人巨细胞病毒感染与先天性畸形关系的探讨
作者：卢彦平 翁霞云 谷志远 宋海静 赵海潞 刘爽 曾木英
单位：100853 北京，解放军总医院妇产科(卢彦平，翁霞云)，分子生物室(谷志远，宋海静，刘爽)，病理科(赵海潞，曾木英)
关键词：巨细胞病毒感染；畸形；聚合酶链反应；原位杂交
C:\rrx\zhfckzz3\FC3A1.htm 【摘要】 目的 探讨人巨细胞病毒(HCMV)宫内感染与先天性畸形的关系，并确定巨细胞病毒感染的组织细胞类型。方法 利用聚合酶链反应(PCR)技术，对近8年来我院尸检畸形儿41例(畸形组)及同期尸检非畸形儿19例(对照组)进行了主要脏器的HCMV检测，对部分PCR阳性的组织标本，用原位杂交技术(ISH)确定HCMV易感组织细胞类型。结果 畸形组HCMV阳性率为46.34%(19/41)，对照组阳性率为5.26%(1/19)，两者相比差异有显著性；畸形组中HCMV脏器阳性率为20.46%(35/171)，而对照组仅有1份肺组织呈HCMV阳性，阳性率为1.28%(1/78)，两者相比差异有极显著性；HCMV感染在消化系统畸形中更多见，但各系统畸形阳性率差异无显著性；畸形儿脑组织中HCMV阳性率最高(41.38%，12/29)，与其他组织相比，差异有显著性；PCR阳性的17份标本中仅6份ISH阳性，位于脑组织的神经元细胞、神经胶质细胞、肾小管上皮细胞及部分间质细胞、肺上皮细胞等。结论 HCMV宫内感染与先天性畸形密切相关；脑是HCMV最易侵犯的器官；PCR与ISH结合用于HCMV的诊断，既敏感，又能够进行组织细胞定位。
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Human Cytomegalovirus Infection and Congenital Malformation Lu Yanping, Weng Xiayun, Gu Zhiyuan, et al. The General Hospital of PLA, Beijing 100853
【Abstract】 Objective To study the relationship between intrauterine cytomegalovirus (HCMV) infection and congenital malformation, and to determine the distribution of tissues infected. Methods Autopsy samples of 41 infants with congenital malformation and 19 infants with normal appearances were studied. Using polymerase chain reaction (PCR) technique the paraffin embedded specimens of main organs were examined for HCMV infection. In-situ hybridization (ISH) was performed in some of the PCR positive tissues in order to define the distribution of HCMV DNA. Results 19 of the 41 infants (46.34%) with congenital defects were HCMV positive, while 1 in 19 (5.26%) were positive in the control group, and there was significant difference between the 2 groups (P<0.05). 20.46% (35/171) of the fetal organ samples were HCMV DNA positive in the malformation group, but only 1 out of 78 samples (1.28%) was positive in the pulmonary tissue of the control group. More malformations of the digestive system were presented in HCMV infected babies but no statistical significant difference when compared with other systems. Brain tissue had the highest HCMV infection rates (41.37%, 12/29), which was significantly higher than other organs. By ISH technique HCMV DNA was found only in 6 out of 17 PCR positive samples, and they were located at neurons, neurogliocytes, epithelium and interstitial cells of the kidney, and epithelial cells of pulmonary alveolar. Conclusion There are strong correlation between HCMV infection and congenital malformation, and brain is more susceptible to HCMV. By combining PCR and ISH, both sensitivity and distribution of HCMV could be obtained.
