妊高征患者胎盘中一氧化氮合酶-mRNA转录强度的变化及意义
作者：周容 李维敏 曹泽毅 刘淑芸 熊庆 刘珊玲 唐茜萍 何斌
单位：610041 成都，华西医科大学附属第二医院妇产科
关键词：一氧化氮合酶；妊娠并发症；心血管；高血压；RNA；信使；转录；遗传
中华妇产科杂志981201 【摘要】 目的 探讨妊高征患者胎盘中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)含量减少的原因。方法 采用定量的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术，检测9例正常足月妊娠妇女胎盘和12例妊高征患者胎盘中eNOS-mRNA转录强度的变化。结果 (1)正常足月妊娠妇女胎盘和妊高征患者胎盘中均存在eNOS-mRNA。(2)妊高征患者胎盘中eNOS-mRNA的转录强度显著低于正常足月妊娠妇女(P<0.05)。结论 妊高征患者胎盘中eNOS含量的减少是由于eNOS-mRNA转录强度下降所致。
The Changes and Significance of the Intensity of Transcription of Endothelial Nitric Oxide Synthase-mRNA in Placental Tissue from Cases of Pregnancy Induced Hypertension Zhou Rong, Li Weimin, Cao Zeyi, et al. Second Affiliated Hospital, West China University of Medical Sciences， Chengdu 610041
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To determine the cause of decreasd expression of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in placental tissue from cases of pregnancy induced hypertension (PIH). Methods 9 placentae of normal pregnant women and 12 placentae of patients with PIH were studied. eNOS-mRNA was measured in placental tissue by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Results (1)There was eNOS-mRNA in placental tissue of normal pregnancy as well as PIH cases. (2). The intensity of transcription of eNOS-mRNA in placental tissue of PIH cases decreased significantly when compared with that of normal pregnancy (P<0.05). Conclusion The decrease of the intensity of transcription of eNOS-mRNA in placental tissue of PIH patients may result in reduction of expression of eNOS in placental tissue of PIH.
, 百拇医药
【Key words】 Nitric oxide synthase Pregnancy campications, cardiovascular Hypertension RNA，Messenger Transcription,genetic
妊高征是导致孕产妇和围产儿患病率及死亡率升高的重要原因之一。近年来的研究表明，血管内皮细胞产生的舒张因子——一氧化氮(NO)有维持正常妊娠血管张力和血流速度的作用，NO的改变在妊高征的发病中起重要作用[1～3]。国外的研究表明，妊高征患者胎盘中一氧化氮合酶(eNOS)的活性显著低于正常妊娠者[4]；妊高征患者胎盘和正常妊娠妇女胎盘中eNOS含量的表达强度在终末绒毛血管和合体滋养细胞中也有所不同[5]。本研究采用定量的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测妊高征患者胎盘中eNOS-mRNA转录强度的变化，以探讨eNOS含量减少的原因。
资料与方法
, 百拇医药
一、观察对象
从1996年9月～1998年2月收集在本院妇产科行剖宫产的孕产妇胎盘共21例。其中正常足月分娩胎盘9例 (孕龄271.48±6.09天)。妊高征患者胎盘12例(孕龄270.24±10.13天)。妊高征诊断按《妇产科学》(第4版)诊断标准[6]，均为中度及中度以上妊高征患者。剖宫产者均未临产，系因骨盆、胎位或妊高征危及母儿安全等因素而行剖宫产手术。手术时，待胎盘自娩后，立即取其母面正中组织约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm(约重30 mg)，铝箔纸包裹液氮中速冷后，置入-70℃冰箱待用。取材时，注意避开出血、坏死及钙化部位。
