子宫颈癌患者肿瘤坏死因子及T淋巴细胞亚群的检测
作者：侯晓彤 宋现让 盛修贵 梁焕玲 谭秀云 杨秀英
单位：250117 济南，山东省肿瘤防治研究院
关键词：
中华妇产科杂志981117 自20多年前E玫瑰花环试验报道以来，又先后有人研究证实再生障碍性贫血、白血病、肝癌及卵巢癌等患者的T淋巴细胞亚群比例失调及免疫功能紊乱[1，2]。本研究通过对子宫颈癌患者治疗前后T淋巴细胞亚群、肿瘤坏死因子(TNF)的检测，期望能对子宫颈癌患者的免疫功能状况有较全面的了解，进一步提出临床治疗的检测指标。
一、材料与方法
1.研究对象：病例选自1994年9月至1995年1月，经病理检查证实并在我院治疗的Ⅱb～Ⅲb期子宫颈鳞癌患者42例，为肿瘤组，平均年龄58.3岁。42例子宫颈鳞癌中高分化1例、中分化23例、低分化18例。另选择正常献血员20例作为对照组。子宫颈癌患者确诊后均行放射治疗，治疗前后分别抽取空腹静脉血，加肝素抗凝，收集血浆并常规分离外周血单个核细胞。每毫升血浆中加0.1M苯*****10 μl，-20℃保存。外周血单个核细胞调成一定浓度，用于T淋巴细胞亚群检测和TNF诱生试验。对照组静脉血同法处理。
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2.T淋巴细胞亚群检查：采用CD3、CD4、CD8单克隆抗体致敏的羊红细胞花环形成法(试剂盒购自卫生部武汉生物制品研究所)。具体操作为：外周血单个核细胞去粘附细胞后用含2%小牛血清的RPMI 1640培养液，浓度为1.5×106/ml，每份标本设置3孔，加入细胞悬液100 μl，分别加入抗CD3、CD4、CD8单克隆抗体致敏红细胞悬液20 μl，混匀，以500 r/min离心30秒钟，置室温1小时后，于4℃放置4～6小时，然后取细胞涂片，瑞氏染色计数花环形成百分率为各亚群细胞百分率。
3.TNF诱生试验：将分离的外周血单个核细胞用含5%人AB血清的RPMI 1640培养悬浮细胞，调至细胞浓度为4×106/ml，用24孔细胞培养板，每孔加细胞1 ml，脂多糖(LPS) 2 μg/ml，于37℃ 5%CO2条件下培养24小时，离心收集上清液后加0.1苯*****10 μl/ml，-20℃保存，与血浆标本一起检测TNF含量。
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4.TNF检测：采用军事科学院生产的TNF检测试剂盒检测。方法为：取出已用抗TNF单克隆抗体包被的反应板，加不同稀释度的TNF标准品和待测血浆及诱生上清标本，每孔100 μl，放置湿盒内室温2小时，洗板3次后加已稀释的酶标免抗TNF，每孔100 μl，于湿盒内室温1小时洗板3次后，加新配底物缓冲液每孔100 μl，室温避光反应直至标准曲线显示时加2MH2SO4 50μl终止反应，绘制标准曲线，计算样品TNF含量。
5.治疗方法：本组患者均为Ⅱb～Ⅲb期，治疗以放射治疗为主，部分Ⅱb期患者行广泛性全子宫切除加盆腔淋巴结清扫术，对于病理分化差或局部肿瘤直径>4cm者，放疗前给予2周期化疗。本组患者治疗后均采用信访及定期门诊复查两种形式长期随访。
二、结果
1.T淋巴细胞亚群分布：肿瘤组治疗前与治疗后CD3、CD4、CD8与对照组比较，均明显为低，差异有极显著性(P均<0.01)。治疗后CD3、CD4较治疗前有所提高，差异有显著性(P<0.05)。见表1。
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2.TNF含量：肿瘤组血浆TNF含量明显高于对照组，差异有极显著性(P<0.01)。治疗后较治疗前明显下降，差异有极显著性(P<0.01)。见表2。病理分化程度为高分化者，TNF为1.16 μg/L；中分化者为1.385±0.80 μg/L(
±s)；低分化者为1.682±1.10 μg/L(±s)。分化程度越低，TNF含量越高，差异有显著性(P<0.05)。
表1 淋巴细胞亚群分布(±s) 组别
例数
CD3
, http://www.100md.com CD4
CD8
CD4/CD8
肿瘤组
治疗前
42
52.3±9.06
32.2±6.37
23.7±5.62
1.36±0.31
治疗后
42
, 百拇医药
55.9±5.45
35.0±5.70
23.3±3.83
1.54±0.36
对照组
20
65.6±9.10
40.7±9.71
28.3±7.29
1.42±0.31
表2 两组TNF含量 组别
例数
, http://www.100md.com
TNF
(μg/L,±s)
肿瘤组
治疗前
42
1.536±1.020
