卵巢上皮性癌肿瘤浸润淋巴细胞与腹水中肿瘤相关淋巴细胞生物学特性的比较
作者：康山 沈铿 郎景和 许秀英
单位：100730 中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院妇产科[康山(现在河北医科大学第四附属医院妇产科)，沈铿，郎景和，许秀英]
关键词：卵巢肿瘤；淋巴细胞；肿瘤浸润；淋巴细胞
中华妇产科杂志/981009 【摘要】 目的 比较卵巢上皮性癌肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)及腹水中肿瘤相关淋巴细胞(TAL)的生物学特性。方法 收集12例上皮性卵巢癌组织及腹水，并将其分为实体瘤、血性腹水和非血性腹水3组。将3组标本分别在体外进行TIL及TAL分离，并在自体肿瘤细胞(ATC)以及重组白细胞介素2(rIL-2)存在的条件下共同培养。其间应用流式细胞仪及4小时51Cr释放实验分别测定每组标本的淋巴细胞表型及其抗肿瘤活性。结果 3组淋巴细胞具有相似的CD3、CD4、CD8及CD25 4种表型。差异无显著性(P>0.05)。在全部培养过程中，每组标本CD4/CD8始终大于1。3组效应细胞均显示较高的NK杀伤活性(P>0.05)。实体瘤组TIL和非血性腹水组TAL在50∶1的效靶比时具有明显的抗ATC特异性，而血性腹水组TAL未显示这种特异性，经51Cr检测的杀伤活性分别为30.2%～51.0%和10.8%～15.8%，差异有极显著性(P<0.01)。结论 卵巢上皮性癌TIL及其非血性腹水组TAL具有相似的生物学特性。
, 百拇医药
The Comparsion of Biological Characteristics between Tumor-Infiltrating Lymphocytes and Tumor-Associa-ted Lymphocytes in Ascites of Epithelial Ovarian Carcinoma Kang Shan, Shen Keng, Lang Jinghe, et al. *Fourth Affiliated Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011
【Abstract】 Objective To compare biological charicteristics between tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) and tumor-associated lymphocytes (TAL) in epithelial ovarian carcinomas. Methods The surgical samples of four ovarian specimens and eight cancer ascites from epithelial ovarian carcinoma were collected, and ascites were divided into bloody and non-bloody groups. The cancer tissue was dissected to yield single cells suspensions. TIL and TAL were grown in coculture with autologous tumor cells and 500 U/ml recombinant interleukin-2 (rIL-2). Phenotype was studied using flow cytometry for a varity of human immunocompetent cell surface markers (CD3, CD4, CD8, CD25). Cytotoxicity was investigated using 4-hr 51 Cr-release assays with primary ovarian carcinoma cell cultures and the CAOV3 cell line and the K562 cell line as target cells in cultured period. Results (1) There was no significant difference in CD3, CD4, CD8 and CD25 expression among the three groups (P>0.05). CD4 to CD8 (CD4/CD8) ratio was consistently more than 1 in cultured period. (2) In all three groups, Natural killer (NK) acitivity was high and no difference among them (P>0.05). (3) In all twelve cases, TIL and TAL in the non-bloody ascites possess higher potential to lyse the autologous tumor target than TAL in the bloody ascites (P<0.01) when effector cell to target cell (E∶T) was 50 to 1 (50∶1). Lytic activity was 30.2%～51.0% and 10.8%～15.8% respectively. Conclusions TIL and TAL in non-bloody ascites in epithelial ovarian cancer have the same biological characteristics.