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【Key words】 Cytomegalovirus infections Abnormalities Polymerase chain reaction
In situ hybridization
人巨细胞病毒(HCMV)在人群中感染极为普遍。发达国家孕妇HCMV感染率在50%以上[1，2]，我国多数学者报道孕妇HCMV感染率为90%以上[3，4]。孕妇原发感染和继发感染均可引起胎儿的先天性感染[5，6]，宫内HCMV感染可引起流产、早产、死胎、胎儿宫内发育迟缓及迟发的智力低下，视力、听力损害等后遗症，有关HCMV致畸的问题，研究结果不一，这可能与畸形儿出生数目以及研究方法的局限性有关。我们利用聚合酶链反应(PCR)技术，检测了8年间我院尸检的先天畸形脏器HCMV感染情况，并利用原位杂交技术(in situ hybridization, ISH)对PCR阳性的标本进行原位杂交，以确定易感细胞类型。现将结果报道如下。
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材料和方法
一、材料与分组
1.畸形组：1987年7月至1995年7月，我院尸检的先天性畸形儿，除外组织明显自溶的病例，共41例，尸检病理组织学检查均未见巨细胞包涵体。其中19例因畸形引产，16例系新生儿死亡(产后存活数分钟到11天)，4例死胎，晚期流产及早产各1例。男23例，女18例。孕期分布：胎龄<28周者7例，28～37周者17例，≥37周者17例。
2.对照组：选择同期无畸形尸检死婴共19例。其中10例死于羊水吸入窒息，2例为颅内出血，4例为自愿终止妊娠，3例为早产儿。男10例，女9例。孕期分布：胎龄<28周者4例，28～37周者7例，≥37周者8例。
二、方法
1.组织DNA的提取：取每例尸检婴儿经常规福马林固定、石蜡包埋的脑、肝、脾、肺、肾脏器的病理标本，制取5 μm厚的组织切片2～4片，采用常规的酚-氯仿抽提DNA，无水乙醇沉淀DNA的方法[7]，抽提DNA，将其自然干燥后用50 μl TE(10 mmol Tris-HCl，1 mmol 乙二胺四乙酸，pH 8.0)混悬DNA，取5 μl用于PCR扩增。
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2.PCR扩增：反应体积20 μl。一对引物(由本院分子生物室合成)终浓度为20 pmol，Taq酶1 U，4种dNTP均为250 μmol(购自华美生物工程公司)，在PE-480型DNA扩增仪上共进行35个循环。取10 μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外分析仪下观察特异的DNA条带并拍照。扩增片段长240 bp。每次扩增均设标准阳性对照及阴性对照。
3.原位杂交：选取PCR检测HCMV阳性的石蜡包埋组织标本共17份，用于ISH。HCMV探针为载有HCMV AD 169株Hind Ⅲ-E DNA片段的pH C79质粒，酶切回收获得的HCMV-DNA片段，利用光敏生物素进行探针标记(试剂盒购自军事医学科学院)。按参照文献[8]进行。主要步骤为组织切片的预处理，二甲苯脱蜡，不同浓度的乙醇水化，0.2 mol HCl室温下作用10分钟，4℃预冷的冰醋酸处理15秒，1 mg/L的蛋白酶K 37℃下消化15分钟，0.2%甘氨酸浸洗，4%多聚甲醛室温下固定5分钟，乙醇脱水待进行杂交。将配制好的杂交液(含光标探针20 mg/L)，滴加在组织上，无菌盖玻片覆盖，置湿盒中，94℃～96℃变性10分钟，取出反应盒，立即置于冰水中冷却15分钟，而后转入42℃温箱中杂交过夜。取出组织切片充分洗涤，2%BSA封闭30分钟，亲和素-碱性磷酸酶作用40分钟，充分洗涤后加底物显色液NBT、BCIP，室温避光显色30分钟左右，柠檬酸缓冲液终止反应。封片后显微镜下判断结果。每次实验均设标准阳性对照及阴性对照，以出现紫蓝色颗粒状沉淀者为阳性。
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结果
一、畸形组与对照组HCMV感染比较
畸形组41例，共检测标本171份；对照组19例，共检测标本78份。以5个脏器中有1个或1个以上出现PCR扩增阳性者判为HCMV阳性病例。畸形组阳性率为46.34%；对照组阳性率为5.26%，两组相比差异有显著性(χ2=9.859 2，P<0.01)。畸形组与对照组脏器HCMV检出情况见表1。
