应用套式聚合酶链反应技术检测孕妇血浆中胎儿DNA的研究
作者：迟洪滨 康志海 胡桂英 李佩玲
单位：150086 哈尔滨医科大学附属第二医院妇产科
关键词：产前诊断；聚合链反应；胎儿DNA
中华妇产科杂志990108 【摘要】 目的 依据孕妇血浆中存在游离胎儿DNA的理论，寻找一种非创伤性产前基因诊断的新方法。方法 用套式聚合酶链反应技术对12例12～40孕周的初产妇血浆中游离胎儿DNA进行特异性扩增，扩增的基因为Y染色体短臂单拷贝基因片段(DYS14基因)，扩增片段的大小分别为239 bp和198 bp，12例孕妇均采用母体血浆直接作为模板进行套式聚合酶链反应扩增。结果 10例妊娠男性胎儿孕妇中有8例血浆中出现DYS14基因扩增带，检出率为80%(8/10)，其中6例两次套式聚合酶链反应扩增均为阳性，2例第2次扩增才出现阳性扩增带，套式聚合酶链反应可明显提高检测灵敏度(从60%提高到80%)。2例妊娠女性胎儿孕妇血浆两次均未出现阳性扩增带，无一例假阳性结果。本项研究的性别总符合率为83.3%(10/12)。结论 套式聚合酶链反应检测母体血浆中游离胎儿DNA的灵敏度和特异性较高，作为非创伤性产前基因诊断的一种方法可应用于临床。
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Detection of Fetal DNA in Maternal Plasma Using the Nested Polymerase Chain Reaction CHI Hongbin, KANG Zhihai, HU Guiying, et al. Second affiliated Hospital, Harbin Medical University, Harbin 150086
【Abstract】 Objective To search for a new method of non-invasive prenatal gene diagnosis. Methods A single-copy human DYS14 gene of Y-chromosome of fetal DNA sequence was amplified by nested polymerase chain reaction (PCR) from twelve pregnant maternal plasma (12-40 weeks). A 239 bp and 198 bp specific fragment were obtained. The maternal plasma samples of twelve pregnant women were used directly for nested PCR. Results The fragment was identified in 8 of 10 male-bearing pregnant women plasma. The diagnostic accordance rate was 80% (8/10), 6 of 8 women gave positive signals in two consecutive amplifications, 2 of 8 women gave positive singals in the second amplification. The rate of positive was increased greatly by nested PCR (from 60% to 80%). None of the other 2 female-bearing pregnant women had positive results. The final accuracy of 83.3% (10/12) was attained in all cases.Conclusion The finding of circulating fetal DNA in maternal plasma may have new implications for non-invasive prenatal gene diagnosis, and the nested PCR possesses the advantages of sensitivity and specificity which improves the clinical application.
