV)感染检测中的应用价值。方法 应用NT-PCR及限制酶分析、病毒分离、电镜观察和特异性抗体测定，对各孕期孕妇367例的外周血、部分孕妇脐血及死胎组织进行HCMV检测。结果 孕早、中、晚期HCMV阳性检出率分别为8.6%、1.6%及7.0%，NT-PCR检出率(4.9%)高于病毒分离(3.0%，P<0.025)。6份HCMV DNA阳性母血中，3份配对脐血HCMV DNA也阳性。其中2对NT-PCR、病毒分离及特异性IgM、IgA均阳性，1对NT-PCR、病毒分离、特异性IgA阳性，而IgM阴性。28例死胎组织中，发现1例死胎肺组织HCMV DNA阳性。结论 NT-PCR能提高诊断HCMV感染的特异性与敏感性。
, http://www.100md.com
Detection of Human Cytomegalovirus Infection in Pregnant Women and Their Fetuses by Nested Polymerase Chain Reaction Shang Shiqiang*, Hong Wenlan*, Shi Yifu, et al. *Children′s Hospital of Zhejiang Medical University, Hangzhou 310003
【Abstract】 Objectives To evaluate the applicability of nested polymerase chain reaction (PCR) and restriction endonucleases analyses (REA) for the diagnosis of human cytomegalovirus (HCMV) in pregnant women and their fetuses. Methods Nested PCR and REA, virus isolation, anti-HCMV-IgM and anti-HCMV-IgA were used for detection of HCMV in peripheral blood of pregnant women, umbilical blood and tissues of stillbirths. Results among 367 pregnant women, the HCMV infections rate in the first, second and third trimester of gestation were 8.6%, 1.6% and 7.0%, respectively. The nested PCR had significantly higher detective rate (4.9%) than that of virus isolation (3.0%, P<0.025). Among 6 samples of maternal HCMV DNA positive blood, 3 matched umbilical samples were HCMV DNA positive as well. Of these 3 cases, HCMV intrauterine infection was considered. HCMV was detected with all measurements in both maternal and umbilical blood except in 1 paired samples specific-IgM were negative. HCMV DNA was found in the lung tissue of one of the 28 stillbirths. Conclusion the diagnostic specificity and sensitivity of HCMV can be raised by nested PCR.
, 百拇医药
【Key words】 Polymerase chain reaction Cytomegalovirus infections DNA restriction enzymes
人巨细胞病毒(HCMV)是先天性病毒感染中最主要的病原，我国先天性HCMV感染率达0.5%～0.8%，严重影响优生优育。近年来，套式聚合酶链反应技术(NT-PCR)已用于HCMV的早期诊断，使得临床上能早期、快速地发现HCMV宫内感染。但PCR存在假阳性及非特异性条带的干扰等问题。为克服上述缺点，我们自行设计并建立了NT-PCR加限制酶分析方法。通过检测孕妇外周血、脐血、死胎内脏HCMV DNA，并与病毒分离、电镜观察、特异性IgM及IgA检测结果相对照，取得较好结果。现报道如下。
材料与方法
一、病毒与细胞来源