表1 各脏器组织中HCMV检出情况 组织
畸形组
对照组
标本数
阳性数
阳性率(%)
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标本数
阳性数
阳性率(%)
脑
29
12
41.38
12
0
0.00
肝
38
9
, 百拇医药 23.68
18
0
0.00
肺
38
8
21.05
18
1
5.56
肾
36
4
, 百拇医药
11.11
16
0
0.00
脾
30
2
6.67
14
0
0.00
合计
171
, 百拇医药 35
20.46
78
1
1.28
畸形组HCMV阳性的19例中，1个脏器阳性的9例，2、3、4个脏器的阳性例数依次为5例、4例和1例。
二、HCMV感染的脏器分布
畸形组阳性的19例中，共检测标本80份，HCMV DNA阳性的脏器分布见表2。经总χ2方检验(χ2=17.16，P<0.01)，各脏器阳性率差异有显著性。脑组织阳性率最高，与其它各组织相比差异有显著性；而其它各组间差异无显著性，但肝、肺较高，肾次之，脾最低。
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三、畸形种类及其与HCMV感染的关系
根据《人体畸形学》[9]标准将畸形儿分类，各系统畸形及HCMV感染情况见表3。其它包括：膈疝、联体畸形、无脾脏、脐疝、肢体畸形各1例。经统计学处理，各系统畸形差异均无统计学意义。
表2 19例畸形儿脏器中HCMV DNA检测情况 脏器
检测标本数
阳性数
阳性率(%)
脑
14
12
85.71
, 百拇医药
肝
19
9
47.37
肺
17
8
47.06
肾
18
4
22.22
脾
12
, 百拇医药
2
16.67
合计
80
35
43.75
表3 各系统畸形及其HCMV感染情况 畸形种类
总例数
HCMV阳性
例数
百分率(%)
多发
18
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8
47.07
神经系统
5
2
40.00
循环系统
4
2
50.00
泌尿系统
4
2
, 百拇医药 50.00
消化系统
3
2
66.27
体腔积液、水肿儿
2
1
50.00
其它
5
2
40.00
, 百拇医药 合计
41
19
46.34
四、PCR与ISH结果比较
选取17份PCR阳性的组织标本进行ISH检测，脑组织检测6份，3份ISH阳性；肾组织3份中2份阳性；肺组织3份中1份阳性；肝组织检测5份，无一例阳性。与PCR相比，该试验中ISH的敏感性为35.29%。
五、HCMV感染的细胞类型
3例HCMV感染阳性的脑组织发育不成熟，阳性着色见于神经元细胞和神经胶质细胞的胞核(图1)。2例ISH阳性的肾脏，显示肾小管上皮细胞核可见阳性着色，少数间质细胞也呈阳性反应(图2)。肺组织阳性的1例，阳性着色见于肺上皮细胞中。肝脏5例均未见阳性着色。
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讨论
一、HCMV感染与胎儿畸形密切相关
引起胎儿宫内感染的病原体有HCMV、风疹病毒(RV)、弓形体、单纯疱疹病毒及其它一些病毒，简称TORCH综合征。Griffiths等[10]研究表明，孕妇活动性HCMV感染是风疹病毒的2倍，所致危害也比风疹病毒严重。杨威等[11]检测157例畸形儿，其中HCMV-IgM阳性率高达21%，远较其它几种病原体IgM阳性率高。本组结果显示46.34%(19/41)的畸形儿尸检脏器组织中HCMV DNA阳性，与对照组相比，差异有显著性，表明HCMV感染与畸形密切相关。致畸原因很复杂，可由遗传、环境因素或两者相互作用而引起。本组资料中，仅1例孕妇大于35岁，1例家族有畸形史，1例有汞剂及X线接触史，有1例工作中接触铅，另有3例孕早期感冒，其余均未发现明显致畸因素，PCR结果则显示其中有约半数畸形儿脏器中检出HCMV DNA序列。推测在既往不明原因的畸形中，有些可能是无症状的HCMV感染所引起。
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二、脑是HCMV最易感染的器官