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【Key words】 Prenatal genic diagnosis Polymerase chain reaction Fetus DNA
胎儿细胞存在于孕妇外周血中已被许多学者所证实[1，2]，但由于其数量少，个体差异及不同孕周的含量不同，使其难以成为临床实用的非创伤性产前诊断的检测方法。近年来，国外学者采用密度梯度离心富集母体外周血的胎儿细胞[3]，然后利用各种胎儿细胞表面特异抗原的单克隆抗体，经流式细胞仪或磁激活细胞分离等方法分离、纯化胎儿细胞，再通过常规提取胎儿细胞核DNA进行产前基因诊断[4，5]。但这些方法价格昂贵，技术复杂。近期国外报道首次发现母体外周血的血浆中存在游离胎儿DNA[6]，我们应用套式聚合酶链反应技术，对孕妇血浆中游离胎儿DNA进行了检测，现将结果报道如下。
资料与方法
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一、研究对象
病例来源为1997年10月至1998年2月在我院就诊的孕妇。采取12～40孕周单活胎的初产妇外周血2 ml，共12例。此外，以一例未婚且无妊娠史的女性及一例男性分别作为阴性和阳性对照。
二、方法
1.主要试剂：ACD抗凝剂(哈尔滨医科大学遗传室产品)，Taq聚合酶(Promega)，dNTP(Promega)，PBR 322DNA/MspI Markers(北京天象人生物制品有限公司产品)。
2.引物的合成：引物按文献[7]设计合成，序列如下：Y1.5:5′CTAGACCGCAGAGGCGCCAT3′，Y1.6：5′TAGTACCCACGCCTGCTCCGG3′，Y1.7：5′CATCCAGAG-CGTCCCTGGCTT3′，Y1.8：5′CTTTCCACAGCCACATTT-GTC3′。
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3.套式聚合酶链反应模板的血浆制备：取外周血2 ml经ACD抗凝之后，离心1 000 r/min 5分钟，取上层血浆再次离心，以1 000 r/min离心5分钟，收集于0.5 ml Eppendorf管中。血浆经99℃变性5分钟，然后再离心，以12 000 r/min离心10分钟，取上清作为套式聚合酶链反应模板。
4.DYS14靶序列的体外扩增：标准套式聚合酶链反应体系：血浆模板10 μl，10×缓冲液5 μl，4×dNTP(各2.5 mmol/L) 1 μl，用特异性扩增正常男性DYS14单拷贝基因保守区239 bp的外侧引物Y1.5、Y1.6各1 μl(50 pmol/L),然后加水至50 μl。具体反应条件：首先在不加酶的情况下95℃变性7分钟，然后置冰浴中，加入Taq聚合酶2 U短暂离心后进行热循环周期，94℃ 60秒，55℃ 60秒，72℃ 60秒反应循环35个周期，最后72℃延伸10分钟，取10 μl反应产物行电泳检测。
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取扩增产物5 μl进行第二次扩增，用内侧引物Y1.7、Y1.8扩增DYS14基因保守区的198 bp DNA片段，扩增反应液总体积为50 μl。反应条件同上，只是反应循环为25个周期，最后取10 μl扩增产物在8%的丙烯酰胺凝胶中点样电泳检测。
结果
一、母体外周血的血浆男性胎儿单拷贝DYS14基因检出率
对12例妊娠12～40周的初产妇外周血的血浆进行套式聚合酶链反应检测，其中10例妊娠男性胎儿的孕妇中，有8例血浆出现DYS14基因扩增带，检出率为80%(8/10)，假阴性2例；其余2例妊娠女性胎儿孕妇血浆两次PCR均未出现阳性扩增带，无一例假阳性结果。本项研究的性别总符合性率为83.3%(10/12)。
二、套式聚合酶链反应检测的灵敏度
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8例血浆出现DYS14基因扩增带的妇女中，有6例两次PCR扩增均为阳性，2例第二次扩增才出现阳性，套式聚合酶链反应使检出率从60%(6/10)提高到80%(8/10)，明显提高了检测灵敏度。
讨论
一、母体外周血的血浆中存在游离胎儿DNA
由于孕妇血中胎儿细胞稀少，想进行非创伤性产前基因诊断需要富集、分离及纯化到足够量的胎儿细胞，然后提取细胞核DNA作为检测对象，检测过程较复杂，且价格昂贵，临床开展较困难。本研究利用母体外周血的血浆中存在游离胎儿DNA为理论根据，应用套式聚合酶链反应技术检出血浆中男性胎儿单拷贝DYS14基因的总符合率为83.3%，与Lo等[6]研究结果近似。Lo等认为母体血浆中存在游离胎儿DNA的机理是：胎儿对于母体就如同肿瘤对于机体，肿瘤DNA可以在人体血浆中检测到并作为早期诊断肿瘤的依据。同样，母体会对胎儿产生一定的免疫排斥反应，使细胞膜破裂，而DNA释放入血浆中。直至今日才发现母体血浆中确含有游离胎儿DNA，只是由于传统的外周血细胞DNA的提取是弃去血浆后进行的。此方法由于不经过繁琐的细胞核DNA提取过程，因此检测时间可由原来的2～3天减至2～3小时，缩短检测时间，节省检测试剂费用，且采用量也降至2 ml，即可获得足够PCR扩增的模板量(每次10 μl)。为非创伤性产前基因诊断进入临床应用提供了良好的前提条件。