, 百拇医药
【Key words】 Ovarian neoplasms Lymphocytes, tumor-infiltrating Lymphocytes
肿瘤细胞减灭术及联合化疗，在卵巢癌的治疗中起到了积极作用，但在过去的20年中，卵巢癌的5年生存率一直未得到改善。因此，积极寻找一种与传统方法不同的新的治疗策略显得尤为重要。近10年来，临床医师在细胞过继免疫治疗方面进行了有益的探讨。1986年，Rosenberg等[1]从小鼠体内分离出肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes, TIL)，之后从卵巢癌腹水中得到肿瘤相关淋巴细胞(tumor-associated lymphocytes, TAL)，都标志着这方面的工作的不断深入。本研究对TIL与TAL的生物学特性进行比较，现报道如下。
资料与方法
一、研究对象
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全部标本为1997年3月至5月，共12例卵巢上皮性癌住院病人的手术切除标本和腹水抽取标本，并经病理学和细胞学检查证实诊断。12例中，实体瘤4例(实体瘤)；腹水8例，其中血性腹水4例(血性腹水组)，非血性腹水4例(非血性腹水组)。恶性卵巢肿瘤分期按FIGO标准(1988年)。全部病例均为Ⅲ期。
4例实体瘤病人中，3例术前未接受过任何治疗；1例术前接受过1次探查术及术后2个疗程的PC方案(顺铂、环磷酰胺)化疗。4例非血性腹水中2例为复发病人，复发前接受过手术和含顺铂的化疗；1例接受过抗结核治疗；1例接受过探查术及4个疗程的含顺铂的化疗。4例血性腹水中，3例未接受过任何治疗；1例为复发病人，复发前接受过手术及含顺铂的化疗。
二、组织标本的收集
实体瘤标本均在手术中无菌采集，重量5 g左右，取材部位位于原发灶，2小时内完成淋巴细胞的提取；腹水标本在病人住院期间放腹水时无菌收集400～600 ml，同样2小时内完成淋巴细胞的提取。
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三、TIL及TAL的提取及培养
1.实体瘤：无菌采集手术标本5 g左右，机械剪碎成1～3 mm3的组织碎块，在300目尼龙网上轻轻研磨、冲洗，收集网下的过滤液，以1 000 r/min离心5分钟，弃上清液，收集离心管底部的细胞成分，悬浮于20 ml Hank's液中，辅此液于等体积的Ficoll-Hypaque液面之上离心，400 g、20分钟。Ficoll-Hypaque液面上为富含TIL和自体肿瘤细胞(auto-tumor cell, ATC)的细胞层。收集后以Hank's液洗涤，取细胞成分进行细胞学涂片，瑞氏染色，光镜下判定含TIL及TAL的百分比。取1/2量细胞成分用液氮冻存(复苏后作为自体肿瘤靶细胞)，另1/2量细胞成分以5×105～1×106/ml密度悬浮于含双抗、5%人AB血清、2 mmol/ml L-谷氨酰胺、重组白细胞介素2(rIL-2) 500 U/ml(中国通化药业产品)的PRMI-1640培养基中，在37℃、5% CO2环境中进行连续培养，视细胞生长情况，每隔3～5天半量换液。培养过程中行细胞学涂片，瑞氏染色，观察ATC消失的时间。计数TIL和TAL增殖情况。
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2.腹水：收集腹水400～600 ml进行离心，收集细胞成分悬浮于20 ml Hank's液中，以下步骤同实体瘤。
四、流式细胞术检测TIL及TAL表型
在培养前及培养过程中，每隔10天应用流式细胞仪检测每例标本CD3、CD4、CD8及CD25 4种表型，至第60天。
五、TIL及TAL抗肿瘤活性的测定
本研究采用51Cr标准4小时释放实验，测定效应细胞TIL及TAL的抗肿瘤活性。采用同位素铬胺酸钠(美国杜帮公司产品) 1 mCi/ml。实验中用100 μCi标记2×106靶细胞。靶细胞K562为NK杀伤敏感细胞(由中国协和医科大学基础所徐建青博士惠赠)，用其测定效应细胞的NK杀伤活性；同种异体卵巢癌靶细胞CAOV3为建系细胞株(由北京协和医院妇产科肿瘤免疫室维持)；ATC为液氮冻存复苏后的自体肿瘤靶细胞。此项检测在培养的第30～60天内进行，效靶比为50∶1、25∶1、10∶1。
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六、数据处理
本研究采用t检验进行均数比较。
结果
一、TIL及TAL分离及培养情况
由实体瘤及腹水中提取的细胞成分经胎盼蓝染色，96%～100%为活细胞。ATC在培养过程的9～18天内消失。见表1。
二、表型分析
在各培养时间点，3组淋巴细胞平均CD3、CD4、CD8及CD25 4种表型结果比较，差异无显著性(P>0.05)。在培养过程中，4种细胞表型变化幅度较小，均略有增长。未见到某一种表型在某一时期的大幅度下降或增长，CD4/CD8始终大于1。见表2。
三、TIL及TAL的抗肿瘤活性