本组实验结果显示，脑是HCMV最易侵袭的器官，41.38%的畸形儿脑组织HCMV阳性，在19例HCMV阳性的畸形儿中，检测14份脑组织，阳性者12份，与其它器官检出率相比，差异有统计学意义。过去对先天性巨细胞包涵体病死婴儿的研究中发现，脑、肝、肺是最易受感染的器官，颅内钙盐沉着、脑软化是先天性HCMV感染儿最常见的临床表现。先天性HCMV感染引起的后遗症也是神经系统最为严重。有作者认为，在引起智力低下的因素中，HCMV感染仅次于Down′s综合征[12]。神经系统其它后遗症尚包括粗大运动异常、精神运动异常、感觉神经性耳聋、脉络膜视网膜炎等，这些后遗症可能与HCMV隐匿于神经组织，干扰了正常细胞代谢有关。
三、HCMV感染与畸形种类无明显相关
有关HCMV感染与畸形种类关系的文献报道不一，最常见的为小头畸形，有报道占有症状先天性HCMV感染儿的40%～50%[13]。本组病例未见小头畸形，可能因本组病例多数为致死畸形，出生后短时即死亡有关。有作者认为神经系统畸形与HCMV感染关系密切，马玉燕等[14]检测13例畸形儿脐血IgM，阳性者4例，有脊柱裂、脑积水和无脑儿，均为神经系统畸形。杨锦华等[15]的检测结果也支持神经系统畸形多见。但也有许多作者报道，HCMV感染与消化系统畸形、肾积水等关系密切[16]。本组资料显示，消化系统畸形阳性率稍高，但各系统畸形之间HCMV阳性率差异无显著性。因为是回顾性研究，病例尚少，故HCMV感染与畸形之间的关系有待于大样本前瞻性研究来阐明。
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四、HCMV感染的细胞分布
脑组织的阳性杂交信号见于神经元和神经胶质细胞的胞核，与成人的感染细胞一致。肾组织阳性颗粒见于肾小管上皮细胞和少数间质细胞，细胞形态大小正常。3例肺脏中仅有1例阳性，而且阳性细胞数少，位于肺泡上皮细胞内。共检测了5例肝组织，无一例阳性，考虑可能与肝细胞中病毒拷贝数低或者是因为肝脏中各种核酸酶很活跃，DNA极易降解有关。总之，HCMV感染细胞类型与巨细胞包涵体时相一致。
PCR技术是利用体外DNA聚合酶，将特异的DNA片段通过变性—复性—延伸3个步骤的循环，使模板DNA以指数级扩增，由于其灵敏度高、特异性好，得到了广泛的应用。一般认为，粗提DNA即可满足需要，但石蜡包埋福马林固定的标本仅粗提DNA，其中有些杂质可能对Taq酶起抑制作用[17]，故我们采用酚-氯仿抽提DNA的方法，获得了较纯净的DNA，单次PCR循环即取得了较好结果。ISH是在不破坏细胞结构的条件下，利用标记好的探针与组织细胞内互补的DNA结合，从而可用于病毒的组织细胞定位。PCR和ISH的结合使用，既敏感，又可精确定位，取得了较理想的结果。
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图1 脑组织发育不成熟，有细胞间隙水肿，神经元细胞核紫蓝色颗粒沉着。原位杂交×200
图2 肾小管小皮细胞及间质细胞可见阳性着色。原位杂交×200
参考文献
1 Tookey PA, Ades AE, Peckham CS. Cytomegalovirus prevalence in pregnant women: the influence of parity. Arch Dis Child, 1992, 67:779-783.
2 Lamy ME, Mulong KN, Gadisseux JF, et al. Prenatal diagnosis of fetal cytomegalovirus infection. Am J Obstet Gynecol, 1992, 166:91-94.
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3 乐杰，周吉海，付艳，等.长春地区产妇三种病毒感染血清流行病学调查.中华妇产科杂志，1990，25：269-271.
4 倪安平，孙念怙.妊娠妇女巨细胞病毒感染对胎儿的影响.中华妇产科杂志，1989，24：162-163.
5 Fouler KB, Stagno S, Pass R, et al. The outcome of congenital cytomegalovirus infection in relation to maternal antibody status. N Engl J Med, 1992, 326:663-667.
6 刘佩莉，陆嘉良，江峰.孕妇巨细胞病毒感染与胎儿先天畸形.中国公共卫生学报，1992，11：163-165.
7 林万明主编.核酸探针杂交实验技术.北京：中国科学技术出版社，1991.9-15.
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8 苏慧慈编.原位杂交.北京：中国科学技术出版社，1994.59-84.
