卵巢癌可溶性抗原和抗CD3单克隆抗体诱导细胞毒性T细胞抗人卵巢癌的实验研究
作者：张庆波 万云霞 翟红 陈毓仙
单位：100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学免疫室[张庆波(现在华北煤炭医学院微生物免疫学教研室)，万云霞，翟红，陈毓仙]
关键词：卵巢肿瘤；免疫疗法；过继；抗原；肿瘤；T淋巴细胞；细胞毒性
中华妇产科杂志980611 【摘要】 目的 探讨卵巢癌过继细胞免疫治疗新方法。方法 提取卵巢癌细胞(COC1和COC2n)可溶性抗原(TSA)，用TSA和抗CD3单克隆抗体(CD3-McAb)共同诱导正常人外周血单个核细胞(PBMC)产生细胞毒性T细胞(CTL)，用CTL于体外杀伤COC1细胞和裸鼠体内抑制COC2n移植瘤的生长，体外和淋巴因子-激活杀伤细胞(LAK)、淋巴因子和抗CD3单抗激活的杀伤细胞(CD3-AK)细胞进行比较，体内和CD3-AK细胞进行比较。结果 CTL、CD3-AK 和LAK对COC1细胞的细胞毒作用分别为79.4%、 52.1% 和 51.7% (P<0.01)。在体内，CTL与CD3-AK和未经处理的对照组比较，卵巢癌细胞移植到裸鼠体内的第9天，肿瘤平均体积分别为44.4± 24.2 mm3、118.8±40.0 mm3和443.0±158.7 mm3 (P<0.01)，裸鼠平均生存期分别为28.5天、25.5天和17天(P<0.01)。结论 本方法诱导产生的CTL，在体内、体外对卵巢癌细胞均有较高的细胞毒作用，能明显抑制肿瘤生长，为卵巢癌治疗提供了新的思路。
, http://www.100md.com
Anti-Tumor Effect of Cytotoxic T Lymphocytes Induced by Soluble Antigen of Ovarian Carcinoma and Anti-CD3 Monoclonal Antibody on Ovarian Carcinoma Zhang Qingbo*, Wan Yunxia, Zhai Hong, et al. * Department of Immunology, North China Coal Medical College, Tangshan 063000
【Abstract】 Objective To evaluate the therapeutic effect of the new method-adoptive cell immunotherapy on ovarian carcinoma. Methods Tumor soluble antigen (TSA) was extracted from cells of ovarian carcinoma (COC1 and COC2n). To generate cytotoxic T lymphocytes (CTL), peripheral blood mononuclear cells (PBMC) collected from healthy persons were induced by TSA and anti-CD3 monoclonal antibody (CD3-McAb). The antitumor effect of CTL on COC1 cells in vitro was compared with LAK and CD3-AK, whereas the growth inhibitory effect of CTL on COC2n transplantation tumors in nude mice was compared with CD3-AK. Results The cytotoxicity of CTL, CD3-AK and LAK was 79.4%, 52.1% and 51.7% respectively (P<0.01). Mean volume of tumor in nude mice on the 9th day after ovarian carcinoma cells transplanted was 44.4±24.2 mm3 in CTL group, 118.8±40.0 mm3 in CD3-AK group and 443.0±158.7 mm3 in control (no treatment) (P<0.01), whereas mean duration of survival was 28.5 days, 25.5 days and 17 days respectively (P<0.01). Conclusion The results indicated that CTL exhibited higher cytotoxic effect in vitro and greater inhibitory effect on tumor growth resulting in longer survival in vivo. It suggested that the adoptive cell immunotherapy might provide a new idea for treatment of ovarian carcinoma.