二、方法
1.试剂：总RNA提取药盒(德国Qiagen公司产品)；逆转录药盒(美国Gibcobrl公司产品)； eNOS引物[7]：5′-CAG TGT CCA ACA TGC TGC TGG AAA TTG-3′，5′-TAA AGG AGG TCT TCT TCC TGG TGA TGC C-3′(美国CyberSyn 公司合成)； 内参照引物(β-微球蛋白cDNA):5′-ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA-3′, 5′-ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG-3′(购自北京中山生物技术公司)；耐热性DNA聚合酶(TaqDNA酶,美国Gibcobrl公司产品)；标记物123 bp ladders(美国Gibcobrl公司产品)；其余试剂为国产分析纯。
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2. 实验方法：总RNA抽提及逆转录严格按照药盒说明书进行。每个样本均取3 μg总RNA进行逆转录。在由总RNA逆转录为cDNA后，取cDNA的10%进行PCR扩增。在PCR反应体系中依次加入10×PCR 缓冲液 5 μl，25 mmol/L MgCl2 3 μl，10 mmol/L dNTP 1 μl，eNOS引物1 μl，β-微球蛋白cDNA 2 μl，TagDNA酶0.5 μl及模板cDNA，最后加入适量的超纯水，使终反应体积为50 μl。
在上述反应液面上滴加石蜡油100 μl，于94℃预变性3分钟，随之进行PCR循环,其循环条件为：变性94℃，45秒; 退火55 ℃，90秒；延伸72 ℃，2分钟。共循环30次。最后1次延伸时间为72 ℃，8分钟。PCR产物置于-20 ℃保存。
取PCR产物10 μl，加入溴酚蓝2 μl，在1.2%琼脂糖凝胶上电泳。用UVP 800 Gel Works ID Intermediate 软件系统进行定量扫描，测量其峰值，并同时测量内参照β-微球蛋白cDNA的PCR扩增产物的峰值，以两者的比值作为待测样本的结果。
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三、统计方法
两组计量资料作t检验。
结果
一、胎盘中eNOS-mRNA的表达
正常足月妊娠妇女的胎盘及妊高征患者的胎盘组织中均存在eNOS-mRNA。β-微球蛋白cDNA的PCR扩增产物为120 bp，eNOS cDNA的PCR扩增产物为485 bp。
二、胎盘中eNOS-mRNA转录强度的变化
正常足月妊娠妇女胎盘的eNOS-mRNA cDNA的PCR产物扫描强度为1.051 4±0.381 1, 显著高于妊高征患者胎盘的eNOS-mRNA-cDNA的PCR扫描强度(0.479 0±0.132 2，P<0.05)。
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讨论
一、定量RT-PCR反应特点
本研究采用在人体细胞中均存在且稳定表达的β-微球蛋白cDNA作为内参照引物，与样本模板cDNA在同一试管中相同条件下进行扩增，并以样本模板的cDNA的PCR扩增产物与β-微球蛋白cDNA的PCR扩增产物的比值，作为样本模板cDNA的PCR产物量值；同时，规定了用于抽提总RNA的样本胎盘组织的含量、参加cDNA逆转录的总RNA含量以及参加PCR循环的样本模板cDNA含量。这样，就克服了由于实验操作误差所造成的人为因素的影响，从而使结果更具准确性和可靠性。
二、妊高征患者胎盘eNOS-mRNA转录强度变化
本研究发现，在正常足月妊娠和妊高征患者胎盘中均存在eNOS-mRNA，与Boccardo等[8]的研究结果一致。此外，本研究结果还发现，与正常足月妊娠胎盘相比较，妊高征患者胎盘中eNOS-mRNA转录强度显著下降(P<0.05)，说明妊高征患者胎盘中eNOS含量的减少，是由于eNOS-mRNA转录强度下降所致。由于eNOS-mRNA转录强度的下降，使以eNOS-mRNA为模板的eNOS的蛋白质翻译减少，eNOS合成下降，造成了由eNOS所催化的内源性NO合成减少，进而导致NO的第二信使环磷酸鸟苷(cGMP)的合成减少[9]，引起血管平滑肌收缩，血管张力增加，出现妊高征的临床表现。
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上述研究结果说明，胎盘中eNOS-mRNA转录强度下降是妊高征的重要发病环节。
参考文献
1 Helmbrecht GD, Farhat MY, Lochbaum L, et al. L-arginine reverse the adverse pregnancy changes induced by nitric oxide synthase inhibition in the rat. Am J Obstet Gynecol, 1996,174:800-805.