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实验结果表明，在杀伤ATC方面，当效靶比为50∶1时，作为效应细胞，实体瘤组TIL及非血性腹水组TAL均显示出明显的特异性，而血性腹水组TAL未见到这种特异性，杀伤活性分别为30.2%～51.0%和10.8～15.8%”与前两组比较，差异有极显著性(P<0.01)。而对同种异体来源的卵巢癌细胞株CAOV3的杀伤力，除血性腹水组1例显示出高达72%的杀伤力外(效靶比为50∶1)，其余均较低。此外在杀伤NK敏感细胞K562时，3组效应细胞均显示出明显的杀伤活性，差异无显著性(P>0.05)。
表1 TIL和TAL的提取以及培养情况 细胞分类
细胞来源
所获细胞数
(个)
TIL及TAL
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百分比(%)
培养初期TIL
及TAL数(个)
培养天数
扩增后TIL
及TAL数(个)
扩增倍数
TAL
1a
非血性腹水
4.8×106
46
, 百拇医药
1.1×106
38
6.9×108
627
2a
非血性腹水
1.0×107
76
3.8×106
42
2.9×109
, 百拇医药 763
3a
非血性腹水
3.2×106
52
8.0×105
50
2.6×108
325
4a
非血性腹水
8.9×106
, 百拇医药
62
2.8×106
40
3.8×109
1 325
9a
血性腹水
1.2×108
32
1.9×107
46
3.4×1010
, http://www.100md.com
1 789
10a
血性腹水
1.7×108
42
3.6×107
48
1.0×1010
278
11a
血性腹水
1.8×108
, 百拇医药
51
4.6×107
52
2.3×1010
500
12a
血性腹水
8.8×107
38
1.7×107
32
1.4×1010
, http://www.100md.com
823
TIL
5b
实体瘤
8.0×106
38
1.5×106
56
6.4×108
426
6b
实体瘤
, http://www.100md.com
5.6×106
48
1.3×106
50
6.8×108
523
7b
实体瘤
8.0×106
56
2.2×106
, http://www.100md.com 60
1.3×109
590
8b
实体瘤
1.4×107
51
3.6×106
60
8.8×108
244
表2 TAL及TIL的表型分析(%，
±s) 细胞表型
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TAL1a～TAL4a
TAL9a～TAL12a
TIL5b～TIL8b
0天
30天
60天
0天
30天
60天
0天
30天
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60天
CD3
50.7±0.8
59.2±2.4
61.5±1.1
53.9±3.5
58.7±4.2
61.1±2.5
50.7±2.1
61.8±2.9
63.4±4.1
CD4
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30.5±1.5
33.0±2.4
34.4±2.2
29.8±4.2
34.1±2.4
31.9±1.6
28.5±1.4
36.2±1.9
33.8±1.5
CD8
22.8±1.2
24.5±2.8
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26.4±0.4
23.0±2.3
23.9±1.5
24.4±3.1
21.5±0.4
25.7±1.3
26.8±1.6
CD25
18.6±1.1
22.5±1.7
25.3±0.9
19.5±2.3
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24.8±2.4
25.6±3.3
19.0±2.9
23.4±2.2
26.4±0.6
讨论
卵巢上皮性癌通常存在大量的淋巴细胞浸润，在某些肿瘤，其浸润的程度与预后有关[2]。盆腹腔脏器及腹膜的广泛种植性转移为卵巢癌的一大特点，在这些转移灶的表面会脱落大量的肿瘤细胞和淋巴细胞种植到腹腔。因此，作为一种特殊类型的TIL与TAL，都有与肿瘤细胞密切接触的生存环境，而TAL较TIL更易获得。另外，在过继免疫治疗中，这些效应细胞重新又回到原来生存的环境。因此，证实TAL与TIL具有相类似的抗肿瘤活性，就会为卵巢上皮性癌的过继免疫治疗提供一条更为简便的途径。
, 百拇医药
一、TIL的分离及培养