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二、套式聚合酶链反应技术在非创伤性产前基因诊断中的应用
套式聚合酶链反应是普通PCR基础上的完善和发展，具有快速、灵敏和特异等优点。本研究选择的扩增对象是Y染色体短臂上的一段单拷贝序列(DYS14基因)，因它与常染色体无交叉序列，不易出现假阳性。通过引物Y1.5、Y1.6及Y1.7、Y1.8的两次扩增使灵敏度从60%提高到80%，说明套式聚合酶链反应的高灵敏性。本研究有2例假阴性，表明血浆中游离胎儿DNA随个体差异而含量极少，不足以达到PCR扩增的模板量，而出现假阴性。本研究均采用初产妇的外周血血浆以避免上次妊娠的胎儿细胞DNA遗留于本次妊娠的母体外周血中[8]。
总之，随着母体血浆存在游离胎儿DNA理论进一步研究验证，配合套式聚合酶链反应技术的应用，使性连锁遗传病的非创伤性产前基因诊断有望尽早地应用于临床。
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参考文献
[1] Corone AE, Johnson PM, Hutton D, et al. Trophoblast cell in peripheral blood from pregnant women. Lancet, 1984, 75:2101-2106.
[2] Simpson JL, Elias S. Isolating fetal cells in maternal circulation for prenatal diagnosis. Prenat Diagn, 1994, 14:1229-1242.
[3] Ganshirt-Ahlert D, Burschyk M, Garritsen HSP, et al. Magnetic cell sorting and the transferrin receptor as potential means of prenatal diagnosis from maternal blood. Am J Obstet Gynecol, 1992, 166:1350-1355.
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[4] Simpson JL, Elias S. Isolating fetal cells from maternal blood: advances in prenatal diagnosis through molecular technology. JAMA, 1993, 270:2357-2361.
[5] Ganshirt-Ahlert D, Borjesson-Stoll R, Burschyk M, et al. Detection of fetal trisomies 12 and 18 from maternal blood using triple gradient and magnetic cell sorting. Am J Reprod Immunol, 1993, 30:194-201.
[6] Lo YMD, Corbetta N, Chamberiain PF, et al. Presence of fetal DNA in Maternal plasma and serum. Lancet, 1997, 350:485-487.
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[7] Lo YMD, Patal P, Sampietro M, et al. Detection of single-copy fetal DNA sequence from maternal blood. Lancet, 1990, 335:1463-1464.
[8] Bianchi DW, Zickwolf GK, Weil GJ, et al. Male fetal progenitor cell persist in maternal blood for as long as 27 years postpartum. Proc Natl Acad Sci (U.S.A), 1996, 93:705-708.