, 百拇医药
【Key words】 Ovarian neoplasms Immunotherapy, adoptive Antigens, neoplasm T-lymphocytes, cytotoxic
用肿瘤可溶性抗原(TSA)和抗CD3单克隆抗体(CD3-McAb)共同刺激外周血单个核细胞(PBMC)，在含白细胞介素-2(IL-2)的培养基中培养，细胞增殖快，细胞毒活性高，并产生CD8+T细胞为主(90%以上)的杀伤细胞[1]。在此基础上，我们探讨了用人卵巢癌细胞TSA和CD3-McAb体外共同刺激PBMC，诱导产生细胞毒性T细胞(CTL)，观察CTL在体内、体外对卵巢癌细胞的细胞毒作用。现将研究结果报道如下。
材料和方法
一、材料
, 百拇医药
1. 实验动物：6周龄雌性BALB-C裸鼠18只，由中国医学科学院、中国协和医科大学肿瘤研究所动物室提供，无菌条件下喂养。
2. 肿瘤细胞系：为人卵巢癌细胞株COC1和人卵巢癌裸鼠移植瘤细胞株COC2n[2,3 ]，来源见参考文献[3]。
二、方法
1. PBMC的分离：正常献血者外周血，经肝素抗凝，按Ficoll-Hypaque细胞分离液(比重0.077)密度梯度离心，以常规法分离PBMC。
2. 肿瘤可溶性抗原的制备：按文献[4]提取COC1、COC2n细胞株细胞可溶性成分。提取物用紫外分光光度计280 nm波长下测定蛋白含量，作为TSA。经0.45 μm微孔滤膜过滤除菌，于-80℃保存备用。
, 百拇医药
3. 效应细胞培养：将分离的PBMC置于含10%人AB型血清的RPMI-1640培养基中，调整细胞浓度为1×106/ml，加入TSA 5 μg/ml、CD3-McAb 50 ng/ml和IL-2 500 U/ml，即CTL效应细胞，加入CD3-McAb 50 ng/ml和IL-2 500 U/ml，即淋巴因子和抗CD3单抗激活的杀伤细胞(CD3-AK)效应细胞；加入IL-2 500 U/ml，即淋巴因子-激活杀伤细胞(LAK)效应细胞。置37℃、5% CO2培养箱中培养48小时，然后换加含IL-2(500 U/ml)、人AB型血清(10%)的RPMI-1640培养基扩增培养，每3天换新鲜培养基1次。用台盼蓝染色，在细胞计数盘光学显微镜下计数活细胞数，用于测定对卵巢癌细胞的细胞毒作用。
4. 体外细胞毒实验[5]： 将效应细胞CTL、CD3-AK、LAK(2×106细胞/ml) 和靶细胞COC1(1×105 细胞/ml)各100 μl (效应细胞∶靶细胞=20∶1)置于96孔细胞培养板中，另设单独效应细胞和靶细胞对照，每组设3个平行孔，置37℃、5% CO2 培养箱中培养24小时，用四甲基偶氮唑蓝比色法测定效应细胞对靶细胞的细胞毒作用。
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5. 裸鼠体内实验[6]：将效应细胞(CTL，CD3-AK) 培养到第10天时，调整细胞浓度为4×107/ml。将人卵巢癌细胞COC2n接种至裸鼠下腹部皮下，待瘤组织长至直径1 cm左右时，无菌取下肿瘤组织，剪切研磨成单个细胞，用RPMI-1640培养基调整细胞浓度为2×106/ml作为靶细胞。将效应细胞分别与靶细胞等体积混合作为CTL组和CD3-AK组，靶细胞与磷酸盐缓冲液(PBS)等量混合作为对照组。每只裸鼠下腹部皮下注射0.1 ml混合液。每组6只裸鼠，然后观察裸鼠体内肿瘤生长情况和裸鼠生存情况。
结果
一、效应细胞对靶细胞的细胞毒作用
采用同一供者的PBMC，制备CTL、 CD3-AK和LAK，对卵巢癌COC1细胞的细胞毒作用分别为79.4%、 52.1% 和 51.7% 。经统计学处理，CTL与CD3-AK和LAK之间，差异有极显著性(P<0.01)。
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二、对肿瘤生长的抑制作用