HCMV AD 169及Davis标准毒株、单纯疱疹病毒(HSV)Ⅰ型及Ⅱ型及人胚肺二倍体(HF)细胞由安徽医科大学微生物教研室提供。EB病毒(EBV)和正常人基因组DNA由中国预防医学科学院病毒所提供。
, http://www.100md.com
二、标本采集
1993年3月～1995年4月，在浙江医科大学妇产科医院共收集了367例孕6～42周的孕妇外周血，其中114例孕34～42周妇女在分娩时抽取脐带血(母-脐配对血)，每份5 ml。在此期间，收集到流产、死胎28例，分别取其心、脑、肝、肾、肺、眼等组织。所有标本均在4℃冰箱保存，12小时内处理。
三、NT-PCR检测方法
1.引物设计与合成：引物选自HCMV保守序列直接早期抗原(IEA)基因内，经计算机软件辅助设计，上海细胞生物所381型仪合成。外引物序列为PA1 5′-TGCAACGAGAACCCCGAGAA-3′，PA2 5′-ATCAATGTGCGTGAGCACCT-3′，内引物序列为PB1 5′-CTGAGGATAAGCGGGAGATG-3′，PB2 5′-CACTGAGGCAAGTTCTGCAG-3′。最后所得的244bp DNA片段内含3个内切酶Pst I酶切位点，经PstI酶切后，可得到91、116、22及15bp长度的4个DNA片段来验证其序列的正确性。
, 百拇医药
2.对照设计：阳性对照用HCMV AD169株及Davis株，阴性对照用HSV Ⅰ型与Ⅱ型、EBV、HF细胞和正常人基因组DNA。病毒及HF细胞DNA提取参考Vonsosover方法[1]。
3.标本DNA抽提：人外周血白细胞DNA制备：取200 μl抗凝血，用0.87%NH4Cl反复处理去红细胞，加1×PCR缓冲液(含10 mmol/L TrisCl) pH 8.3，50 mmol/L KCl，2 mmol/L MgCl2，0.01%明胶)，蛋白酶K，0.45% Nonidet P40和0.45%吐温，待细胞完全裂解，沸水浴10分钟后取上清液备用。组织细胞DNA制备：取少许组织块，生理盐水洗涤1次，无菌条件下轻碾成匀浆，加1×PCR缓冲液，余同白细胞抽提。
4.NT-PCR扩增与限制酶分析：方法见参考文献[2]。
, 百拇医药 四、血清抗 HCMV IgM和抗 HCMV IgA检测与病毒分离
方法见参考文献[2]。
五、电镜观察
取病毒分离培养液，经低速离心，去上清，用1%戊二醛及1%蛾酸作双固定，用Epon812环氧树脂包埋，在LKB超薄切片机上切片，再经铀及铅片染色，然后在Philips EM410透射电镜上观察HCMV病毒颗粒及细胞病变。
结果
一、NT-PCR扩增HCMV DNA的准确性
NT-PCR扩增HCMV AD169株及Davis株DNA，经电泳在相当于244bp处均可见一条DNA带，用HSV Ⅰ型与Ⅱ型、EBV、HF细胞及正常人DNA模板扩增，未见阳性区带。取HDMV AD169株所抽提的DNA作模板，1∶10定量稀释，一次性PCR最小检出量为100fg DNA，NT-PCR最小检出量为10 fg。对HCMV AD169株及Davis株DNA经NT-PCR扩增后，进行PstⅠ酶切分析，产生两条特定分子量的DNA片段，经计算分别为116 bp及91 bp。其中22 bp及15 bp两条DNA带因分子量过小而未能检出。
, 百拇医药
二、孕妇与胎儿HCMV检测结果
367例孕早、中、晚期妇女HCMV阳性检出率分别为8.6%，1.6%及7.0%。经NT-PCR检测，共有18名HCMV DNA阳性，阳性率为4.9%，而病毒分离、特异性IgM及IgA阳性率分别为3.0%、1.1%及2.5%，NT-PCR阳性检出率高于病毒分离等其它方法(附表)，经配对计数资料检验差异有显著性(χ2=5.14，P<0.025)。部分病毒分离阳性标本经电镜观察，在感染的成纤维细胞内见HDMV颗粒(附图)以及胞内病变。
附表 不同孕期孕妇HCMV检测结果(例次) 孕期
总例数
HCMV阳性
NT-PCR
病毒分离
, 百拇医药
IgM
IgA
早期
58
5
4
1
2
中期
123
1
1
0
1
, 百拇医药
晚期
186
12
6
3
5
合计
367
18
11
4
8
114份母-脐配对血中，因标本不符合要求等原因，实测母亲外周血标本109份，脐血105份，因此母-脐血配对血共105份。这105份母-脐配对血中，6份母血HCMV阳性，配对脐血阳性3份，母-儿传播率为3/6。3份母-脐血NT-PCR DNA阳性者中，2份母-脐血标本病毒分离、特异性IgM及IgA均阳性，1份母-脐血标本病毒分离、特异性IgA为阳性，但IgM阴性。未见单独NT-PCR阳性而其它方法阴性的母-儿宫内传播情况。
, 百拇医药
对28份流产、死胎的内脏标本检测HCMV DNA，结果表明，1份死胎肺组织HCMV DNA阳性，其母亲外周血检测结果显示NT-PCR、病毒分离均阳性，特异性IgM、IgA阴性。
讨论
一、NT-PCR加限制酶分析方法的先进性