(收稿：1998-05-28 修回：1998-09-14), http://www.100md.com
单位：150086 哈尔滨医科大学附属第二医院妇产科
关键词：产前诊断；聚合链反应；胎儿DNA
中华妇产科杂志990108 【摘要】 目的 依据孕妇血浆中存在游离胎儿DNA的理论，寻找一种非创伤性产前基因诊断的新方法。方法 用套式聚合酶链反应技术对12例12～40孕周的初产妇血浆中游离胎儿DNA进行特异性扩增，扩增的基因为Y染色体短臂单拷贝基因片段(DYS14基因)，扩增片段的大小分别为239 bp和198 bp，12例孕妇均采用母体血浆直接作为模板进行套式聚合酶链反应扩增。结果 10例妊娠男性胎儿孕妇中有8例血浆中出现DYS14基因扩增带，检出率为80%(8/10)，其中6例两次套式聚合酶链反应扩增均为阳性，2例第2次扩增才出现阳性扩增带，套式聚合酶链反应可明显提高检测灵敏度(从60%提高到80%)。2例妊娠女性胎儿孕妇血浆两次均未出现阳性扩增带，无一例假阳性结果。本项研究的性别总符合率为83.3%(10/12)。结论 套式聚合酶链反应检测母体血浆中游离胎儿DNA的灵敏度和特异性较高，作为非创伤性产前基因诊断的一种方法可应用于临床。
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Detection of Fetal DNA in Maternal Plasma Using the Nested Polymerase Chain Reaction CHI Hongbin, KANG Zhihai, HU Guiying, et al. Second affiliated Hospital, Harbin Medical University, Harbin 150086
【Abstract】 Objective To search for a new method of non-invasive prenatal gene diagnosis. Methods A single-copy human DYS14 gene of Y-chromosome of fetal DNA sequence was amplified by nested polymerase chain reaction (PCR) from twelve pregnant maternal plasma (12-40 weeks). A 239 bp and 198 bp specific fragment were obtained. The maternal plasma samples of twelve pregnant women were used directly for nested PCR. Results The fragment was identified in 8 of 10 male-bearing pregnant women plasma. The diagnostic accordance rate was 80% (8/10), 6 of 8 women gave positive signals in two consecutive amplifications, 2 of 8 women gave positive singals in the second amplification. The rate of positive was increased greatly by nested PCR (from 60% to 80%). None of the other 2 female-bearing pregnant women had positive results. The final accuracy of 83.3% (10/12) was attained in all cases.Conclusion The finding of circulating fetal DNA in maternal plasma may have new implications for non-invasive prenatal gene diagnosis, and the nested PCR possesses the advantages of sensitivity and specificity which improves the clinical application.
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【Key words】 Prenatal genic diagnosis Polymerase chain reaction Fetus DNA
胎儿细胞存在于孕妇外周血中已被许多学者所证实[1，2]，但由于其数量少，个体差异及不同孕周的含量不同，使其难以成为临床实用的非创伤性产前诊断的检测方法。近年来，国外学者采用密度梯度离心富集母体外周血的胎儿细胞[3]，然后利用各种胎儿细胞表面特异抗原的单克隆抗体，经流式细胞仪或磁激活细胞分离等方法分离、纯化胎儿细胞，再通过常规提取胎儿细胞核DNA进行产前基因诊断[4，5]。但这些方法价格昂贵，技术复杂。近期国外报道首次发现母体外周血的血浆中存在游离胎儿DNA[6]，我们应用套式聚合酶链反应技术，对孕妇血浆中游离胎儿DNA进行了检测，现将结果报道如下。
