米非司酮对子宫肌瘤组织中孕激素受体基因表达的影响
作者：孙梅 朱国璋 周丽蓉 张永莲 俞瑾
单位：200011 上海医科大学妇产科医院(孙梅，周丽蓉，俞瑾)；中国科学院上海生物化学研究所分子生物学国家重点实验室(朱国璋，张永莲)
关键词：米非司酮；子宫肿瘤；平滑肌瘤；受体；孕酮；基因表达
中华妇产科杂志980411 【摘要】 目的 研究子宫肌瘤组织中孕激素受体(PR)基因的表达情况，从PR基因的转录及翻译水平探讨米非司酮治疗子宫肌瘤的作用机理。方法 采用Northern印迹法和羟基磷灰石(HAP)单点饱和分析法，分别测定27例单纯手术治疗(单纯手术组)及6例术前口服米非司酮每天25 mg共3个月(米非司酮组)的子宫肌瘤患者的肌瘤瘤心、瘤边缘及子宫体正常肌组织中PR mRNA和PR蛋白。结果 单纯手术组瘤心和瘤边缘中PR mRNA及PR蛋白水平在卵泡期和黄体期均显著高于子宫体肌组织(P<0.01)，呈持续高表达，而瘤心和瘤边缘间差异无显著性(P>0.05)；米非司酮组4例术前未停药者，肌瘤及子宫体肌组织中PR mRNA和PR蛋白水平均明显降低，2例术前停药1月者，上述组织中PR mRNA与单纯手术者相似，但PR蛋白仍处于低水平。结论 子宫肌瘤中PR基因呈持续高表达。米非司酮能抑制PR基因的表达，在mRNA水平上的影响是可逆的，在蛋白水平上的影响持续时间较长。
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Effect of Mifepristone on the Expression of Progesterone Receptor Messenger RNA and Protein in Uterine Leiomyomata Sun Mei, Zhu Guozhang, Zhou Lirong, et al. Obstetrics and Gynecology Hospital, Shanghai Medical University, Shanghai 200011
【Abstract】 Objective To determine the expression of progesterone receptor (PR) mRNA and PR protein levels in the myometrium and leiomyomata from untreated and mifepristone pretreated women with leiomyomataand to examine the mechanism of mifepristone treatment on uterine leiomyomata.Methods Expression of PR mRNA and PR protein were determined by Northern blot and HAP of single-dose saturated analysis in myometrium and leiomyomata (center and marginal area) from 27 untreated and 6 mifepristone pretreated women with leiomyomata.Results PR mRNA abundance and PR protein levels in both myomatous center and marginal area were significantly greater than those in corporal myometrium (P<0.01) in both follicular and luteal phases, but similar between myomatous center and marginal area (P>0.05). 6 cases pretreated with mifepristone 25 mg/day for 3 months were operated, all but one patient displayed a decrease in leiomyomata volume. PR mRNA abundance in both myometruim and leiomyomata (center and marginal area) was significantly decreased in 4 patients continuing mifepristone treatment before the operation but not in the other 2 patients stopping RU486 1 month before operation. PR protein levels in these tissues showed significant decrease in all 6 cases.Conclusion There are overexpression of PRmRNA and PR protein in leiomyomata. One of the mechanism of mifepristone action on decreasing leiomyomata volume may be related to suppression on expression of PR gene. It seems that suppression on transcription of PR gene is reversible, but on translation of PR gene may maintain in a relatively longer period.