2 Molnar M, Suto T, Toth T, et al. Prolonged blockade of nitric oxide synthesis in grarid rats produces sustained hypertension, proteinuria, thrombocytopenia, and intrauterine growth retardation. Am J Obstet Gynecol, 1994，169:1458-1466.
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3 Lubarsky SL, Ahokas RA, Friedman SA. The effect of chronic nitric oxide synthesis inhibition on blood and angiotensin Ⅱ responsiveness in the pregnant rat. Am J Obstet Gynecol, 1997，176:1069-1076.
4 Morris NH, Saoranna SR, Learmout JG, et al. Nitric oxide synthase activities in placental tissue from normotensive, preeclamptic and growth retarded pregnancies. Br J Obstet Gynecol, 1995，102:711-714.
5 Ghabour MS, Eis ALW, Brockman MS, et al. Immunohistochemical characterization of placental nitric oxide synthase expression in preeclampsia. Am J Obstet Gynecol, 1995，173:687-694.
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6 乐杰主编. 妇产科学.第4版.北京：人民卫生出版社，1996.113-121.
7 Garvey EP, Tuttle JV, Covington K, et al. Purification and characterization of the constitutive nitric oxide synthase from human placenta. Arch Biochem Biophy, 1994, 311: 235-241.
8 Boccardo P, Soregaroli M, Aiello S, et al. Systemic and fetal-maternal nitric oxide synthesis in normal pregnancy and pre-eclampsia. Br J Obstet Gynecol， 1996，103:879-886.
9 刘耕陶. 一氧化氮的研究前景. 中华医学杂志, 1996，76:563-564.
(收稿：1998-04-06 修回：1998-07-20)
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关键词：一氧化氮合酶；妊娠并发症；心血管；高血压；RNA；信使；转录；遗传
中华妇产科杂志981201 【摘要】 目的 探讨妊高征患者胎盘中内皮型一氧化氮合酶(eNOS)含量减少的原因。方法 采用定量的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术，检测9例正常足月妊娠妇女胎盘和12例妊高征患者胎盘中eNOS-mRNA转录强度的变化。结果 (1)正常足月妊娠妇女胎盘和妊高征患者胎盘中均存在eNOS-mRNA。(2)妊高征患者胎盘中eNOS-mRNA的转录强度显著低于正常足月妊娠妇女(P<0.05)。结论 妊高征患者胎盘中eNOS含量的减少是由于eNOS-mRNA转录强度下降所致。
The Changes and Significance of the Intensity of Transcription of Endothelial Nitric Oxide Synthase-mRNA in Placental Tissue from Cases of Pregnancy Induced Hypertension Zhou Rong, Li Weimin, Cao Zeyi, et al. Second Affiliated Hospital, West China University of Medical Sciences， Chengdu 610041
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【Abstract】 Objective To determine the cause of decreasd expression of endothelial nitric oxide synthase (eNOS) in placental tissue from cases of pregnancy induced hypertension (PIH). Methods 9 placentae of normal pregnant women and 12 placentae of patients with PIH were studied. eNOS-mRNA was measured in placental tissue by reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR). Results (1)There was eNOS-mRNA in placental tissue of normal pregnancy as well as PIH cases. (2). The intensity of transcription of eNOS-mRNA in placental tissue of PIH cases decreased significantly when compared with that of normal pregnancy (P<0.05). Conclusion The decrease of the intensity of transcription of eNOS-mRNA in placental tissue of PIH patients may result in reduction of expression of eNOS in placental tissue of PIH.