将肿瘤细胞和效应细胞接种到裸鼠皮下后，每3天观察记录肿瘤生长情况。第3天时，对照组有3只裸鼠已长出肿瘤，6只的平均体积为8.8 mm3；CTL组和CD3-AK组均未长出肿瘤。第6天时，对照组6只裸鼠肿瘤的平均体积为61.5 mm3；CTL组和CD3-AK组尚未长出肿瘤。第9天时，对照组6只裸鼠肿瘤的平均体积为443.0±158.7 mm3, CD3-AK组6只裸鼠肿瘤的平均体积为118.8±40.0 mm3，CTL组6只裸鼠肿瘤的平均体积为44.4±24.2 mm3。 经统计学处理，CTL与CD3-AK和LAK组之间，差异有极显著性(P<0.01)，CD3-AK与LAK组之间，差异也有极显著性(P<0.01)。
, 百拇医药 三、对荷瘤裸鼠生存的影响
每天观察裸鼠生存情况发现，对照组裸鼠16天时死亡1只，到19天全部死亡；CD3-AK组裸鼠19天时死亡1只, 到32天全部死亡；CTL组裸鼠22天时死亡1只，到35天全部死亡。经统计学处理，对照组与CD3-AK组和CTL组进行配对t检验，差异均有极显著性(P<0.01)。
讨论
本研究对卵巢癌的过继细胞免疫治疗进行的实验研究表明，用人卵巢癌TSA和CD3-McAb共同诱导产生的CTL，与CD3-AK和LAK细胞相比，对卵巢癌细胞的细胞毒活性高。裸鼠体内实验研究表明，这种CTL细胞与CD3-AK细胞比较，能更好的抑制裸鼠体内移植瘤的生长和延长荷瘤裸鼠的生存时间,体内实验结果与体外实验结果一致，为卵巢癌的过继细胞免疫治疗提供了新思路。
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本研究采用本室建立的卵巢癌细胞株COC2n作为本实验的裸鼠移植瘤模型，经过约3年时间的液氮冻存后复苏，由右侧背部皮下接种改为下腹部皮下接种(此部位更有利于卵巢癌细胞的生长)，瘤细胞传至第16代时，生瘤潜伏期和荷瘤鼠生存期明显缩短，分别为5±1天和17±2天(细胞传代至11代时分别为10±2天和52±7天)，并提高了传代成功率，成功率由第11代时的98.3%提高到第16代的100.0%。因此，应用本实验模型，改用下腹部皮下接种，实验周期短，个体差异小，是进行裸鼠体内实验的良好模型。
本研究中，裸鼠在无菌条件下进行饲养，各组裸鼠均未出现明显的感染现象。CTL细胞和CD3-AK细胞进入机体后，一方面，它们可以产生直接的杀伤肿瘤细胞的作用；另一方面，它们分泌一些细胞因子[7]，调节机体的免疫功能。CTL细胞和CD3-AK细胞是否具有提高机体非特异性抗感染作用，有待进一步研究。
, http://www.100md.com 参考文献
1 陈毓仙，石卫，万云霞,等.可溶性肿瘤抗原和CD3单克隆抗体共同诱导的杀瘤细胞：T-AK细胞.中华微生物学和免疫学杂志,1995，15:293-296.
2 熊世钢，陈毓仙，吴爱如,等.两个人卵巢癌细胞系(COC1，COC2)的建立及特性.中华肿瘤杂志，1993，15:22-22.
3 熊世钢，吴爱如，陈毓仙,等.COC1n和COC2n两个人卵巢癌裸鼠移植瘤模型的建立及特性.中华肿瘤杂志，1992，14:396.
4 Rotzschke 0，Flak K. Naturally-occurring peptide antigens derived form the MHC class I-restricted processing pathway. Immunology Today，1991，12:447-453.
, 百拇医药
5 Ferrari M，Fornasiero C，Isstta M.MTT colorimetric assay for testing macrophage cytotoxic activity in vitro. J Immunol Meth，1990，131:165-172.
6 白云飞，张学庸，牟震先,等.CD3单克隆抗体活化的杀伤细胞对人胃癌细胞株MNK45体外杀伤及裸鼠体内抑制作用的实验研究.中华肿瘤杂志，1994，16:111-114.