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【Key words】 Mifepristone Uterine neoplasms Leiomyoma Receptors, progesterone Gene expression
子宫肌瘤是妇科常见的良性肿瘤，在生育期妇女中发病率约为25%[1]，是导致育龄期妇女行全子宫切除术的主要原因之一[2]。近年来孕激素(P)及其受体(PR)对子宫肌瘤的影响受到重视。研究表明，肌瘤中PR mRNA及PR蛋白表达水平均高于正常肌组织[3]；P可促进肌瘤细胞分裂，刺激肌瘤生长[4，5]。抗P制剂米非司酮可使肌瘤体积显著缩小[6]。但关于米非司酮对子宫肌瘤中PR基因表达的影响迄今未见报道。本研究旨在从子宫肌瘤组织及子宫体正常肌组织中PR mRNA及PR蛋白的表达水平，研究米非司酮治疗子宫肌瘤的作用机理。
资料和方法
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一、研究对象
选自1993年12月至1995年12月间在上海医科大学妇产科医院中西医结合科就诊的33例子宫肌瘤患者，均有不同程度的月经过多、痛经及盆腔包块等临床表现。妇科检查及B超证实为子宫肌瘤，而无其它妇科肿瘤等疾病。所有患者以往月经规则，近3个月内无类固醇激素使用史，肝功能正常。分为两组：单纯手术组27例，平均年龄44.5岁(34～52岁)，18例在卵泡期、9例在黄体期行全子宫切除术，术后病理诊断证实为子宫肌瘤。米非司酮组6例，从月经周期第5天起连续口服米非司酮，每天25 mg，共3个月。所有患者服药后均停经，但无潮热、盗汗、心悸及烦燥等绝经期症状，血中雌、孕激素水平均无明显改变，一直在门诊定期随访。5例患者肌瘤明显缩小，手术原因分别为：1例停药1年后肌瘤长大，于再服米非司酮1月后手术；2例肌瘤较大，米非司酮治疗3个月后手术，其中1例为乳腺癌根治术后，1例服药前后内膜均为增生过长；5例中术前未停药者4例，1例停药1月内手术；另1例服药3个月后肌瘤未见缩小，于停药1月内手术。6例患者术前均未恢复月经。术后子宫内膜组织切片诊断，5例子宫内膜呈增生反应，1例呈分泌反应。6例患者服药前与单纯手术组比较，两组的年龄、子宫大小、子宫肌瘤大小和激素水平差异均无显著性。两组治疗前全身状况差异亦无显著性。
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手术切除的新鲜肌瘤(包括肌瘤的瘤心和瘤边缘)及子宫体正常肌组织立即置液氮中冷冻，并存放于-70℃冰箱，待检。
二、方法
1.总RNA的抽提及Northern印迹法测定PRmRNA：采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法[7]从0.5 g肌瘤组织或子宫体肌组织中抽提总RNA。每份样品取40 mg总RNA在1.2%琼脂糖/17.9%甲醛变性凝胶上电泳。每块凝胶上均用同一标准作对照。将溴乙啶(EB)加到每份样品中以检测28S和18S rRNA强度，用以判定样品RNA的含量和质量。用毛细管洗脱法将RNA转移到尼龙膜(Hybon-Nnylon，美国Amersham公司产品)上，在紫外交联机(Gs Gene Linker U-V Chamber,美国BIO-RAD公司产品)中用紫外线将RNA交联固定于尼龙膜上。用随机引物法标记人PR cDNA(2.4kb，编码区域EcoRI-HindⅢ片段)及小鼠β-actin cDNA(2.0kb)作为探针(比活为5×108cpm/ng)，分别与每块膜于65℃杂交炉(Hybridisation Oven，美国Appligene公司产品)杂交过夜。洗膜后于-70℃放射自显影，用岛津CS-930双波长扫描仪(日本)进行 PR mRNA密度定量。杂交后湿润尼龙膜用洗脱缓冲液(10mmol Tris-Hcl， pH8.0，1mmol EDTA，0.1%SDS)于95℃洗涤30分钟，以除去杂交信号，用于下一次杂交。
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2.组织胞浆蛋白抽提及羟基磷灰石(HAP)单点饱和分析法测定PR含量：将0.5 g上述储存的组织置冰浴中，按1∶6(W/V)于3 ml抽提缓冲液(10mmol Tris-HCl， pH7.5，1mmol二硫苏糖醇，10%甘油，10mmol钼酸钠，1mmol PMSF，0.01μg/ml Bactrasin，0.01μg/ml leupeptin)中剪碎，用组织分散器匀浆，于4℃2 500 r/min离心15分钟，上清液再经超速离心机(Centrikon T-2 080，瑞士Kontron公司产品)超速离心(105 000 r/min 4℃)1小时，上清液即为所抽提的组织胞浆蛋白液，用考马斯亮蓝-250/牛血清白蛋白法测定蛋白量。