以往的从恶性实体瘤中分离TIL的方法有Topalian法[3]和Whiteside法[4]。本研究采用的方法为前者，并对部分步骤进行了改动，取消了复合酶消化这一耗时较长且易污染的步骤，使之更适于实验规模的研究。从细胞的得到率及扩增倍数来看，每5 g组织得到的细胞数低于前者，但最终扩增的倍数高于前者。这可能是由于在我们的分离过程中，淋巴细胞未受到消化酶的损伤。血性腹水组TAL含量高于非血性腹水组，其原因在于其中参杂了大量外周血，但最终的扩增量并未明显高于后者。在培养过程中，ATC的消失时间在9～18天内，与国外报道的9～28天相似[3]。
新分离的TIL及TAL是以CD3 T淋巴细胞为主的非均一性细胞群，其中CD3 T淋巴细胞分别为48%～97%及73%～97%，间有少量的NK细胞、巨噬细胞及多核巨细胞。而CD4或CD8 T淋巴细胞的变动范围较大[5]，但也有较恒定分布的报道，其中CD4T细胞略多于CD8 T细胞，CD4/CD8 >1[6]。后者与本研究的结果相似，不同的是在培养过程中，尽管CD8 T细胞也有所增加，但CD4 T细胞始终多于CD8 T细胞。本研究显示，TIL及两组TAL有相似的CD3、CD4、CD8及CD25表型，差异无显著性。
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二、TIL的抗肿瘤活性
在抗肿瘤活性方面，TIL显示出主动的、抗原特异的抗肿瘤能力[7]。这与本研究结果一致。进一步的研究证实，这种特异的抗肿瘤活性与疾病的预后相关[7]。而且，这种抗肿瘤能力的表达在体内外是一致的，即体外培养的具有较高细胞毒性的TIL，在输回病人体内后也同样会有明显的抗肿瘤疗效[8]。我们认为，这是由于TIL在原位受到肿瘤表面抗原的长期刺激，以及在培养过程中有肿瘤抗原的不断刺激，使TIL具有对ATC的特异性和较高的杀伤活性。另外，在本研究中，TIL与非血性腹水组的TAL只在效靶比为50∶1时，呈现出明显的ATC杀伤特异性，提示特异性的表现还需要一定数量的效应细胞做前提，这可能是临床治疗效果不明显的原因之一。
对于TAL的抗肿瘤能力，各研究者的观点不相一致。有研究结果显示，新分离的TAL单独与rIL-2培养5天后，没有或只有极低的细胞毒活性，但在与ATC共同培养后即可显示有效的抗肿瘤活性[9，10]。说明培养过程中ATC存在的重要性。有报道，TAL的抗肿瘤活性是非特异性的。本研究显示，血性腹水组TAL的抗肿瘤活性为非特异性的，而非血性腹水组TAL则显示特异的抗肿瘤活性。这可能与血性腹水组中存在的淋巴细胞大多来源于外周血，未经历ATC的长久刺激有关。同时也说明，肿瘤原位ATC刺激对于抗肿瘤特异性表达的重要性。
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另外，TIL及TAL还都显示出明显的NK杀伤活性，表明在肿瘤组织中同时存在两种效应细胞，NK细胞及特异性细胞毒T淋巴细胞[11]，这两种潜在的效应细胞在肿瘤原位呈非激活状态，在体外激活后显示出抗肿瘤活性。
本研究结果显示，卵巢癌TIL及其非血性腹水TAL具有相似的生物学特性。这样即可在临床处理腹水的同时获得TAL，及时用于治疗；同时也可使无法获得肿瘤标本或丧失手术机会的病人，得到过继细胞免疫治疗，弥补了单纯依靠从实体瘤获得TIL的局限性，为临床应用过继细胞免疫治疗找到一条新的途径。当然，最终的治疗效果还需临床验证。
参考文献
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3 Topalian SL, Muul LM, Solomon D, et al. Expansion of human tumor infiltrating lymphocytes for use in immunotherapy trials. J Immunol Methods, 1987, 102:127-134.
4 Whiteside TL, Miescher S, MacDonald HR, et al. Separation of tumor-infiltrating lymphocytes from tumor cells in human solid tumors. J Immunol Methods, 1986, 90:221-228.
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5 Han AX, Papadopoulos J. Tumor lymphocytes in patiens with advanced ovarian cancer: changes during in vitro culture and implications for immunotherapy. Gynecol Oncol, 1996, 65:391-398.
6 Whiteside TL, Miescher S, Hurlimann J, et al. Clonal analysis and in situ characterization of lymphocytes infiltrating human breast carcinomas. Cancer Immunol Immunolther, 1986, 23:169-176.