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10 Griffiths PD, Baboonian C. A prospective study of primary cytomegalovirus infection during pregnancy: final report. Br J Obstet Gynecol, 1984, 9:65-67.
11 杨威，吕绳敏，刘兰青，等.先天性畸形TORCH感染的血清学研究.中华儿科杂志，1991，29：362-363.
12 Griffiths PD. Current management of cytomegalovirus disease. J Med Virol, 1993, 41(Suppl)： 106-111.
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13 Ramsav MEB, Miller E, Speckham C. Outcome of confirmed symptomatic congenital cytomegalovirus infection. Arch Dis Child, 1991, 66:1068-1069.
14 马玉燕，江森，陈菊芬.孕妇与胎儿巨细胞病毒感染的血清学研究.现代妇产科进展，1994，3：19-22.
15 杨锦华，刘铁夫，余秀葵，等.先天畸形与TORCH感染关系的研究.中华妇产科杂志，1995，30：486-488.
16 王练英，吕绳敏，刘兰青，等.消化道畸形与巨细胞病毒感染.实用儿科临床杂志，1992，7：141.
17 林万明主编.PCR技术操作和应用指南.北京：人民军医出版社，1993.31-38.
(收稿：1997-04-26 修回：1997-12-24), http://www.100md.com
单位：100853 北京，解放军总医院妇产科(卢彦平，翁霞云)，分子生物室(谷志远，宋海静，刘爽)，病理科(赵海潞，曾木英)
关键词：巨细胞病毒感染；畸形；聚合酶链反应；原位杂交
C:\rrx\zhfckzz3\FC3A1.htm 【摘要】 目的 探讨人巨细胞病毒(HCMV)宫内感染与先天性畸形的关系，并确定巨细胞病毒感染的组织细胞类型。方法 利用聚合酶链反应(PCR)技术，对近8年来我院尸检畸形儿41例(畸形组)及同期尸检非畸形儿19例(对照组)进行了主要脏器的HCMV检测，对部分PCR阳性的组织标本，用原位杂交技术(ISH)确定HCMV易感组织细胞类型。结果 畸形组HCMV阳性率为46.34%(19/41)，对照组阳性率为5.26%(1/19)，两者相比差异有显著性；畸形组中HCMV脏器阳性率为20.46%(35/171)，而对照组仅有1份肺组织呈HCMV阳性，阳性率为1.28%(1/78)，两者相比差异有极显著性；HCMV感染在消化系统畸形中更多见，但各系统畸形阳性率差异无显著性；畸形儿脑组织中HCMV阳性率最高(41.38%，12/29)，与其他组织相比，差异有显著性；PCR阳性的17份标本中仅6份ISH阳性，位于脑组织的神经元细胞、神经胶质细胞、肾小管上皮细胞及部分间质细胞、肺上皮细胞等。结论 HCMV宫内感染与先天性畸形密切相关；脑是HCMV最易侵犯的器官；PCR与ISH结合用于HCMV的诊断，既敏感，又能够进行组织细胞定位。
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Human Cytomegalovirus Infection and Congenital Malformation Lu Yanping, Weng Xiayun, Gu Zhiyuan, et al. The General Hospital of PLA, Beijing 100853
【Abstract】 Objective To study the relationship between intrauterine cytomegalovirus (HCMV) infection and congenital malformation, and to determine the distribution of tissues infected. Methods Autopsy samples of 41 infants with congenital malformation and 19 infants with normal appearances were studied. Using polymerase chain reaction (PCR) technique the paraffin embedded specimens of main organs were examined for HCMV infection. In-situ hybridization (ISH) was performed in some of the PCR positive tissues in order to define the distribution of HCMV DNA. Results 19 of the 41 infants (46.34%) with congenital defects were HCMV positive, while 1 in 19 (5.26%) were positive in the control group, and there was significant difference between the 2 groups (P<0.05). 20.46% (35/171) of the fetal organ samples were HCMV DNA positive in the malformation group, but only 1 out of 78 samples (1.28%) was positive in the pulmonary tissue of the control group. More malformations of the digestive system were presented in HCMV infected babies but no statistical significant difference when compared with other systems. Brain tissue had the highest HCMV infection rates (41.37%, 12/29), which was significantly higher than other organs. By ISH technique HCMV DNA was found only in 6 out of 17 PCR positive samples, and they were located at neurons, neurogliocytes, epithelium and interstitial cells of the kidney, and epithelial cells of pulmonary alveolar. Conclusion There are strong correlation between HCMV infection and congenital malformation, and brain is more susceptible to HCMV. By combining PCR and ISH, both sensitivity and distribution of HCMV could be obtained.