在200 μl反应体系中，加入200μg胞浆蛋白与3H-R5020(86.7 Ci/mmol，美国Dupon T公司产品)。反应终浓度为15nmol/ml)反应，非特异性结合由加入100倍的非标记R5020(美国Dupon T公司产品)测得。样品置于4℃孵育16～18小时，加入0.3 ml 60%HAP(上海生化所申华公司)，混匀15分钟，每5分钟振荡1次以吸附结合的3H-R5020-PR复合物，经滤纸负压抽滤，用5 ml洗脱缓冲液(10mmol Tris-HCl， pH8.0，10mmol磷酸二氢钠，1%吐温-80)洗涤3次，抽干，滤纸片及沉淀置5ml 0.4%PPO-popop-二甲苯闪烁液中闪烁计数。
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三、统计学方法
肌瘤与肌组织的比较采用配对t检验，单纯手术组与米非司酮组的比较采用两样本均数比较的t检验。上述分析由SPSS/PC+V3.0软件和LBM PC80 486兼容机进行处理。数据以±s表示。
结果
一、单纯手术组肌瘤及子宫体肌组织PR mRNA及PR蛋白的表达水平
琼脂糖电泳显示，总RNA的28S和18S条带清晰，说明RNA质量稳定；作为内标的管家基因，β-actin mRNA(2.0 kb)条带的灰度一致，表明每一泳道40 μg总RNA的上样量稳定；PR mRNA的大小由28 S和18 S的大小及其迁移率计算而定。大批量样品分别在多张膜上杂交，每张膜均点有同一等量的标准样品，以尽量缩小批间误差。2例肌瘤患者的肌瘤瘤心、瘤边缘及子宫体肌组织中PR mRNA的Northern印迹法检测结果显示，PR mRNA的主带位于11.1 kb处(图1)。
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M：子宫体肌组织 C：肌瘤瘤心 A：瘤边缘 P：阳性对照
图1 PR mRNA的Northern印迹法检测结果
PR mRNA主带密度扫描数据经膜内β-actin及膜间标准较正。单纯手术组的肌瘤瘤心及瘤边缘组织中PR mRNA表达量在卵泡期与黄体期均高于子宫体肌组织(卵泡期P<0.01，黄体期P<0.05)，而瘤心与瘤边缘组织间差异无显著性(P>0.05)。瘤心组织中PR mRNA的表达水平在卵泡期显著高于黄体期(P<0.05，图2)。
图2 单纯手术组卵泡期和黄体期子宫体肌组织及瘤心、瘤边缘组织中PR mRNA水平
与PR mRNA相似，卵泡期和黄体期肌瘤瘤心及瘤边缘组织中PR含量均显著高于子宫体肌组织(卵泡期P<0.01，黄体期P<0.05)，呈持续高表达，而瘤心与瘤边缘组织间差异无显著性(P>0.05)。子宫体肌组织中PR含量在卵泡期显著高于黄体期(P<0.05)，瘤心及瘤边缘组织中无此变化(图3)。
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图3 卵泡期和黄体期子宫体肌组织及瘤心、瘤边缘组织中PR蛋白水平
二、米非司酮组肌瘤及子宫体肌组织中PR mRNA及PR蛋白的表达水平
米非司酮治疗后各例患者PR mRNA主带也在11.1 kb处，肌瘤及子宫体肌组织中PR mRNA主带强弱不一致，其中4例术前未停药者瘤心、瘤边缘及子宫体肌组织中PR mRNA杂交主带明显减弱，2例停药1月内手术者PR mRNA主带与单纯手术组相似(图4)，由于例数较少，未作统计学检验。
米非司酮组的瘤心及瘤边缘组织中PR仍显著高于子宫体肌组织(P<0.01，P<0.05)；但3种组织中PR含量均显著低于单纯手术组的相应组织(包括2例停药1月手术者)(P<0.01)，肌瘤中的变化更明显。单纯手术组瘤心、瘤边缘组织中PR明显高于子宫肌组织(P<0.01，图5)。
三、肌瘤及子宫体肌组织中PR mRNA与PR蛋白表达的关系
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单纯手术组肌瘤及子宫体肌组织中PR mRNA与PR含量均呈一致的正向关系；而米非司酮组术前未停药者，PR mRNA水平下降的同时PR含量也下降，呈现一致关系。而停药1月内手术者，PR蛋白处于低水平，但PR mRNA上升，接近单纯手术组水平，呈现反向关系。
讨论
一、子宫肌瘤中PR mRNA及PR蛋白高表达与肌瘤生长的关系
肌瘤生长的调节因素极其复杂，至今尚未完全阐明。近年来大量的临床观察表明，P在肌瘤的生长过程中可能起重要的促进作用。在黄体期，肌瘤的有丝分裂相增加[4]；在妊娠期，肌瘤常迅速长大，在长期下丘脑促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)诱导体内低雌激素状态以使肌瘤萎缩的过程中，加用安宫黄体酮可使已缩小的子宫及肌瘤迅速长大[7]，均提示P是促肌瘤生长的重要因素之一。
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P：阳性对照 X：术前米非司酮未停药者 Y：术前米非司酮停药者 Z：单纯手术者图4 6例术前经米非司酮治疗及1例单纯手术的子宫肌瘤患者PR mRNA的Northern印迹法检测结果
图5 两组子宫体肌组织及肌瘤瘤心、瘤边缘
组织中PR水平的比较
从受体角度来研究PR在肌瘤及子宫体肌组织中的表达差异，以阐明PR基因的表达在肌瘤生长中的作用。为消除激素环境及受体检测方法的不同而造成的误差，分别从转录及翻译两个水平对同一患者的肌瘤及子宫体正常肌组织进行研究。结果发现，PRmRNA及PR蛋白水平在肌瘤中均呈持续高表达，而在肌瘤的不同部位无显著差别，与Brandon等[3]的结果相似，但后者的资料未经统计学检验。另外，Vollenhoven等[8]的研究中虽发现PR蛋白在肌瘤中高表达，但未发现PR mRNA在肌瘤和子宫肌组织中存在显著差异，这可能与其所取的样本量较小有关。