HCMV感染极为普遍，因人群不同，感染后结果大不相同。一般人群多数为隐性感染，但孕妇HCMV原发感染或激活再发感染可将HCMV传播至胎儿，造成胎儿或新生儿严重的巨细胞包涵体病或神经系统后遗症。迄今尚缺乏防治HCMV感染的有效措施。有报道，疫苗加免疫佐剂在小白鼠体内能产生有效的抗HCMV抗体[3]，但人体内疫苗试验结果欠佳[4]。国外研制的ganciclovir对HCMV感染疗效虽可，但停药后复发率高，且已有耐ganciclovir的变异毒株报道[5]。因此，减少HCMV感染儿出生的重点在于早期诊断先天性HCMV感染。PCR技术是近几年发展起来的一种简便、快速的诊断手段，它已应用于HCMV感染的诸多领域。随着该方法的不断应用，暴露了该方法的某些不足，如判断结果时背景模糊，常有非特异性条带干扰，以及外源性DNA污染造成假阳性等。我们于1990年～1992年期间对我院0～5岁健康体检儿童及内科住院患者进行了血清学HCMV检测，并对部分儿童采用PCR检测HCMV DNA，发现有些标本HCMV DNA阳性结果微弱，经EB染色后难以判断，且有假阳性的可能。为克服上述缺点，我们在IEA基因内，自行设计了两对引物，建立了NT-PCR技术，并使最终扩增产物可进一步酶切分析。经实验证明NT-PCR敏感性优于一次性PCR，阳性结果清晰，未见有非特异性DNA污染，表明有较高的准确性，检测所需时间也短，1天内即可完成。
, 百拇医药
二、NT-PCR提高HCMV DNA检测的准确性
在临床实际检测中，NT-PCR阳性率高于病毒分离等其它方法，说明NT-PCR可以检出其它方法无法查到的HCMV。有报道，单独PCR方法检测HCMV DNA阳性在肝移植及免疫缺陷患者身上并无太大的临床意义，因为它并不能解释HCMV激活感染的危险程度[5～7]。但对于孕妇，在妊娠期间若查到HCMV DNA，可作为一项HCMV监控指标，重点随防，及时发现HCMV母-儿传播的情况。至于胎儿或新生儿，因不存在HCMV继发或激活感染情况，若脐血NT-PCR检测HCMV DNA阳性，则可认为母-儿宫内传播HCMV。本研究进一步用NT-PCR检测了28份死胎内脏的HCMV基因，还发现1例胎儿肺组织HCMV DNA阳性，从而也支持了HCMV可穿透胎盘至胎儿宫内感染，为HCMV感染致流产、死胎提供了较有力的依据。因此，NT-PCR在提高HCMV检测的敏感性及特异性方面有其重要的临床意义。
, 百拇医药
附图 感染的成纤维细胞内见巨细胞病毒颗粒(箭头所示)。电镜×62500
参考文献
1 Vonsosover A. Detection of CMV in urine: comparison between DNA-DNA hybridization, virus isolation and immuno-election microscopy, J Virus Meth， 1987, 16:29-37.
2 尚世强，洪文澜，石一复，等.孕妇巨细胞病毒、弓形虫感染及其可能导致宫内的传播.中华传染病杂志，1996，14：152-155.
3 Britt W, Fay J. Formulation of an immunogenic human cytomegalovirus vaccine: responses in mice. J Infect Dis, 1995, 171:18-25.
, 百拇医药
4 Adler SP， Starr SE, Plotkin SA, et al. Immunity induced by primary among women of children-bearing age. J Infect Dis, 1995, 171:26-34.
5 Drouet F, Colimo R, Micheason S, et al. Monitoring levels of human cytomegalovirus DNA blood after liver transplantation. J Clin Microbiol, 1995, 33:389-394.
6 Zipeto D, Revello MG, Silini E, et al. Development and clinical significance of a diagnostic assay on the PCR for detection of human cytomegalovirus DNA in blood samples from immunocompromised patients. J Clin Microbiol, 1992, 30:527-530.
7 Delgado R, Lumbreras C， Alba C， et al. Low predictive value of PCR for diagnosis of cytomegalovirus disease in liver transplant reciplents. J Clin Microbiol, 1992, 30:1876-1880.