7 张庆波，边洪荣，李晓强，等.卵巢癌细胞提取物免疫活性成分分析.华北煤炭医学院学报， 1997，12:1-3.
(收稿：1997-06-22 修回：1998-03-25), 百拇医药
单位：100021 北京，中国医学科学院中国协和医科大学免疫室[张庆波(现在华北煤炭医学院微生物免疫学教研室)，万云霞，翟红，陈毓仙]
关键词：卵巢肿瘤；免疫疗法；过继；抗原；肿瘤；T淋巴细胞；细胞毒性
中华妇产科杂志980611 【摘要】 目的 探讨卵巢癌过继细胞免疫治疗新方法。方法 提取卵巢癌细胞(COC1和COC2n)可溶性抗原(TSA)，用TSA和抗CD3单克隆抗体(CD3-McAb)共同诱导正常人外周血单个核细胞(PBMC)产生细胞毒性T细胞(CTL)，用CTL于体外杀伤COC1细胞和裸鼠体内抑制COC2n移植瘤的生长，体外和淋巴因子-激活杀伤细胞(LAK)、淋巴因子和抗CD3单抗激活的杀伤细胞(CD3-AK)细胞进行比较，体内和CD3-AK细胞进行比较。结果 CTL、CD3-AK 和LAK对COC1细胞的细胞毒作用分别为79.4%、 52.1% 和 51.7% (P<0.01)。在体内，CTL与CD3-AK和未经处理的对照组比较，卵巢癌细胞移植到裸鼠体内的第9天，肿瘤平均体积分别为44.4± 24.2 mm3、118.8±40.0 mm3和443.0±158.7 mm3 (P<0.01)，裸鼠平均生存期分别为28.5天、25.5天和17天(P<0.01)。结论 本方法诱导产生的CTL，在体内、体外对卵巢癌细胞均有较高的细胞毒作用，能明显抑制肿瘤生长，为卵巢癌治疗提供了新的思路。
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Anti-Tumor Effect of Cytotoxic T Lymphocytes Induced by Soluble Antigen of Ovarian Carcinoma and Anti-CD3 Monoclonal Antibody on Ovarian Carcinoma Zhang Qingbo*, Wan Yunxia, Zhai Hong, et al. * Department of Immunology, North China Coal Medical College, Tangshan 063000
【Abstract】 Objective To evaluate the therapeutic effect of the new method-adoptive cell immunotherapy on ovarian carcinoma. Methods Tumor soluble antigen (TSA) was extracted from cells of ovarian carcinoma (COC1 and COC2n). To generate cytotoxic T lymphocytes (CTL), peripheral blood mononuclear cells (PBMC) collected from healthy persons were induced by TSA and anti-CD3 monoclonal antibody (CD3-McAb). The antitumor effect of CTL on COC1 cells in vitro was compared with LAK and CD3-AK, whereas the growth inhibitory effect of CTL on COC2n transplantation tumors in nude mice was compared with CD3-AK. Results The cytotoxicity of CTL, CD3-AK and LAK was 79.4%, 52.1% and 51.7% respectively (P<0.01). Mean volume of tumor in nude mice on the 9th day after ovarian carcinoma cells transplanted was 44.4±24.2 mm3 in CTL group, 118.8±40.0 mm3 in CD3-AK group and 443.0±158.7 mm3 in control (no treatment) (P<0.01), whereas mean duration of survival was 28.5 days, 25.5 days and 17 days respectively (P<0.01). Conclusion The results indicated that CTL exhibited higher cytotoxic effect in vitro and greater inhibitory effect on tumor growth resulting in longer survival in vivo. It suggested that the adoptive cell immunotherapy might provide a new idea for treatment of ovarian carcinoma.