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10 Boyer P, Berek JS, Zighelboim J, et al. Lymphocyte activation by recombinant interleukin-2 in ovarian cancer patients. Obstet Gynecol, 1989, 73:793-797.
11 Zocchi MR, Ferrarini M, Rugarli C, et al. Selective lysis of the autologous tumor by δTCS1+γ/δ+ tumor infiltrating lymphocytes from human lung carcinoma. Eur J Immunol, 1990, 20:2685-2691.
本研究受高等学校博士学科点专项科研基金和中华医学基金会联合师资培养基金资助
(收稿：1997-11-26 修回：1998-06-25), 百拇医药
单位：100730 中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院妇产科[康山(现在河北医科大学第四附属医院妇产科)，沈铿，郎景和，许秀英]
关键词：卵巢肿瘤；淋巴细胞；肿瘤浸润；淋巴细胞
中华妇产科杂志/981009 【摘要】 目的 比较卵巢上皮性癌肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)及腹水中肿瘤相关淋巴细胞(TAL)的生物学特性。方法 收集12例上皮性卵巢癌组织及腹水，并将其分为实体瘤、血性腹水和非血性腹水3组。将3组标本分别在体外进行TIL及TAL分离，并在自体肿瘤细胞(ATC)以及重组白细胞介素2(rIL-2)存在的条件下共同培养。其间应用流式细胞仪及4小时51Cr释放实验分别测定每组标本的淋巴细胞表型及其抗肿瘤活性。结果 3组淋巴细胞具有相似的CD3、CD4、CD8及CD25 4种表型。差异无显著性(P>0.05)。在全部培养过程中，每组标本CD4/CD8始终大于1。3组效应细胞均显示较高的NK杀伤活性(P>0.05)。实体瘤组TIL和非血性腹水组TAL在50∶1的效靶比时具有明显的抗ATC特异性，而血性腹水组TAL未显示这种特异性，经51Cr检测的杀伤活性分别为30.2%～51.0%和10.8%～15.8%，差异有极显著性(P<0.01)。结论 卵巢上皮性癌TIL及其非血性腹水组TAL具有相似的生物学特性。
, 百拇医药
The Comparsion of Biological Characteristics between Tumor-Infiltrating Lymphocytes and Tumor-Associa-ted Lymphocytes in Ascites of Epithelial Ovarian Carcinoma Kang Shan, Shen Keng, Lang Jinghe, et al. *Fourth Affiliated Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011
【Abstract】 Objective To compare biological charicteristics between tumor-infiltrating lymphocytes (TIL) and tumor-associated lymphocytes (TAL) in epithelial ovarian carcinomas. Methods The surgical samples of four ovarian specimens and eight cancer ascites from epithelial ovarian carcinoma were collected, and ascites were divided into bloody and non-bloody groups. The cancer tissue was dissected to yield single cells suspensions. TIL and TAL were grown in coculture with autologous tumor cells and 500 U/ml recombinant interleukin-2 (rIL-2). Phenotype was studied using flow cytometry for a varity of human immunocompetent cell surface markers (CD3, CD4, CD8, CD25). Cytotoxicity was investigated using 4-hr 51 Cr-release assays with primary ovarian carcinoma cell cultures and the CAOV3 cell line and the K562 cell line as target cells in cultured period. Results (1) There was no significant difference in CD3, CD4, CD8 and CD25 expression among the three groups (P>0.05). CD4 to CD8 (CD4/CD8) ratio was consistently more than 1 in cultured period. (2) In all three groups, Natural killer (NK) acitivity was high and no difference among them (P>0.05). (3) In all twelve cases, TIL and TAL in the non-bloody ascites possess higher potential to lyse the autologous tumor target than TAL in the bloody ascites (P<0.01) when effector cell to target cell (E∶T) was 50 to 1 (50∶1). Lytic activity was 30.2%～51.0% and 10.8%～15.8% respectively. Conclusions TIL and TAL in non-bloody ascites in epithelial ovarian cancer have the same biological characteristics.