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肌瘤及子宫体肌组织中PR mRNA及PR蛋白水平在卵泡期和黄体期有差异。我们发现，肌瘤瘤心中PR mRNA在卵泡期显著高于黄体期；在肌瘤瘤边缘及子宫体肌组织中，PR mRNA表达量在两期中虽无显著差异，但在卵泡期略高于黄体期。PR蛋白表达量在子宫体肌组织中卵泡期显著高于黄体期，但在瘤心及瘤边缘组织中均无此变化。已知孕激素对其自身的受体有降调作用[9]。黄体期由于黄体的形成产生大量的P，使子宫肌及肌瘤中PR mRNA水平降低，支持P有降调PR mRNA表达的作用。与此相适应，子宫肌组织中PR蛋白水平在黄体期也显著降低。但肌瘤中PR蛋白在黄体期并不降低，甚至有增加的趋势，提示肌瘤中PR基因转录与翻译不同步，推测可能与肌瘤局部受体代谢异常有关。肌瘤中PR蛋白水平取决于受体的合成与降解过程的平衡。若受体降解减少，即使一定时期内受体合成减少，但局部仍可保持高浓度的PR。肌瘤中PR的持续高表达，使得黄体期P-PR效应显著增加，导致肌瘤在此期生长较快。目前对P如何促进子宫肌瘤组织生长尚不清楚。有研究发现，P可升调表皮生长因子(EGF)及其受体的表达[10]；PR表达增加与肌瘤组织中有丝分裂抗原Ki-67水平呈显著正相关[3]，推测P可能作为转录调节因子通过启动原癌基因或与生长调节相关的基因表达来刺激肌瘤的生长，这个假设尚有待于进一步研究。
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二、米非司酮抑制PR基因表达为治疗子宫肌瘤的机理之一
1993年，Murphy等[6]报道了抗孕激素制剂米非司酮可使子宫肌瘤缩小。本研究发现，米非司酮治疗后，肌瘤及子宫体肌组织中PR mRNA及PR蛋白均显著下降，提示米非司酮不仅可能通过与P相似的结构竞争PR，同时还可抑制PR基因的转录和翻译过程，使靶组织中PR含量降低，导致肌瘤的缩小。实验中我们还发现，停药一个月后，PR mRNA恢复到治疗前水平，但此时PR蛋白仍继续处于较低水平，出现转录和翻译不完全同步现象，说明米非司酮抑制PR基因转录的效应是可逆的，但其抑制PR基因表达而产生的治疗作用可能持续较长时间，这与临床上初步观察到米非司酮停药后，肌瘤在相当时间内仍未增大的结果相符。尽管我们发现米非司酮治疗后患者血中雌、孕激素水平均无明显下降，且肌瘤中雌激素受体水平亦无明显变化，但由于组织中PR含量显著下降，使P-PR作用显著降低，因此使肌瘤萎缩，提示米非司酮治疗子宫肌瘤的效应与其影响PR基因表达有密切关系。
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参考文献
1 Buttram VC Jr, Reiter RC. Uterine leiomyomata: etiology, symptomato- logy and management. Fertil Steril, 1981, 36:433-444.
2 Vollenhoven BJ, Lawrence AS, Healy DL. Uterine fibroids: a clinical review. Br J Obster Gynecol, 1990, 97:258-298.
3 Brandon DD, Bethea CL, Strawn EY, et al. Progesterone receptor messenger ribonucleic acid and protein are overexpressed in human uterine leiomyomas. Am J Obstet Gynecol, 1993, 169:78-85.
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4 Kawaguchi K, Fujii S, Konishi I, et al. Mitotic activity in uterine leiomyomas during the menstrual cycle. Am J Obstet Gynecol, 1989, 160:637-641.
5 Carr BR, Marshburn PB, Weatherall PT, et al. An evaluation of the effect of gonadotropin-releasing hormone analogs and medroxyprogesterone acetate on uterine leiomyomata volume by magnetic resonance imaging: a prospective, randomized, double blind, placebo-controlled, crossover trial. J Clin Endocrinol Metab, 1993, 76:1217-1222.