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【Key words】 Ovarian neoplasms Immunotherapy, adoptive Antigens, neoplasm T-lymphocytes, cytotoxic
用肿瘤可溶性抗原(TSA)和抗CD3单克隆抗体(CD3-McAb)共同刺激外周血单个核细胞(PBMC)，在含白细胞介素-2(IL-2)的培养基中培养，细胞增殖快，细胞毒活性高，并产生CD8+T细胞为主(90%以上)的杀伤细胞[1]。在此基础上，我们探讨了用人卵巢癌细胞TSA和CD3-McAb体外共同刺激PBMC，诱导产生细胞毒性T细胞(CTL)，观察CTL在体内、体外对卵巢癌细胞的细胞毒作用。现将研究结果报道如下。
材料和方法
一、材料
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1. 实验动物：6周龄雌性BALB-C裸鼠18只，由中国医学科学院、中国协和医科大学肿瘤研究所动物室提供，无菌条件下喂养。
2. 肿瘤细胞系：为人卵巢癌细胞株COC1和人卵巢癌裸鼠移植瘤细胞株COC2n[2,3 ]，来源见参考文献[3]。
二、方法
1. PBMC的分离：正常献血者外周血，经肝素抗凝，按Ficoll-Hypaque细胞分离液(比重0.077)密度梯度离心，以常规法分离PBMC。
2. 肿瘤可溶性抗原的制备：按文献[4]提取COC1、COC2n细胞株细胞可溶性成分。提取物用紫外分光光度计280 nm波长下测定蛋白含量，作为TSA。经0.45 μm微孔滤膜过滤除菌，于-80℃保存备用。
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3. 效应细胞培养：将分离的PBMC置于含10%人AB型血清的RPMI-1640培养基中，调整细胞浓度为1×106/ml，加入TSA 5 μg/ml、CD3-McAb 50 ng/ml和IL-2 500 U/ml，即CTL效应细胞，加入CD3-McAb 50 ng/ml和IL-2 500 U/ml，即淋巴因子和抗CD3单抗激活的杀伤细胞(CD3-AK)效应细胞；加入IL-2 500 U/ml，即淋巴因子-激活杀伤细胞(LAK)效应细胞。置37℃、5% CO2培养箱中培养48小时，然后换加含IL-2(500 U/ml)、人AB型血清(10%)的RPMI-1640培养基扩增培养，每3天换新鲜培养基1次。用台盼蓝染色，在细胞计数盘光学显微镜下计数活细胞数，用于测定对卵巢癌细胞的细胞毒作用。
4. 体外细胞毒实验[5]： 将效应细胞CTL、CD3-AK、LAK(2×106细胞/ml) 和靶细胞COC1(1×105 细胞/ml)各100 μl (效应细胞∶靶细胞=20∶1)置于96孔细胞培养板中，另设单独效应细胞和靶细胞对照，每组设3个平行孔，置37℃、5% CO2 培养箱中培养24小时，用四甲基偶氮唑蓝比色法测定效应细胞对靶细胞的细胞毒作用。
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5. 裸鼠体内实验[6]：将效应细胞(CTL，CD3-AK) 培养到第10天时，调整细胞浓度为4×107/ml。将人卵巢癌细胞COC2n接种至裸鼠下腹部皮下，待瘤组织长至直径1 cm左右时，无菌取下肿瘤组织，剪切研磨成单个细胞，用RPMI-1640培养基调整细胞浓度为2×106/ml作为靶细胞。将效应细胞分别与靶细胞等体积混合作为CTL组和CD3-AK组，靶细胞与磷酸盐缓冲液(PBS)等量混合作为对照组。每只裸鼠下腹部皮下注射0.1 ml混合液。每组6只裸鼠，然后观察裸鼠体内肿瘤生长情况和裸鼠生存情况。
结果
一、效应细胞对靶细胞的细胞毒作用
采用同一供者的PBMC，制备CTL、 CD3-AK和LAK，对卵巢癌COC1细胞的细胞毒作用分别为79.4%、 52.1% 和 51.7% 。经统计学处理，CTL与CD3-AK和LAK之间，差异有极显著性(P<0.01)。
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二、对肿瘤生长的抑制作用