(收稿：1997-01-27 修回：1997-11-21), 百拇医药
单位：杭州，310003 浙江医科大学儿童医院(尚世强，洪文澜，余钟声，俞锡林，潘存梅)，妇产科医院(石一复，顾佩宝)
关键词：聚合酶链反应；巨细胞病毒感染；DNA限制酶类
C:\rrx\zhfckzz3\FC3A2.htm 【摘要】 目的 评价套式聚合酶链反应技术(NT-PCR)加限制酶分析在孕妇与胎儿人巨细胞病毒(HCMV)感染检测中的应用价值。方法 应用NT-PCR及限制酶分析、病毒分离、电镜观察和特异性抗体测定，对各孕期孕妇367例的外周血、部分孕妇脐血及死胎组织进行HCMV检测。结果 孕早、中、晚期HCMV阳性检出率分别为8.6%、1.6%及7.0%，NT-PCR检出率(4.9%)高于病毒分离(3.0%，P<0.025)。6份HCMV DNA阳性母血中，3份配对脐血HCMV DNA也阳性。其中2对NT-PCR、病毒分离及特异性IgM、IgA均阳性，1对NT-PCR、病毒分离、特异性IgA阳性，而IgM阴性。28例死胎组织中，发现1例死胎肺组织HCMV DNA阳性。结论 NT-PCR能提高诊断HCMV感染的特异性与敏感性。
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Detection of Human Cytomegalovirus Infection in Pregnant Women and Their Fetuses by Nested Polymerase Chain Reaction Shang Shiqiang*, Hong Wenlan*, Shi Yifu, et al. *Children′s Hospital of Zhejiang Medical University, Hangzhou 310003
【Abstract】 Objectives To evaluate the applicability of nested polymerase chain reaction (PCR) and restriction endonucleases analyses (REA) for the diagnosis of human cytomegalovirus (HCMV) in pregnant women and their fetuses. Methods Nested PCR and REA, virus isolation, anti-HCMV-IgM and anti-HCMV-IgA were used for detection of HCMV in peripheral blood of pregnant women, umbilical blood and tissues of stillbirths. Results among 367 pregnant women, the HCMV infections rate in the first, second and third trimester of gestation were 8.6%, 1.6% and 7.0%, respectively. The nested PCR had significantly higher detective rate (4.9%) than that of virus isolation (3.0%, P<0.025). Among 6 samples of maternal HCMV DNA positive blood, 3 matched umbilical samples were HCMV DNA positive as well. Of these 3 cases, HCMV intrauterine infection was considered. HCMV was detected with all measurements in both maternal and umbilical blood except in 1 paired samples specific-IgM were negative. HCMV DNA was found in the lung tissue of one of the 28 stillbirths. Conclusion the diagnostic specificity and sensitivity of HCMV can be raised by nested PCR.
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【Key words】 Polymerase chain reaction Cytomegalovirus infections DNA restriction enzymes
人巨细胞病毒(HCMV)是先天性病毒感染中最主要的病原，我国先天性HCMV感染率达0.5%～0.8%，严重影响优生优育。近年来，套式聚合酶链反应技术(NT-PCR)已用于HCMV的早期诊断，使得临床上能早期、快速地发现HCMV宫内感染。但PCR存在假阳性及非特异性条带的干扰等问题。为克服上述缺点，我们自行设计并建立了NT-PCR加限制酶分析方法。通过检测孕妇外周血、脐血、死胎内脏HCMV DNA，并与病毒分离、电镜观察、特异性IgM及IgA检测结果相对照，取得较好结果。现报道如下。