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6 Murphy AA, Kettel LM, Morales AJ, et al. Regression of uterine leiomyomata in response to the anti progesterone RU486. J Clin Endocrinol Metab, 1993, 76:513-517.
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8 Vollenhoven BJ, Pearce P, Herington AC, et al. Steroid receptor binding and messenger RNA expression in fibroids from untreated and gonadotrophin-releasing hormone agonist pretreated women. Clin Endocrinol, 1994, 40:537-544.
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9 Neulen J, Beato M, Beier HM. Cytosol and nuclear progesterone receptor concentrations in the rabbit endometrium during early pseudo-pregnancy under different treatments with estradiol and progesterone. Mol Cell Endocrinol, 1982, 25:183-191.
10 Harrison-Wooliych ML, Charnock-Jones DS, Smith SK. Quantification of messenger ribonucleic acid for epidermal growth factor in human myometrium and leiomyomata using reverse transcripts polymerase chain reaction. J Clin Endocrinol Metab, 1994, 78:1179-1184.
(收稿：1997-07-20 修回：1997-12-09), http://www.100md.com
单位：200011 上海医科大学妇产科医院(孙梅，周丽蓉，俞瑾)；中国科学院上海生物化学研究所分子生物学国家重点实验室(朱国璋，张永莲)
关键词：米非司酮；子宫肿瘤；平滑肌瘤；受体；孕酮；基因表达
中华妇产科杂志980411 【摘要】 目的 研究子宫肌瘤组织中孕激素受体(PR)基因的表达情况，从PR基因的转录及翻译水平探讨米非司酮治疗子宫肌瘤的作用机理。方法 采用Northern印迹法和羟基磷灰石(HAP)单点饱和分析法，分别测定27例单纯手术治疗(单纯手术组)及6例术前口服米非司酮每天25 mg共3个月(米非司酮组)的子宫肌瘤患者的肌瘤瘤心、瘤边缘及子宫体正常肌组织中PR mRNA和PR蛋白。结果 单纯手术组瘤心和瘤边缘中PR mRNA及PR蛋白水平在卵泡期和黄体期均显著高于子宫体肌组织(P<0.01)，呈持续高表达，而瘤心和瘤边缘间差异无显著性(P>0.05)；米非司酮组4例术前未停药者，肌瘤及子宫体肌组织中PR mRNA和PR蛋白水平均明显降低，2例术前停药1月者，上述组织中PR mRNA与单纯手术者相似，但PR蛋白仍处于低水平。结论 子宫肌瘤中PR基因呈持续高表达。米非司酮能抑制PR基因的表达，在mRNA水平上的影响是可逆的，在蛋白水平上的影响持续时间较长。
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【Abstract】 Objective To determine the expression of progesterone receptor (PR) mRNA and PR protein levels in the myometrium and leiomyomata from untreated and mifepristone pretreated women with leiomyomataand to examine the mechanism of mifepristone treatment on uterine leiomyomata.Methods Expression of PR mRNA and PR protein were determined by Northern blot and HAP of single-dose saturated analysis in myometrium and leiomyomata (center and marginal area) from 27 untreated and 6 mifepristone pretreated women with leiomyomata.Results PR mRNA abundance and PR protein levels in both myomatous center and marginal area were significantly greater than those in corporal myometrium (P<0.01) in both follicular and luteal phases, but similar between myomatous center and marginal area (P>0.05). 6 cases pretreated with mifepristone 25 mg/day for 3 months were operated, all but one patient displayed a decrease in leiomyomata volume. PR mRNA abundance in both myometruim and leiomyomata (center and marginal area) was significantly decreased in 4 patients continuing mifepristone treatment before the operation but not in the other 2 patients stopping RU486 1 month before operation. PR protein levels in these tissues showed significant decrease in all 6 cases.Conclusion There are overexpression of PRmRNA and PR protein in leiomyomata. One of the mechanism of mifepristone action on decreasing leiomyomata volume may be related to suppression on expression of PR gene. It seems that suppression on transcription of PR gene is reversible, but on translation of PR gene may maintain in a relatively longer period.