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【Key words】 Ovarian neoplasms Lymphocytes, tumor-infiltrating Lymphocytes
肿瘤细胞减灭术及联合化疗，在卵巢癌的治疗中起到了积极作用，但在过去的20年中，卵巢癌的5年生存率一直未得到改善。因此，积极寻找一种与传统方法不同的新的治疗策略显得尤为重要。近10年来，临床医师在细胞过继免疫治疗方面进行了有益的探讨。1986年，Rosenberg等[1]从小鼠体内分离出肿瘤浸润淋巴细胞(tumor-infiltrating lymphocytes, TIL)，之后从卵巢癌腹水中得到肿瘤相关淋巴细胞(tumor-associated lymphocytes, TAL)，都标志着这方面的工作的不断深入。本研究对TIL与TAL的生物学特性进行比较，现报道如下。
资料与方法
一、研究对象
, http://www.100md.com
全部标本为1997年3月至5月，共12例卵巢上皮性癌住院病人的手术切除标本和腹水抽取标本，并经病理学和细胞学检查证实诊断。12例中，实体瘤4例(实体瘤)；腹水8例，其中血性腹水4例(血性腹水组)，非血性腹水4例(非血性腹水组)。恶性卵巢肿瘤分期按FIGO标准(1988年)。全部病例均为Ⅲ期。
4例实体瘤病人中，3例术前未接受过任何治疗；1例术前接受过1次探查术及术后2个疗程的PC方案(顺铂、环磷酰胺)化疗。4例非血性腹水中2例为复发病人，复发前接受过手术和含顺铂的化疗；1例接受过抗结核治疗；1例接受过探查术及4个疗程的含顺铂的化疗。4例血性腹水中，3例未接受过任何治疗；1例为复发病人，复发前接受过手术及含顺铂的化疗。
二、组织标本的收集
实体瘤标本均在手术中无菌采集，重量5 g左右，取材部位位于原发灶，2小时内完成淋巴细胞的提取；腹水标本在病人住院期间放腹水时无菌收集400～600 ml，同样2小时内完成淋巴细胞的提取。
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三、TIL及TAL的提取及培养
1.实体瘤：无菌采集手术标本5 g左右，机械剪碎成1～3 mm3的组织碎块，在300目尼龙网上轻轻研磨、冲洗，收集网下的过滤液，以1 000 r/min离心5分钟，弃上清液，收集离心管底部的细胞成分，悬浮于20 ml Hank's液中，辅此液于等体积的Ficoll-Hypaque液面之上离心，400 g、20分钟。Ficoll-Hypaque液面上为富含TIL和自体肿瘤细胞(auto-tumor cell, ATC)的细胞层。收集后以Hank's液洗涤，取细胞成分进行细胞学涂片，瑞氏染色，光镜下判定含TIL及TAL的百分比。取1/2量细胞成分用液氮冻存(复苏后作为自体肿瘤靶细胞)，另1/2量细胞成分以5×105～1×106/ml密度悬浮于含双抗、5%人AB血清、2 mmol/ml L-谷氨酰胺、重组白细胞介素2(rIL-2) 500 U/ml(中国通化药业产品)的PRMI-1640培养基中，在37℃、5% CO2环境中进行连续培养，视细胞生长情况，每隔3～5天半量换液。培养过程中行细胞学涂片，瑞氏染色，观察ATC消失的时间。计数TIL和TAL增殖情况。
, http://www.100md.com
2.腹水：收集腹水400～600 ml进行离心，收集细胞成分悬浮于20 ml Hank's液中，以下步骤同实体瘤。
四、流式细胞术检测TIL及TAL表型
在培养前及培养过程中，每隔10天应用流式细胞仪检测每例标本CD3、CD4、CD8及CD25 4种表型，至第60天。
五、TIL及TAL抗肿瘤活性的测定
本研究采用51Cr标准4小时释放实验，测定效应细胞TIL及TAL的抗肿瘤活性。采用同位素铬胺酸钠(美国杜帮公司产品) 1 mCi/ml。实验中用100 μCi标记2×106靶细胞。靶细胞K562为NK杀伤敏感细胞(由中国协和医科大学基础所徐建青博士惠赠)，用其测定效应细胞的NK杀伤活性；同种异体卵巢癌靶细胞CAOV3为建系细胞株(由北京协和医院妇产科肿瘤免疫室维持)；ATC为液氮冻存复苏后的自体肿瘤靶细胞。此项检测在培养的第30～60天内进行，效靶比为50∶1、25∶1、10∶1。
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六、数据处理
本研究采用t检验进行均数比较。
结果
一、TIL及TAL分离及培养情况
由实体瘤及腹水中提取的细胞成分经胎盼蓝染色，96%～100%为活细胞。ATC在培养过程的9～18天内消失。见表1。