治疗后
42
1.021±0.435
对照组
20
0.802±0.273
, http://www.100md.com
3.TNF诱导产生情况：肿瘤组外周血单个核细胞诱导产生TNF的能力明显低于对照组，差异有极显著性(P<0.01)。治疗后较治疗前有所提高，但差异无显著性(P>0.05)。见表3。表3 两组TNF诱导含量
组别
例数
TNF
(μg/L,±s)
肿瘤组
治疗前
42
2.31±0.923
, 百拇医药
治疗后
42
2.73±1.032
对照组
20
3.78±0.642
三、讨论
1.T淋巴细胞亚群测定：T淋巴细胞亚群的测定能反映宫颈癌患者的免疫状况，恶性肿瘤患者细胞免疫功能受到不同程度的抑制[1，2]。本工作T淋巴细胞亚群检测结果表明，宫颈癌患者CD3、CD4、CD8均较正常人明显降低(P<0.01)，治疗后较治疗前，CD3、CD4有明显提高，CD4/CD8也有所提高，说明宫颈癌患者治疗后肿瘤对机体的侵害乃至机体的免疫功能的抑制状况明显改善。但与正常人的差异说明，机体完全恢复还需要较长的时间。
, 百拇医药
2.TNF含量的测定能反映宫颈癌的病理分化程度：本工作宫颈癌患者血浆TNF水平与外周血单核细胞经LPS诱导产生TNF的能力提示，宫颈癌患者血浆中，由于受肿瘤抗原的不断刺激，TNF的含量提高，与诱导产生TNF的能力不一致。随着肿瘤的进展，分化程度的降低，TNF呈上升趋势，整个机体的免疫状况处于受抑制的状态。经过治疗后肿瘤对机体的侵害受到控制，诱导产生TNF的能力有所提高，机体的免疫状况得到改善，血浆中的TNF较治疗前有所下降。
本研究结果均提示，宫颈癌患者的免疫功能不同程度地受到抑制，治疗后可得到改善。今后还须增加病例数，延长随访时间，深入探讨，使T淋巴细胞亚群测定及TNF含量测定有可能成为检测宫颈癌治疗效果的指标。
参考文献
1 赵恩锋，周美清，傅模，等.重组人肿瘤坏死因子对卵巢癌细胞的毒性作用.中华妇产科杂志，1993，28：153-156.
2 吕时铭，石一复.卵巢肿瘤患者外周血肿瘤坏死因子的检测.中华妇产科杂志，1993，28：85-87.
(收稿：1997-11-26 修回：1998-07-12), 百拇医药
单位：250117 济南，山东省肿瘤防治研究院
关键词：
中华妇产科杂志981117 自20多年前E玫瑰花环试验报道以来，又先后有人研究证实再生障碍性贫血、白血病、肝癌及卵巢癌等患者的T淋巴细胞亚群比例失调及免疫功能紊乱[1，2]。本研究通过对子宫颈癌患者治疗前后T淋巴细胞亚群、肿瘤坏死因子(TNF)的检测，期望能对子宫颈癌患者的免疫功能状况有较全面的了解，进一步提出临床治疗的检测指标。
一、材料与方法
1.研究对象：病例选自1994年9月至1995年1月，经病理检查证实并在我院治疗的Ⅱb～Ⅲb期子宫颈鳞癌患者42例，为肿瘤组，平均年龄58.3岁。42例子宫颈鳞癌中高分化1例、中分化23例、低分化18例。另选择正常献血员20例作为对照组。子宫颈癌患者确诊后均行放射治疗，治疗前后分别抽取空腹静脉血，加肝素抗凝，收集血浆并常规分离外周血单个核细胞。每毫升血浆中加0.1M苯*****10 μl，-20℃保存。外周血单个核细胞调成一定浓度，用于T淋巴细胞亚群检测和TNF诱生试验。对照组静脉血同法处理。
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2.T淋巴细胞亚群检查：采用CD3、CD4、CD8单克隆抗体致敏的羊红细胞花环形成法(试剂盒购自卫生部武汉生物制品研究所)。具体操作为：外周血单个核细胞去粘附细胞后用含2%小牛血清的RPMI 1640培养液，浓度为1.5×106/ml，每份标本设置3孔，加入细胞悬液100 μl，分别加入抗CD3、CD4、CD8单克隆抗体致敏红细胞悬液20 μl，混匀，以500 r/min离心30秒钟，置室温1小时后，于4℃放置4～6小时，然后取细胞涂片，瑞氏染色计数花环形成百分率为各亚群细胞百分率。
3.TNF诱生试验：将分离的外周血单个核细胞用含5%人AB血清的RPMI 1640培养悬浮细胞，调至细胞浓度为4×106/ml，用24孔细胞培养板，每孔加细胞1 ml，脂多糖(LPS) 2 μg/ml，于37℃ 5%CO2条件下培养24小时，离心收集上清液后加0.1苯*****10 μl/ml，-20℃保存，与血浆标本一起检测TNF含量。