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【Key words】 Nitric oxide synthase Pregnancy campications, cardiovascular Hypertension RNA，Messenger Transcription,genetic
妊高征是导致孕产妇和围产儿患病率及死亡率升高的重要原因之一。近年来的研究表明，血管内皮细胞产生的舒张因子——一氧化氮(NO)有维持正常妊娠血管张力和血流速度的作用，NO的改变在妊高征的发病中起重要作用[1～3]。国外的研究表明，妊高征患者胎盘中一氧化氮合酶(eNOS)的活性显著低于正常妊娠者[4]；妊高征患者胎盘和正常妊娠妇女胎盘中eNOS含量的表达强度在终末绒毛血管和合体滋养细胞中也有所不同[5]。本研究采用定量的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术检测妊高征患者胎盘中eNOS-mRNA转录强度的变化，以探讨eNOS含量减少的原因。
资料与方法
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一、观察对象
从1996年9月～1998年2月收集在本院妇产科行剖宫产的孕产妇胎盘共21例。其中正常足月分娩胎盘9例 (孕龄271.48±6.09天)。妊高征患者胎盘12例(孕龄270.24±10.13天)。妊高征诊断按《妇产科学》(第4版)诊断标准[6]，均为中度及中度以上妊高征患者。剖宫产者均未临产，系因骨盆、胎位或妊高征危及母儿安全等因素而行剖宫产手术。手术时，待胎盘自娩后，立即取其母面正中组织约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm(约重30 mg)，铝箔纸包裹液氮中速冷后，置入-70℃冰箱待用。取材时，注意避开出血、坏死及钙化部位。
二、方法
1.试剂：总RNA提取药盒(德国Qiagen公司产品)；逆转录药盒(美国Gibcobrl公司产品)； eNOS引物[7]：5′-CAG TGT CCA ACA TGC TGC TGG AAA TTG-3′，5′-TAA AGG AGG TCT TCT TCC TGG TGA TGC C-3′(美国CyberSyn 公司合成)； 内参照引物(β-微球蛋白cDNA):5′-ACC CCC ACT GAA AAA GAT GA-3′, 5′-ATC TTC AAA CCT CCA TGA TG-3′(购自北京中山生物技术公司)；耐热性DNA聚合酶(TaqDNA酶,美国Gibcobrl公司产品)；标记物123 bp ladders(美国Gibcobrl公司产品)；其余试剂为国产分析纯。
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2. 实验方法：总RNA抽提及逆转录严格按照药盒说明书进行。每个样本均取3 μg总RNA进行逆转录。在由总RNA逆转录为cDNA后，取cDNA的10%进行PCR扩增。在PCR反应体系中依次加入10×PCR 缓冲液 5 μl，25 mmol/L MgCl2 3 μl，10 mmol/L dNTP 1 μl，eNOS引物1 μl，β-微球蛋白cDNA 2 μl，TagDNA酶0.5 μl及模板cDNA，最后加入适量的超纯水，使终反应体积为50 μl。
在上述反应液面上滴加石蜡油100 μl，于94℃预变性3分钟，随之进行PCR循环,其循环条件为：变性94℃，45秒; 退火55 ℃，90秒；延伸72 ℃，2分钟。共循环30次。最后1次延伸时间为72 ℃，8分钟。PCR产物置于-20 ℃保存。
取PCR产物10 μl，加入溴酚蓝2 μl，在1.2%琼脂糖凝胶上电泳。用UVP 800 Gel Works ID Intermediate 软件系统进行定量扫描，测量其峰值，并同时测量内参照β-微球蛋白cDNA的PCR扩增产物的峰值，以两者的比值作为待测样本的结果。
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三、统计方法
两组计量资料作t检验。
结果
一、胎盘中eNOS-mRNA的表达
正常足月妊娠妇女的胎盘及妊高征患者的胎盘组织中均存在eNOS-mRNA。β-微球蛋白cDNA的PCR扩增产物为120 bp，eNOS cDNA的PCR扩增产物为485 bp。
二、胎盘中eNOS-mRNA转录强度的变化
正常足月妊娠妇女胎盘的eNOS-mRNA cDNA的PCR产物扫描强度为1.051 4±0.381 1, 显著高于妊高征患者胎盘的eNOS-mRNA-cDNA的PCR扫描强度(0.479 0±0.132 2，P<0.05)。
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讨论
一、定量RT-PCR反应特点