材料与方法
一、病毒与细胞来源
HCMV AD 169及Davis标准毒株、单纯疱疹病毒(HSV)Ⅰ型及Ⅱ型及人胚肺二倍体(HF)细胞由安徽医科大学微生物教研室提供。EB病毒(EBV)和正常人基因组DNA由中国预防医学科学院病毒所提供。
, http://www.100md.com
二、标本采集
1993年3月～1995年4月，在浙江医科大学妇产科医院共收集了367例孕6～42周的孕妇外周血，其中114例孕34～42周妇女在分娩时抽取脐带血(母-脐配对血)，每份5 ml。在此期间，收集到流产、死胎28例，分别取其心、脑、肝、肾、肺、眼等组织。所有标本均在4℃冰箱保存，12小时内处理。
三、NT-PCR检测方法
1.引物设计与合成：引物选自HCMV保守序列直接早期抗原(IEA)基因内，经计算机软件辅助设计，上海细胞生物所381型仪合成。外引物序列为PA1 5′-TGCAACGAGAACCCCGAGAA-3′，PA2 5′-ATCAATGTGCGTGAGCACCT-3′，内引物序列为PB1 5′-CTGAGGATAAGCGGGAGATG-3′，PB2 5′-CACTGAGGCAAGTTCTGCAG-3′。最后所得的244bp DNA片段内含3个内切酶Pst I酶切位点，经PstI酶切后，可得到91、116、22及15bp长度的4个DNA片段来验证其序列的正确性。
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2.对照设计：阳性对照用HCMV AD169株及Davis株，阴性对照用HSV Ⅰ型与Ⅱ型、EBV、HF细胞和正常人基因组DNA。病毒及HF细胞DNA提取参考Vonsosover方法[1]。
3.标本DNA抽提：人外周血白细胞DNA制备：取200 μl抗凝血，用0.87%NH4Cl反复处理去红细胞，加1×PCR缓冲液(含10 mmol/L TrisCl) pH 8.3，50 mmol/L KCl，2 mmol/L MgCl2，0.01%明胶)，蛋白酶K，0.45% Nonidet P40和0.45%吐温，待细胞完全裂解，沸水浴10分钟后取上清液备用。组织细胞DNA制备：取少许组织块，生理盐水洗涤1次，无菌条件下轻碾成匀浆，加1×PCR缓冲液，余同白细胞抽提。
4.NT-PCR扩增与限制酶分析：方法见参考文献[2]。
, 百拇医药 四、血清抗 HCMV IgM和抗 HCMV IgA检测与病毒分离
方法见参考文献[2]。
五、电镜观察
取病毒分离培养液，经低速离心，去上清，用1%戊二醛及1%蛾酸作双固定，用Epon812环氧树脂包埋，在LKB超薄切片机上切片，再经铀及铅片染色，然后在Philips EM410透射电镜上观察HCMV病毒颗粒及细胞病变。
结果
一、NT-PCR扩增HCMV DNA的准确性
NT-PCR扩增HCMV AD169株及Davis株DNA，经电泳在相当于244bp处均可见一条DNA带，用HSV Ⅰ型与Ⅱ型、EBV、HF细胞及正常人DNA模板扩增，未见阳性区带。取HDMV AD169株所抽提的DNA作模板，1∶10定量稀释，一次性PCR最小检出量为100fg DNA，NT-PCR最小检出量为10 fg。对HCMV AD169株及Davis株DNA经NT-PCR扩增后，进行PstⅠ酶切分析，产生两条特定分子量的DNA片段，经计算分别为116 bp及91 bp。其中22 bp及15 bp两条DNA带因分子量过小而未能检出。
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二、孕妇与胎儿HCMV检测结果
367例孕早、中、晚期妇女HCMV阳性检出率分别为8.6%，1.6%及7.0%。经NT-PCR检测，共有18名HCMV DNA阳性，阳性率为4.9%，而病毒分离、特异性IgM及IgA阳性率分别为3.0%、1.1%及2.5%，NT-PCR阳性检出率高于病毒分离等其它方法(附表)，经配对计数资料检验差异有显著性(χ2=5.14，P<0.025)。部分病毒分离阳性标本经电镜观察，在感染的成纤维细胞内见HDMV颗粒(附图)以及胞内病变。
附表 不同孕期孕妇HCMV检测结果(例次) 孕期
总例数
HCMV阳性
NT-PCR
病毒分离
, 百拇医药
IgM
IgA
早期
58
5
4
1
2
中期
123
1
1
0
1
, 百拇医药
晚期
186
12
6
3
5
合计
367
18
11
4
8
114份母-脐配对血中，因标本不符合要求等原因，实测母亲外周血标本109份，脐血105份，因此母-脐血配对血共105份。这105份母-脐配对血中，6份母血HCMV阳性，配对脐血阳性3份，母-儿传播率为3/6。3份母-脐血NT-PCR DNA阳性者中，2份母-脐血标本病毒分离、特异性IgM及IgA均阳性，1份母-脐血标本病毒分离、特异性IgA为阳性，但IgM阴性。未见单独NT-PCR阳性而其它方法阴性的母-儿宫内传播情况。
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对28份流产、死胎的内脏标本检测HCMV DNA，结果表明，1份死胎肺组织HCMV DNA阳性，其母亲外周血检测结果显示NT-PCR、病毒分离均阳性，特异性IgM、IgA阴性。
讨论
一、NT-PCR加限制酶分析方法的先进性