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4.TNF检测：采用军事科学院生产的TNF检测试剂盒检测。方法为：取出已用抗TNF单克隆抗体包被的反应板，加不同稀释度的TNF标准品和待测血浆及诱生上清标本，每孔100 μl，放置湿盒内室温2小时，洗板3次后加已稀释的酶标免抗TNF，每孔100 μl，于湿盒内室温1小时洗板3次后，加新配底物缓冲液每孔100 μl，室温避光反应直至标准曲线显示时加2MH2SO4 50μl终止反应，绘制标准曲线，计算样品TNF含量。
5.治疗方法：本组患者均为Ⅱb～Ⅲb期，治疗以放射治疗为主，部分Ⅱb期患者行广泛性全子宫切除加盆腔淋巴结清扫术，对于病理分化差或局部肿瘤直径>4cm者，放疗前给予2周期化疗。本组患者治疗后均采用信访及定期门诊复查两种形式长期随访。
二、结果
1.T淋巴细胞亚群分布：肿瘤组治疗前与治疗后CD3、CD4、CD8与对照组比较，均明显为低，差异有极显著性(P均<0.01)。治疗后CD3、CD4较治疗前有所提高，差异有显著性(P<0.05)。见表1。
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2.TNF含量：肿瘤组血浆TNF含量明显高于对照组，差异有极显著性(P<0.01)。治疗后较治疗前明显下降，差异有极显著性(P<0.01)。见表2。病理分化程度为高分化者，TNF为1.16 μg/L；中分化者为1.385±0.80 μg/L(
±s)；低分化者为1.682±1.10 μg/L(±s)。分化程度越低，TNF含量越高，差异有显著性(P<0.05)。表1 淋巴细胞亚群分布(
±s) 组别例数
CD3
, http://www.100md.com CD4
CD8
CD4/CD8
肿瘤组
治疗前
42
52.3±9.06
32.2±6.37
23.7±5.62
1.36±0.31
治疗后
42
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55.9±5.45
35.0±5.70
23.3±3.83
1.54±0.36
对照组
20
65.6±9.10
40.7±9.71
28.3±7.29
1.42±0.31
表2 两组TNF含量 组别
例数
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TNF
(μg/L,
±s)肿瘤组
治疗前
42
1.536±1.020
治疗后
42
1.021±0.435
对照组
20
0.802±0.273
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3.TNF诱导产生情况：肿瘤组外周血单个核细胞诱导产生TNF的能力明显低于对照组，差异有极显著性(P<0.01)。治疗后较治疗前有所提高，但差异无显著性(P>0.05)。见表3。表3 两组TNF诱导含量
组别
例数
TNF
(μg/L,
±s)肿瘤组
治疗前
42
2.31±0.923
, 百拇医药
治疗后
42
2.73±1.032
对照组
20
3.78±0.642
三、讨论
1.T淋巴细胞亚群测定：T淋巴细胞亚群的测定能反映宫颈癌患者的免疫状况，恶性肿瘤患者细胞免疫功能受到不同程度的抑制[1，2]。本工作T淋巴细胞亚群检测结果表明，宫颈癌患者CD3、CD4、CD8均较正常人明显降低(P<0.01)，治疗后较治疗前，CD3、CD4有明显提高，CD4/CD8也有所提高，说明宫颈癌患者治疗后肿瘤对机体的侵害乃至机体的免疫功能的抑制状况明显改善。但与正常人的差异说明，机体完全恢复还需要较长的时间。
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2.TNF含量的测定能反映宫颈癌的病理分化程度：本工作宫颈癌患者血浆TNF水平与外周血单核细胞经LPS诱导产生TNF的能力提示，宫颈癌患者血浆中，由于受肿瘤抗原的不断刺激，TNF的含量提高，与诱导产生TNF的能力不一致。随着肿瘤的进展，分化程度的降低，TNF呈上升趋势，整个机体的免疫状况处于受抑制的状态。经过治疗后肿瘤对机体的侵害受到控制，诱导产生TNF的能力有所提高，机体的免疫状况得到改善，血浆中的TNF较治疗前有所下降。
本研究结果均提示，宫颈癌患者的免疫功能不同程度地受到抑制，治疗后可得到改善。今后还须增加病例数，延长随访时间，深入探讨，使T淋巴细胞亚群测定及TNF含量测定有可能成为检测宫颈癌治疗效果的指标。
参考文献
1 赵恩锋，周美清，傅模，等.重组人肿瘤坏死因子对卵巢癌细胞的毒性作用.中华妇产科杂志，1993，28：153-156.
2 吕时铭，石一复.卵巢肿瘤患者外周血肿瘤坏死因子的检测.中华妇产科杂志，1993，28：85-87.
(收稿：1997-11-26 修回：1998-07-12), 百拇医药