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【Key words】 Cytomegalovirus infections Abnormalities Polymerase chain reaction
In situ hybridization
人巨细胞病毒(HCMV)在人群中感染极为普遍。发达国家孕妇HCMV感染率在50%以上[1，2]，我国多数学者报道孕妇HCMV感染率为90%以上[3，4]。孕妇原发感染和继发感染均可引起胎儿的先天性感染[5，6]，宫内HCMV感染可引起流产、早产、死胎、胎儿宫内发育迟缓及迟发的智力低下，视力、听力损害等后遗症，有关HCMV致畸的问题，研究结果不一，这可能与畸形儿出生数目以及研究方法的局限性有关。我们利用聚合酶链反应(PCR)技术，检测了8年间我院尸检的先天畸形脏器HCMV感染情况，并利用原位杂交技术(in situ hybridization, ISH)对PCR阳性的标本进行原位杂交，以确定易感细胞类型。现将结果报道如下。
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材料和方法
一、材料与分组
1.畸形组：1987年7月至1995年7月，我院尸检的先天性畸形儿，除外组织明显自溶的病例，共41例，尸检病理组织学检查均未见巨细胞包涵体。其中19例因畸形引产，16例系新生儿死亡(产后存活数分钟到11天)，4例死胎，晚期流产及早产各1例。男23例，女18例。孕期分布：胎龄<28周者7例，28～37周者17例，≥37周者17例。
2.对照组：选择同期无畸形尸检死婴共19例。其中10例死于羊水吸入窒息，2例为颅内出血，4例为自愿终止妊娠，3例为早产儿。男10例，女9例。孕期分布：胎龄<28周者4例，28～37周者7例，≥37周者8例。
二、方法
1.组织DNA的提取：取每例尸检婴儿经常规福马林固定、石蜡包埋的脑、肝、脾、肺、肾脏器的病理标本，制取5 μm厚的组织切片2～4片，采用常规的酚-氯仿抽提DNA，无水乙醇沉淀DNA的方法[7]，抽提DNA，将其自然干燥后用50 μl TE(10 mmol Tris-HCl，1 mmol 乙二胺四乙酸，pH 8.0)混悬DNA，取5 μl用于PCR扩增。
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2.PCR扩增：反应体积20 μl。一对引物(由本院分子生物室合成)终浓度为20 pmol，Taq酶1 U，4种dNTP均为250 μmol(购自华美生物工程公司)，在PE-480型DNA扩增仪上共进行35个循环。取10 μl扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，紫外分析仪下观察特异的DNA条带并拍照。扩增片段长240 bp。每次扩增均设标准阳性对照及阴性对照。
3.原位杂交：选取PCR检测HCMV阳性的石蜡包埋组织标本共17份，用于ISH。HCMV探针为载有HCMV AD 169株Hind Ⅲ-E DNA片段的pH C79质粒，酶切回收获得的HCMV-DNA片段，利用光敏生物素进行探针标记(试剂盒购自军事医学科学院)。按参照文献[8]进行。主要步骤为组织切片的预处理，二甲苯脱蜡，不同浓度的乙醇水化，0.2 mol HCl室温下作用10分钟，4℃预冷的冰醋酸处理15秒，1 mg/L的蛋白酶K 37℃下消化15分钟，0.2%甘氨酸浸洗，4%多聚甲醛室温下固定5分钟，乙醇脱水待进行杂交。将配制好的杂交液(含光标探针20 mg/L)，滴加在组织上，无菌盖玻片覆盖，置湿盒中，94℃～96℃变性10分钟，取出反应盒，立即置于冰水中冷却15分钟，而后转入42℃温箱中杂交过夜。取出组织切片充分洗涤，2%BSA封闭30分钟，亲和素-碱性磷酸酶作用40分钟，充分洗涤后加底物显色液NBT、BCIP，室温避光显色30分钟左右，柠檬酸缓冲液终止反应。封片后显微镜下判断结果。每次实验均设标准阳性对照及阴性对照，以出现紫蓝色颗粒状沉淀者为阳性。