将肿瘤细胞和效应细胞接种到裸鼠皮下后，每3天观察记录肿瘤生长情况。第3天时，对照组有3只裸鼠已长出肿瘤，6只的平均体积为8.8 mm3；CTL组和CD3-AK组均未长出肿瘤。第6天时，对照组6只裸鼠肿瘤的平均体积为61.5 mm3；CTL组和CD3-AK组尚未长出肿瘤。第9天时，对照组6只裸鼠肿瘤的平均体积为443.0±158.7 mm3, CD3-AK组6只裸鼠肿瘤的平均体积为118.8±40.0 mm3，CTL组6只裸鼠肿瘤的平均体积为44.4±24.2 mm3。 经统计学处理，CTL与CD3-AK和LAK组之间，差异有极显著性(P<0.01)，CD3-AK与LAK组之间，差异也有极显著性(P<0.01)。
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每天观察裸鼠生存情况发现，对照组裸鼠16天时死亡1只，到19天全部死亡；CD3-AK组裸鼠19天时死亡1只, 到32天全部死亡；CTL组裸鼠22天时死亡1只，到35天全部死亡。经统计学处理，对照组与CD3-AK组和CTL组进行配对t检验，差异均有极显著性(P<0.01)。
讨论
本研究对卵巢癌的过继细胞免疫治疗进行的实验研究表明，用人卵巢癌TSA和CD3-McAb共同诱导产生的CTL，与CD3-AK和LAK细胞相比，对卵巢癌细胞的细胞毒活性高。裸鼠体内实验研究表明，这种CTL细胞与CD3-AK细胞比较，能更好的抑制裸鼠体内移植瘤的生长和延长荷瘤裸鼠的生存时间,体内实验结果与体外实验结果一致，为卵巢癌的过继细胞免疫治疗提供了新思路。
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本研究采用本室建立的卵巢癌细胞株COC2n作为本实验的裸鼠移植瘤模型，经过约3年时间的液氮冻存后复苏，由右侧背部皮下接种改为下腹部皮下接种(此部位更有利于卵巢癌细胞的生长)，瘤细胞传至第16代时，生瘤潜伏期和荷瘤鼠生存期明显缩短，分别为5±1天和17±2天(细胞传代至11代时分别为10±2天和52±7天)，并提高了传代成功率，成功率由第11代时的98.3%提高到第16代的100.0%。因此，应用本实验模型，改用下腹部皮下接种，实验周期短，个体差异小，是进行裸鼠体内实验的良好模型。
本研究中，裸鼠在无菌条件下进行饲养，各组裸鼠均未出现明显的感染现象。CTL细胞和CD3-AK细胞进入机体后，一方面，它们可以产生直接的杀伤肿瘤细胞的作用；另一方面，它们分泌一些细胞因子[7]，调节机体的免疫功能。CTL细胞和CD3-AK细胞是否具有提高机体非特异性抗感染作用，有待进一步研究。
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1 陈毓仙，石卫，万云霞,等.可溶性肿瘤抗原和CD3单克隆抗体共同诱导的杀瘤细胞：T-AK细胞.中华微生物学和免疫学杂志,1995，15:293-296.
2 熊世钢，陈毓仙，吴爱如,等.两个人卵巢癌细胞系(COC1，COC2)的建立及特性.中华肿瘤杂志，1993，15:22-22.
3 熊世钢，吴爱如，陈毓仙,等.COC1n和COC2n两个人卵巢癌裸鼠移植瘤模型的建立及特性.中华肿瘤杂志，1992，14:396.
4 Rotzschke 0，Flak K. Naturally-occurring peptide antigens derived form the MHC class I-restricted processing pathway. Immunology Today，1991，12:447-453.
, 百拇医药
5 Ferrari M，Fornasiero C，Isstta M.MTT colorimetric assay for testing macrophage cytotoxic activity in vitro. J Immunol Meth，1990，131:165-172.
6 白云飞，张学庸，牟震先,等.CD3单克隆抗体活化的杀伤细胞对人胃癌细胞株MNK45体外杀伤及裸鼠体内抑制作用的实验研究.中华肿瘤杂志，1994，16:111-114.
7 张庆波，边洪荣，李晓强，等.卵巢癌细胞提取物免疫活性成分分析.华北煤炭医学院学报， 1997，12:1-3.
(收稿：1997-06-22 修回：1998-03-25), 百拇医药