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【Key words】 Mifepristone Uterine neoplasms Leiomyoma Receptors, progesterone Gene expression
子宫肌瘤是妇科常见的良性肿瘤，在生育期妇女中发病率约为25%[1]，是导致育龄期妇女行全子宫切除术的主要原因之一[2]。近年来孕激素(P)及其受体(PR)对子宫肌瘤的影响受到重视。研究表明，肌瘤中PR mRNA及PR蛋白表达水平均高于正常肌组织[3]；P可促进肌瘤细胞分裂，刺激肌瘤生长[4，5]。抗P制剂米非司酮可使肌瘤体积显著缩小[6]。但关于米非司酮对子宫肌瘤中PR基因表达的影响迄今未见报道。本研究旨在从子宫肌瘤组织及子宫体正常肌组织中PR mRNA及PR蛋白的表达水平，研究米非司酮治疗子宫肌瘤的作用机理。
资料和方法
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一、研究对象
选自1993年12月至1995年12月间在上海医科大学妇产科医院中西医结合科就诊的33例子宫肌瘤患者，均有不同程度的月经过多、痛经及盆腔包块等临床表现。妇科检查及B超证实为子宫肌瘤，而无其它妇科肿瘤等疾病。所有患者以往月经规则，近3个月内无类固醇激素使用史，肝功能正常。分为两组：单纯手术组27例，平均年龄44.5岁(34～52岁)，18例在卵泡期、9例在黄体期行全子宫切除术，术后病理诊断证实为子宫肌瘤。米非司酮组6例，从月经周期第5天起连续口服米非司酮，每天25 mg，共3个月。所有患者服药后均停经，但无潮热、盗汗、心悸及烦燥等绝经期症状，血中雌、孕激素水平均无明显改变，一直在门诊定期随访。5例患者肌瘤明显缩小，手术原因分别为：1例停药1年后肌瘤长大，于再服米非司酮1月后手术；2例肌瘤较大，米非司酮治疗3个月后手术，其中1例为乳腺癌根治术后，1例服药前后内膜均为增生过长；5例中术前未停药者4例，1例停药1月内手术；另1例服药3个月后肌瘤未见缩小，于停药1月内手术。6例患者术前均未恢复月经。术后子宫内膜组织切片诊断，5例子宫内膜呈增生反应，1例呈分泌反应。6例患者服药前与单纯手术组比较，两组的年龄、子宫大小、子宫肌瘤大小和激素水平差异均无显著性。两组治疗前全身状况差异亦无显著性。
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手术切除的新鲜肌瘤(包括肌瘤的瘤心和瘤边缘)及子宫体正常肌组织立即置液氮中冷冻，并存放于-70℃冰箱，待检。
二、方法
1.总RNA的抽提及Northern印迹法测定PRmRNA：采用异硫氰酸胍-苯酚-氯仿一步法[7]从0.5 g肌瘤组织或子宫体肌组织中抽提总RNA。每份样品取40 mg总RNA在1.2%琼脂糖/17.9%甲醛变性凝胶上电泳。每块凝胶上均用同一标准作对照。将溴乙啶(EB)加到每份样品中以检测28S和18S rRNA强度，用以判定样品RNA的含量和质量。用毛细管洗脱法将RNA转移到尼龙膜(Hybon-Nnylon，美国Amersham公司产品)上，在紫外交联机(Gs Gene Linker U-V Chamber,美国BIO-RAD公司产品)中用紫外线将RNA交联固定于尼龙膜上。用随机引物法标记人PR cDNA(2.4kb，编码区域EcoRI-HindⅢ片段)及小鼠β-actin cDNA(2.0kb)作为探针(比活为5×108cpm/ng)，分别与每块膜于65℃杂交炉(Hybridisation Oven，美国Appligene公司产品)杂交过夜。洗膜后于-70℃放射自显影，用岛津CS-930双波长扫描仪(日本)进行 PR mRNA密度定量。杂交后湿润尼龙膜用洗脱缓冲液(10mmol Tris-Hcl， pH8.0，1mmol EDTA，0.1%SDS)于95℃洗涤30分钟，以除去杂交信号，用于下一次杂交。
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2.组织胞浆蛋白抽提及羟基磷灰石(HAP)单点饱和分析法测定PR含量：将0.5 g上述储存的组织置冰浴中，按1∶6(W/V)于3 ml抽提缓冲液(10mmol Tris-HCl， pH7.5，1mmol二硫苏糖醇，10%甘油，10mmol钼酸钠，1mmol PMSF，0.01μg/ml Bactrasin，0.01μg/ml leupeptin)中剪碎，用组织分散器匀浆，于4℃2 500 r/min离心15分钟，上清液再经超速离心机(Centrikon T-2 080，瑞士Kontron公司产品)超速离心(105 000 r/min 4℃)1小时，上清液即为所抽提的组织胞浆蛋白液，用考马斯亮蓝-250/牛血清白蛋白法测定蛋白量。