二、表型分析
在各培养时间点，3组淋巴细胞平均CD3、CD4、CD8及CD25 4种表型结果比较，差异无显著性(P>0.05)。在培养过程中，4种细胞表型变化幅度较小，均略有增长。未见到某一种表型在某一时期的大幅度下降或增长，CD4/CD8始终大于1。见表2。
三、TIL及TAL的抗肿瘤活性
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实验结果表明，在杀伤ATC方面，当效靶比为50∶1时，作为效应细胞，实体瘤组TIL及非血性腹水组TAL均显示出明显的特异性，而血性腹水组TAL未见到这种特异性，杀伤活性分别为30.2%～51.0%和10.8～15.8%”与前两组比较，差异有极显著性(P<0.01)。而对同种异体来源的卵巢癌细胞株CAOV3的杀伤力，除血性腹水组1例显示出高达72%的杀伤力外(效靶比为50∶1)，其余均较低。此外在杀伤NK敏感细胞K562时，3组效应细胞均显示出明显的杀伤活性，差异无显著性(P>0.05)。
表1 TIL和TAL的提取以及培养情况 细胞分类
细胞来源
所获细胞数
(个)
TIL及TAL
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百分比(%)
培养初期TIL
及TAL数(个)
培养天数
扩增后TIL
及TAL数(个)
扩增倍数
TAL
1a
非血性腹水
4.8×106
46
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1.1×106
38
6.9×108
627
2a
非血性腹水
1.0×107
76
3.8×106
42
2.9×109
, 百拇医药 763
3a
非血性腹水
3.2×106
52
8.0×105
50
2.6×108
325
4a
非血性腹水
8.9×106
, 百拇医药
62
2.8×106
40
3.8×109
1 325
9a
血性腹水
1.2×108
32
1.9×107
46
3.4×1010
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1 789
10a
血性腹水
1.7×108
42
3.6×107
48
1.0×1010
278
11a
血性腹水
1.8×108
, 百拇医药
51
4.6×107
52
2.3×1010
500
12a
血性腹水
8.8×107
38
1.7×107
32
1.4×1010
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823
TIL
5b
实体瘤
8.0×106
38
1.5×106
56
6.4×108
426
6b
实体瘤
, http://www.100md.com
5.6×106
48
1.3×106
50
6.8×108
523
7b
实体瘤
8.0×106
56
2.2×106
, http://www.100md.com 60
1.3×109
590
8b
实体瘤
1.4×107
51
3.6×106
60
8.8×108
244
表2 TAL及TIL的表型分析(%，
±s) 细胞表型, http://www.100md.com
TAL1a～TAL4a
TAL9a～TAL12a
TIL5b～TIL8b
0天
30天
60天
0天
30天
60天
0天
30天
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60天
CD3
50.7±0.8
59.2±2.4
61.5±1.1
53.9±3.5
58.7±4.2
61.1±2.5
50.7±2.1
61.8±2.9
63.4±4.1
CD4
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30.5±1.5
33.0±2.4
34.4±2.2
29.8±4.2
34.1±2.4
31.9±1.6
28.5±1.4
36.2±1.9
33.8±1.5
CD8
22.8±1.2
24.5±2.8
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26.4±0.4
23.0±2.3
23.9±1.5
24.4±3.1
21.5±0.4
25.7±1.3
26.8±1.6
CD25
18.6±1.1
22.5±1.7
25.3±0.9
19.5±2.3