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结果
一、畸形组与对照组HCMV感染比较
畸形组41例，共检测标本171份；对照组19例，共检测标本78份。以5个脏器中有1个或1个以上出现PCR扩增阳性者判为HCMV阳性病例。畸形组阳性率为46.34%；对照组阳性率为5.26%，两组相比差异有显著性(χ2=9.859 2，P<0.01)。畸形组与对照组脏器HCMV检出情况见表1。
表1 各脏器组织中HCMV检出情况 组织
畸形组
对照组
标本数
阳性数
阳性率(%)
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标本数
阳性数
阳性率(%)
脑
29
12
41.38
12
0
0.00
肝
38
9
, 百拇医药 23.68
18
0
0.00
肺
38
8
21.05
18
1
5.56
肾
36
4
, 百拇医药
11.11
16
0
0.00
脾
30
2
6.67
14
0
0.00
合计
171
, 百拇医药 35
20.46
78
1
1.28
畸形组HCMV阳性的19例中，1个脏器阳性的9例，2、3、4个脏器的阳性例数依次为5例、4例和1例。
二、HCMV感染的脏器分布
畸形组阳性的19例中，共检测标本80份，HCMV DNA阳性的脏器分布见表2。经总χ2方检验(χ2=17.16，P<0.01)，各脏器阳性率差异有显著性。脑组织阳性率最高，与其它各组织相比差异有显著性；而其它各组间差异无显著性，但肝、肺较高，肾次之，脾最低。
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三、畸形种类及其与HCMV感染的关系
根据《人体畸形学》[9]标准将畸形儿分类，各系统畸形及HCMV感染情况见表3。其它包括：膈疝、联体畸形、无脾脏、脐疝、肢体畸形各1例。经统计学处理，各系统畸形差异均无统计学意义。
表2 19例畸形儿脏器中HCMV DNA检测情况 脏器
检测标本数
阳性数
阳性率(%)
脑
14
12
85.71
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肝
19
9
47.37
肺
17
8
47.06
肾
18
4
22.22
脾
12
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2
16.67
合计
80
35
43.75
表3 各系统畸形及其HCMV感染情况 畸形种类
总例数
HCMV阳性
例数
百分率(%)
多发
18
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8
47.07
神经系统
5
2
40.00
循环系统
4
2
50.00
泌尿系统
4
2
, 百拇医药 50.00
消化系统
3
2
66.27
体腔积液、水肿儿
2
1
50.00
其它
5
2
40.00
, 百拇医药 合计
41
19
46.34
四、PCR与ISH结果比较
选取17份PCR阳性的组织标本进行ISH检测，脑组织检测6份，3份ISH阳性；肾组织3份中2份阳性；肺组织3份中1份阳性；肝组织检测5份，无一例阳性。与PCR相比，该试验中ISH的敏感性为35.29%。
五、HCMV感染的细胞类型
3例HCMV感染阳性的脑组织发育不成熟，阳性着色见于神经元细胞和神经胶质细胞的胞核(图1)。2例ISH阳性的肾脏，显示肾小管上皮细胞核可见阳性着色，少数间质细胞也呈阳性反应(图2)。肺组织阳性的1例，阳性着色见于肺上皮细胞中。肝脏5例均未见阳性着色。
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讨论
一、HCMV感染与胎儿畸形密切相关