HCMV感染极为普遍，因人群不同，感染后结果大不相同。一般人群多数为隐性感染，但孕妇HCMV原发感染或激活再发感染可将HCMV传播至胎儿，造成胎儿或新生儿严重的巨细胞包涵体病或神经系统后遗症。迄今尚缺乏防治HCMV感染的有效措施。有报道，疫苗加免疫佐剂在小白鼠体内能产生有效的抗HCMV抗体[3]，但人体内疫苗试验结果欠佳[4]。国外研制的ganciclovir对HCMV感染疗效虽可，但停药后复发率高，且已有耐ganciclovir的变异毒株报道[5]。因此，减少HCMV感染儿出生的重点在于早期诊断先天性HCMV感染。PCR技术是近几年发展起来的一种简便、快速的诊断手段，它已应用于HCMV感染的诸多领域。随着该方法的不断应用，暴露了该方法的某些不足，如判断结果时背景模糊，常有非特异性条带干扰，以及外源性DNA污染造成假阳性等。我们于1990年～1992年期间对我院0～5岁健康体检儿童及内科住院患者进行了血清学HCMV检测，并对部分儿童采用PCR检测HCMV DNA，发现有些标本HCMV DNA阳性结果微弱，经EB染色后难以判断，且有假阳性的可能。为克服上述缺点，我们在IEA基因内，自行设计了两对引物，建立了NT-PCR技术，并使最终扩增产物可进一步酶切分析。经实验证明NT-PCR敏感性优于一次性PCR，阳性结果清晰，未见有非特异性DNA污染，表明有较高的准确性，检测所需时间也短，1天内即可完成。
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二、NT-PCR提高HCMV DNA检测的准确性
在临床实际检测中，NT-PCR阳性率高于病毒分离等其它方法，说明NT-PCR可以检出其它方法无法查到的HCMV。有报道，单独PCR方法检测HCMV DNA阳性在肝移植及免疫缺陷患者身上并无太大的临床意义，因为它并不能解释HCMV激活感染的危险程度[5～7]。但对于孕妇，在妊娠期间若查到HCMV DNA，可作为一项HCMV监控指标，重点随防，及时发现HCMV母-儿传播的情况。至于胎儿或新生儿，因不存在HCMV继发或激活感染情况，若脐血NT-PCR检测HCMV DNA阳性，则可认为母-儿宫内传播HCMV。本研究进一步用NT-PCR检测了28份死胎内脏的HCMV基因，还发现1例胎儿肺组织HCMV DNA阳性，从而也支持了HCMV可穿透胎盘至胎儿宫内感染，为HCMV感染致流产、死胎提供了较有力的依据。因此，NT-PCR在提高HCMV检测的敏感性及特异性方面有其重要的临床意义。
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附图 感染的成纤维细胞内见巨细胞病毒颗粒(箭头所示)。电镜×62500
参考文献
1 Vonsosover A. Detection of CMV in urine: comparison between DNA-DNA hybridization, virus isolation and immuno-election microscopy, J Virus Meth， 1987, 16:29-37.
2 尚世强，洪文澜，石一复，等.孕妇巨细胞病毒、弓形虫感染及其可能导致宫内的传播.中华传染病杂志，1996，14：152-155.
3 Britt W, Fay J. Formulation of an immunogenic human cytomegalovirus vaccine: responses in mice. J Infect Dis, 1995, 171:18-25.
, 百拇医药
4 Adler SP， Starr SE, Plotkin SA, et al. Immunity induced by primary among women of children-bearing age. J Infect Dis, 1995, 171:26-34.
5 Drouet F, Colimo R, Micheason S, et al. Monitoring levels of human cytomegalovirus DNA blood after liver transplantation. J Clin Microbiol, 1995, 33:389-394.
6 Zipeto D, Revello MG, Silini E, et al. Development and clinical significance of a diagnostic assay on the PCR for detection of human cytomegalovirus DNA in blood samples from immunocompromised patients. J Clin Microbiol, 1992, 30:527-530.
7 Delgado R, Lumbreras C， Alba C， et al. Low predictive value of PCR for diagnosis of cytomegalovirus disease in liver transplant reciplents. J Clin Microbiol, 1992, 30:1876-1880.
(收稿：1997-01-27 修回：1997-11-21), 百拇医药