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24.8±2.4
25.6±3.3
19.0±2.9
23.4±2.2
26.4±0.6
讨论
卵巢上皮性癌通常存在大量的淋巴细胞浸润，在某些肿瘤，其浸润的程度与预后有关[2]。盆腹腔脏器及腹膜的广泛种植性转移为卵巢癌的一大特点，在这些转移灶的表面会脱落大量的肿瘤细胞和淋巴细胞种植到腹腔。因此，作为一种特殊类型的TIL与TAL，都有与肿瘤细胞密切接触的生存环境，而TAL较TIL更易获得。另外，在过继免疫治疗中，这些效应细胞重新又回到原来生存的环境。因此，证实TAL与TIL具有相类似的抗肿瘤活性，就会为卵巢上皮性癌的过继免疫治疗提供一条更为简便的途径。
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一、TIL的分离及培养
以往的从恶性实体瘤中分离TIL的方法有Topalian法[3]和Whiteside法[4]。本研究采用的方法为前者，并对部分步骤进行了改动，取消了复合酶消化这一耗时较长且易污染的步骤，使之更适于实验规模的研究。从细胞的得到率及扩增倍数来看，每5 g组织得到的细胞数低于前者，但最终扩增的倍数高于前者。这可能是由于在我们的分离过程中，淋巴细胞未受到消化酶的损伤。血性腹水组TAL含量高于非血性腹水组，其原因在于其中参杂了大量外周血，但最终的扩增量并未明显高于后者。在培养过程中，ATC的消失时间在9～18天内，与国外报道的9～28天相似[3]。
新分离的TIL及TAL是以CD3 T淋巴细胞为主的非均一性细胞群，其中CD3 T淋巴细胞分别为48%～97%及73%～97%，间有少量的NK细胞、巨噬细胞及多核巨细胞。而CD4或CD8 T淋巴细胞的变动范围较大[5]，但也有较恒定分布的报道，其中CD4T细胞略多于CD8 T细胞，CD4/CD8 >1[6]。后者与本研究的结果相似，不同的是在培养过程中，尽管CD8 T细胞也有所增加，但CD4 T细胞始终多于CD8 T细胞。本研究显示，TIL及两组TAL有相似的CD3、CD4、CD8及CD25表型，差异无显著性。
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二、TIL的抗肿瘤活性
在抗肿瘤活性方面，TIL显示出主动的、抗原特异的抗肿瘤能力[7]。这与本研究结果一致。进一步的研究证实，这种特异的抗肿瘤活性与疾病的预后相关[7]。而且，这种抗肿瘤能力的表达在体内外是一致的，即体外培养的具有较高细胞毒性的TIL，在输回病人体内后也同样会有明显的抗肿瘤疗效[8]。我们认为，这是由于TIL在原位受到肿瘤表面抗原的长期刺激，以及在培养过程中有肿瘤抗原的不断刺激，使TIL具有对ATC的特异性和较高的杀伤活性。另外，在本研究中，TIL与非血性腹水组的TAL只在效靶比为50∶1时，呈现出明显的ATC杀伤特异性，提示特异性的表现还需要一定数量的效应细胞做前提，这可能是临床治疗效果不明显的原因之一。
对于TAL的抗肿瘤能力，各研究者的观点不相一致。有研究结果显示，新分离的TAL单独与rIL-2培养5天后，没有或只有极低的细胞毒活性，但在与ATC共同培养后即可显示有效的抗肿瘤活性[9，10]。说明培养过程中ATC存在的重要性。有报道，TAL的抗肿瘤活性是非特异性的。本研究显示，血性腹水组TAL的抗肿瘤活性为非特异性的，而非血性腹水组TAL则显示特异的抗肿瘤活性。这可能与血性腹水组中存在的淋巴细胞大多来源于外周血，未经历ATC的长久刺激有关。同时也说明，肿瘤原位ATC刺激对于抗肿瘤特异性表达的重要性。
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另外，TIL及TAL还都显示出明显的NK杀伤活性，表明在肿瘤组织中同时存在两种效应细胞，NK细胞及特异性细胞毒T淋巴细胞[11]，这两种潜在的效应细胞在肿瘤原位呈非激活状态，在体外激活后显示出抗肿瘤活性。
本研究结果显示，卵巢癌TIL及其非血性腹水TAL具有相似的生物学特性。这样即可在临床处理腹水的同时获得TAL，及时用于治疗；同时也可使无法获得肿瘤标本或丧失手术机会的病人，得到过继细胞免疫治疗，弥补了单纯依靠从实体瘤获得TIL的局限性，为临床应用过继细胞免疫治疗找到一条新的途径。当然，最终的治疗效果还需临床验证。
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本研究受高等学校博士学科点专项科研基金和中华医学基金会联合师资培养基金资助
(收稿：1997-11-26 修回：1998-06-25), 百拇医药