引起胎儿宫内感染的病原体有HCMV、风疹病毒(RV)、弓形体、单纯疱疹病毒及其它一些病毒，简称TORCH综合征。Griffiths等[10]研究表明，孕妇活动性HCMV感染是风疹病毒的2倍，所致危害也比风疹病毒严重。杨威等[11]检测157例畸形儿，其中HCMV-IgM阳性率高达21%，远较其它几种病原体IgM阳性率高。本组结果显示46.34%(19/41)的畸形儿尸检脏器组织中HCMV DNA阳性，与对照组相比，差异有显著性，表明HCMV感染与畸形密切相关。致畸原因很复杂，可由遗传、环境因素或两者相互作用而引起。本组资料中，仅1例孕妇大于35岁，1例家族有畸形史，1例有汞剂及X线接触史，有1例工作中接触铅，另有3例孕早期感冒，其余均未发现明显致畸因素，PCR结果则显示其中有约半数畸形儿脏器中检出HCMV DNA序列。推测在既往不明原因的畸形中，有些可能是无症状的HCMV感染所引起。
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二、脑是HCMV最易感染的器官
本组实验结果显示，脑是HCMV最易侵袭的器官，41.38%的畸形儿脑组织HCMV阳性，在19例HCMV阳性的畸形儿中，检测14份脑组织，阳性者12份，与其它器官检出率相比，差异有统计学意义。过去对先天性巨细胞包涵体病死婴儿的研究中发现，脑、肝、肺是最易受感染的器官，颅内钙盐沉着、脑软化是先天性HCMV感染儿最常见的临床表现。先天性HCMV感染引起的后遗症也是神经系统最为严重。有作者认为，在引起智力低下的因素中，HCMV感染仅次于Down′s综合征[12]。神经系统其它后遗症尚包括粗大运动异常、精神运动异常、感觉神经性耳聋、脉络膜视网膜炎等，这些后遗症可能与HCMV隐匿于神经组织，干扰了正常细胞代谢有关。
三、HCMV感染与畸形种类无明显相关
有关HCMV感染与畸形种类关系的文献报道不一，最常见的为小头畸形，有报道占有症状先天性HCMV感染儿的40%～50%[13]。本组病例未见小头畸形，可能因本组病例多数为致死畸形，出生后短时即死亡有关。有作者认为神经系统畸形与HCMV感染关系密切，马玉燕等[14]检测13例畸形儿脐血IgM，阳性者4例，有脊柱裂、脑积水和无脑儿，均为神经系统畸形。杨锦华等[15]的检测结果也支持神经系统畸形多见。但也有许多作者报道，HCMV感染与消化系统畸形、肾积水等关系密切[16]。本组资料显示，消化系统畸形阳性率稍高，但各系统畸形之间HCMV阳性率差异无显著性。因为是回顾性研究，病例尚少，故HCMV感染与畸形之间的关系有待于大样本前瞻性研究来阐明。
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四、HCMV感染的细胞分布
脑组织的阳性杂交信号见于神经元和神经胶质细胞的胞核，与成人的感染细胞一致。肾组织阳性颗粒见于肾小管上皮细胞和少数间质细胞，细胞形态大小正常。3例肺脏中仅有1例阳性，而且阳性细胞数少，位于肺泡上皮细胞内。共检测了5例肝组织，无一例阳性，考虑可能与肝细胞中病毒拷贝数低或者是因为肝脏中各种核酸酶很活跃，DNA极易降解有关。总之，HCMV感染细胞类型与巨细胞包涵体时相一致。
PCR技术是利用体外DNA聚合酶，将特异的DNA片段通过变性—复性—延伸3个步骤的循环，使模板DNA以指数级扩增，由于其灵敏度高、特异性好，得到了广泛的应用。一般认为，粗提DNA即可满足需要，但石蜡包埋福马林固定的标本仅粗提DNA，其中有些杂质可能对Taq酶起抑制作用[17]，故我们采用酚-氯仿抽提DNA的方法，获得了较纯净的DNA，单次PCR循环即取得了较好结果。ISH是在不破坏细胞结构的条件下，利用标记好的探针与组织细胞内互补的DNA结合，从而可用于病毒的组织细胞定位。PCR和ISH的结合使用，既敏感，又可精确定位，取得了较理想的结果。
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图1 脑组织发育不成熟，有细胞间隙水肿，神经元细胞核紫蓝色颗粒沉着。原位杂交×200
图2 肾小管小皮细胞及间质细胞可见阳性着色。原位杂交×200
参考文献
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17 林万明主编.PCR技术操作和应用指南.北京：人民军医出版社，1993.31-38.
(收稿：1997-04-26 修回：1997-12-24), http://www.100md.com