本研究采用在人体细胞中均存在且稳定表达的β-微球蛋白cDNA作为内参照引物，与样本模板cDNA在同一试管中相同条件下进行扩增，并以样本模板的cDNA的PCR扩增产物与β-微球蛋白cDNA的PCR扩增产物的比值，作为样本模板cDNA的PCR产物量值；同时，规定了用于抽提总RNA的样本胎盘组织的含量、参加cDNA逆转录的总RNA含量以及参加PCR循环的样本模板cDNA含量。这样，就克服了由于实验操作误差所造成的人为因素的影响，从而使结果更具准确性和可靠性。
二、妊高征患者胎盘eNOS-mRNA转录强度变化
本研究发现，在正常足月妊娠和妊高征患者胎盘中均存在eNOS-mRNA，与Boccardo等[8]的研究结果一致。此外，本研究结果还发现，与正常足月妊娠胎盘相比较，妊高征患者胎盘中eNOS-mRNA转录强度显著下降(P<0.05)，说明妊高征患者胎盘中eNOS含量的减少，是由于eNOS-mRNA转录强度下降所致。由于eNOS-mRNA转录强度的下降，使以eNOS-mRNA为模板的eNOS的蛋白质翻译减少，eNOS合成下降，造成了由eNOS所催化的内源性NO合成减少，进而导致NO的第二信使环磷酸鸟苷(cGMP)的合成减少[9]，引起血管平滑肌收缩，血管张力增加，出现妊高征的临床表现。
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上述研究结果说明，胎盘中eNOS-mRNA转录强度下降是妊高征的重要发病环节。
参考文献
1 Helmbrecht GD, Farhat MY, Lochbaum L, et al. L-arginine reverse the adverse pregnancy changes induced by nitric oxide synthase inhibition in the rat. Am J Obstet Gynecol, 1996,174:800-805.
2 Molnar M, Suto T, Toth T, et al. Prolonged blockade of nitric oxide synthesis in grarid rats produces sustained hypertension, proteinuria, thrombocytopenia, and intrauterine growth retardation. Am J Obstet Gynecol, 1994，169:1458-1466.
, 百拇医药
3 Lubarsky SL, Ahokas RA, Friedman SA. The effect of chronic nitric oxide synthesis inhibition on blood and angiotensin Ⅱ responsiveness in the pregnant rat. Am J Obstet Gynecol, 1997，176:1069-1076.
4 Morris NH, Saoranna SR, Learmout JG, et al. Nitric oxide synthase activities in placental tissue from normotensive, preeclamptic and growth retarded pregnancies. Br J Obstet Gynecol, 1995，102:711-714.
5 Ghabour MS, Eis ALW, Brockman MS, et al. Immunohistochemical characterization of placental nitric oxide synthase expression in preeclampsia. Am J Obstet Gynecol, 1995，173:687-694.
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6 乐杰主编. 妇产科学.第4版.北京：人民卫生出版社，1996.113-121.
7 Garvey EP, Tuttle JV, Covington K, et al. Purification and characterization of the constitutive nitric oxide synthase from human placenta. Arch Biochem Biophy, 1994, 311: 235-241.
8 Boccardo P, Soregaroli M, Aiello S, et al. Systemic and fetal-maternal nitric oxide synthesis in normal pregnancy and pre-eclampsia. Br J Obstet Gynecol， 1996，103:879-886.
9 刘耕陶. 一氧化氮的研究前景. 中华医学杂志, 1996，76:563-564.
(收稿：1998-04-06 修回：1998-07-20)
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