在200 μl反应体系中，加入200μg胞浆蛋白与3H-R5020(86.7 Ci/mmol，美国Dupon T公司产品)。反应终浓度为15nmol/ml)反应，非特异性结合由加入100倍的非标记R5020(美国Dupon T公司产品)测得。样品置于4℃孵育16～18小时，加入0.3 ml 60%HAP(上海生化所申华公司)，混匀15分钟，每5分钟振荡1次以吸附结合的3H-R5020-PR复合物，经滤纸负压抽滤，用5 ml洗脱缓冲液(10mmol Tris-HCl， pH8.0，10mmol磷酸二氢钠，1%吐温-80)洗涤3次，抽干，滤纸片及沉淀置5ml 0.4%PPO-popop-二甲苯闪烁液中闪烁计数。
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三、统计学方法
肌瘤与肌组织的比较采用配对t检验，单纯手术组与米非司酮组的比较采用两样本均数比较的t检验。上述分析由SPSS/PC+V3.0软件和LBM PC80 486兼容机进行处理。数据以±s表示。
结果
一、单纯手术组肌瘤及子宫体肌组织PR mRNA及PR蛋白的表达水平
琼脂糖电泳显示，总RNA的28S和18S条带清晰，说明RNA质量稳定；作为内标的管家基因，β-actin mRNA(2.0 kb)条带的灰度一致，表明每一泳道40 μg总RNA的上样量稳定；PR mRNA的大小由28 S和18 S的大小及其迁移率计算而定。大批量样品分别在多张膜上杂交，每张膜均点有同一等量的标准样品，以尽量缩小批间误差。2例肌瘤患者的肌瘤瘤心、瘤边缘及子宫体肌组织中PR mRNA的Northern印迹法检测结果显示，PR mRNA的主带位于11.1 kb处(图1)。
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M：子宫体肌组织 C：肌瘤瘤心 A：瘤边缘 P：阳性对照
图1 PR mRNA的Northern印迹法检测结果
PR mRNA主带密度扫描数据经膜内β-actin及膜间标准较正。单纯手术组的肌瘤瘤心及瘤边缘组织中PR mRNA表达量在卵泡期与黄体期均高于子宫体肌组织(卵泡期P<0.01，黄体期P<0.05)，而瘤心与瘤边缘组织间差异无显著性(P>0.05)。瘤心组织中PR mRNA的表达水平在卵泡期显著高于黄体期(P<0.05，图2)。
图2 单纯手术组卵泡期和黄体期子宫体肌组织及瘤心、瘤边缘组织中PR mRNA水平
与PR mRNA相似，卵泡期和黄体期肌瘤瘤心及瘤边缘组织中PR含量均显著高于子宫体肌组织(卵泡期P<0.01，黄体期P<0.05)，呈持续高表达，而瘤心与瘤边缘组织间差异无显著性(P>0.05)。子宫体肌组织中PR含量在卵泡期显著高于黄体期(P<0.05)，瘤心及瘤边缘组织中无此变化(图3)。
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图3 卵泡期和黄体期子宫体肌组织及瘤心、瘤边缘组织中PR蛋白水平
二、米非司酮组肌瘤及子宫体肌组织中PR mRNA及PR蛋白的表达水平
米非司酮治疗后各例患者PR mRNA主带也在11.1 kb处，肌瘤及子宫体肌组织中PR mRNA主带强弱不一致，其中4例术前未停药者瘤心、瘤边缘及子宫体肌组织中PR mRNA杂交主带明显减弱，2例停药1月内手术者PR mRNA主带与单纯手术组相似(图4)，由于例数较少，未作统计学检验。
米非司酮组的瘤心及瘤边缘组织中PR仍显著高于子宫体肌组织(P<0.01，P<0.05)；但3种组织中PR含量均显著低于单纯手术组的相应组织(包括2例停药1月手术者)(P<0.01)，肌瘤中的变化更明显。单纯手术组瘤心、瘤边缘组织中PR明显高于子宫肌组织(P<0.01，图5)。
三、肌瘤及子宫体肌组织中PR mRNA与PR蛋白表达的关系
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单纯手术组肌瘤及子宫体肌组织中PR mRNA与PR含量均呈一致的正向关系；而米非司酮组术前未停药者，PR mRNA水平下降的同时PR含量也下降，呈现一致关系。而停药1月内手术者，PR蛋白处于低水平，但PR mRNA上升，接近单纯手术组水平，呈现反向关系。
讨论
一、子宫肌瘤中PR mRNA及PR蛋白高表达与肌瘤生长的关系
肌瘤生长的调节因素极其复杂，至今尚未完全阐明。近年来大量的临床观察表明，P在肌瘤的生长过程中可能起重要的促进作用。在黄体期，肌瘤的有丝分裂相增加[4]；在妊娠期，肌瘤常迅速长大，在长期下丘脑促性腺激素释放激素激动剂(GnRH-a)诱导体内低雌激素状态以使肌瘤萎缩的过程中，加用安宫黄体酮可使已缩小的子宫及肌瘤迅速长大[7]，均提示P是促肌瘤生长的重要因素之一。
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P：阳性对照 X：术前米非司酮未停药者 Y：术前米非司酮停药者 Z：单纯手术者图4 6例术前经米非司酮治疗及1例单纯手术的子宫肌瘤患者PR mRNA的Northern印迹法检测结果
图5 两组子宫体肌组织及肌瘤瘤心、瘤边缘
组织中PR水平的比较
从受体角度来研究PR在肌瘤及子宫体肌组织中的表达差异，以阐明PR基因的表达在肌瘤生长中的作用。为消除激素环境及受体检测方法的不同而造成的误差，分别从转录及翻译两个水平对同一患者的肌瘤及子宫体正常肌组织进行研究。结果发现，PRmRNA及PR蛋白水平在肌瘤中均呈持续高表达，而在肌瘤的不同部位无显著差别，与Brandon等[3]的结果相似，但后者的资料未经统计学检验。另外，Vollenhoven等[8]的研究中虽发现PR蛋白在肌瘤中高表达，但未发现PR mRNA在肌瘤和子宫肌组织中存在显著差异，这可能与其所取的样本量较小有关。
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肌瘤及子宫体肌组织中PR mRNA及PR蛋白水平在卵泡期和黄体期有差异。我们发现，肌瘤瘤心中PR mRNA在卵泡期显著高于黄体期；在肌瘤瘤边缘及子宫体肌组织中，PR mRNA表达量在两期中虽无显著差异，但在卵泡期略高于黄体期。PR蛋白表达量在子宫体肌组织中卵泡期显著高于黄体期，但在瘤心及瘤边缘组织中均无此变化。已知孕激素对其自身的受体有降调作用[9]。黄体期由于黄体的形成产生大量的P，使子宫肌及肌瘤中PR mRNA水平降低，支持P有降调PR mRNA表达的作用。与此相适应，子宫肌组织中PR蛋白水平在黄体期也显著降低。但肌瘤中PR蛋白在黄体期并不降低，甚至有增加的趋势，提示肌瘤中PR基因转录与翻译不同步，推测可能与肌瘤局部受体代谢异常有关。肌瘤中PR蛋白水平取决于受体的合成与降解过程的平衡。若受体降解减少，即使一定时期内受体合成减少，但局部仍可保持高浓度的PR。肌瘤中PR的持续高表达，使得黄体期P-PR效应显著增加，导致肌瘤在此期生长较快。目前对P如何促进子宫肌瘤组织生长尚不清楚。有研究发现，P可升调表皮生长因子(EGF)及其受体的表达[10]；PR表达增加与肌瘤组织中有丝分裂抗原Ki-67水平呈显著正相关[3]，推测P可能作为转录调节因子通过启动原癌基因或与生长调节相关的基因表达来刺激肌瘤的生长，这个假设尚有待于进一步研究。
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二、米非司酮抑制PR基因表达为治疗子宫肌瘤的机理之一
1993年，Murphy等[6]报道了抗孕激素制剂米非司酮可使子宫肌瘤缩小。本研究发现，米非司酮治疗后，肌瘤及子宫体肌组织中PR mRNA及PR蛋白均显著下降，提示米非司酮不仅可能通过与P相似的结构竞争PR，同时还可抑制PR基因的转录和翻译过程，使靶组织中PR含量降低，导致肌瘤的缩小。实验中我们还发现，停药一个月后，PR mRNA恢复到治疗前水平，但此时PR蛋白仍继续处于较低水平，出现转录和翻译不完全同步现象，说明米非司酮抑制PR基因转录的效应是可逆的，但其抑制PR基因表达而产生的治疗作用可能持续较长时间，这与临床上初步观察到米非司酮停药后，肌瘤在相当时间内仍未增大的结果相符。尽管我们发现米非司酮治疗后患者血中雌、孕激素水平均无明显下降，且肌瘤中雌激素受体水平亦无明显变化，但由于组织中PR含量显著下降，使P-PR作用显著降低，因此使肌瘤萎缩，提示米非司酮治疗子宫肌瘤的效应与其影响PR基因表达有密切关系。
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参考文献
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(收稿：1997-07-20 修回：1997-12-09), http://www.100md.com