资料与方法
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一、研究对象
病例来源为1997年10月至1998年2月在我院就诊的孕妇。采取12～40孕周单活胎的初产妇外周血2 ml，共12例。此外，以一例未婚且无妊娠史的女性及一例男性分别作为阴性和阳性对照。
二、方法
1.主要试剂：ACD抗凝剂(哈尔滨医科大学遗传室产品)，Taq聚合酶(Promega)，dNTP(Promega)，PBR 322DNA/MspI Markers(北京天象人生物制品有限公司产品)。
2.引物的合成：引物按文献[7]设计合成，序列如下：Y1.5:5′CTAGACCGCAGAGGCGCCAT3′，Y1.6：5′TAGTACCCACGCCTGCTCCGG3′，Y1.7：5′CATCCAGAG-CGTCCCTGGCTT3′，Y1.8：5′CTTTCCACAGCCACATTT-GTC3′。
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3.套式聚合酶链反应模板的血浆制备：取外周血2 ml经ACD抗凝之后，离心1 000 r/min 5分钟，取上层血浆再次离心，以1 000 r/min离心5分钟，收集于0.5 ml Eppendorf管中。血浆经99℃变性5分钟，然后再离心，以12 000 r/min离心10分钟，取上清作为套式聚合酶链反应模板。
4.DYS14靶序列的体外扩增：标准套式聚合酶链反应体系：血浆模板10 μl，10×缓冲液5 μl，4×dNTP(各2.5 mmol/L) 1 μl，用特异性扩增正常男性DYS14单拷贝基因保守区239 bp的外侧引物Y1.5、Y1.6各1 μl(50 pmol/L),然后加水至50 μl。具体反应条件：首先在不加酶的情况下95℃变性7分钟，然后置冰浴中，加入Taq聚合酶2 U短暂离心后进行热循环周期，94℃ 60秒，55℃ 60秒，72℃ 60秒反应循环35个周期，最后72℃延伸10分钟，取10 μl反应产物行电泳检测。
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取扩增产物5 μl进行第二次扩增，用内侧引物Y1.7、Y1.8扩增DYS14基因保守区的198 bp DNA片段，扩增反应液总体积为50 μl。反应条件同上，只是反应循环为25个周期，最后取10 μl扩增产物在8%的丙烯酰胺凝胶中点样电泳检测。
结果
一、母体外周血的血浆男性胎儿单拷贝DYS14基因检出率
对12例妊娠12～40周的初产妇外周血的血浆进行套式聚合酶链反应检测，其中10例妊娠男性胎儿的孕妇中，有8例血浆出现DYS14基因扩增带，检出率为80%(8/10)，假阴性2例；其余2例妊娠女性胎儿孕妇血浆两次PCR均未出现阳性扩增带，无一例假阳性结果。本项研究的性别总符合性率为83.3%(10/12)。
二、套式聚合酶链反应检测的灵敏度
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8例血浆出现DYS14基因扩增带的妇女中，有6例两次PCR扩增均为阳性，2例第二次扩增才出现阳性，套式聚合酶链反应使检出率从60%(6/10)提高到80%(8/10)，明显提高了检测灵敏度。
讨论
一、母体外周血的血浆中存在游离胎儿DNA
由于孕妇血中胎儿细胞稀少，想进行非创伤性产前基因诊断需要富集、分离及纯化到足够量的胎儿细胞，然后提取细胞核DNA作为检测对象，检测过程较复杂，且价格昂贵，临床开展较困难。本研究利用母体外周血的血浆中存在游离胎儿DNA为理论根据，应用套式聚合酶链反应技术检出血浆中男性胎儿单拷贝DYS14基因的总符合率为83.3%，与Lo等[6]研究结果近似。Lo等认为母体血浆中存在游离胎儿DNA的机理是：胎儿对于母体就如同肿瘤对于机体，肿瘤DNA可以在人体血浆中检测到并作为早期诊断肿瘤的依据。同样，母体会对胎儿产生一定的免疫排斥反应，使细胞膜破裂，而DNA释放入血浆中。直至今日才发现母体血浆中确含有游离胎儿DNA，只是由于传统的外周血细胞DNA的提取是弃去血浆后进行的。此方法由于不经过繁琐的细胞核DNA提取过程，因此检测时间可由原来的2～3天减至2～3小时，缩短检测时间，节省检测试剂费用，且采用量也降至2 ml，即可获得足够PCR扩增的模板量(每次10 μl)。为非创伤性产前基因诊断进入临床应用提供了良好的前提条件。
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二、套式聚合酶链反应技术在非创伤性产前基因诊断中的应用
套式聚合酶链反应是普通PCR基础上的完善和发展，具有快速、灵敏和特异等优点。本研究选择的扩增对象是Y染色体短臂上的一段单拷贝序列(DYS14基因)，因它与常染色体无交叉序列，不易出现假阳性。通过引物Y1.5、Y1.6及Y1.7、Y1.8的两次扩增使灵敏度从60%提高到80%，说明套式聚合酶链反应的高灵敏性。本研究有2例假阴性，表明血浆中游离胎儿DNA随个体差异而含量极少，不足以达到PCR扩增的模板量，而出现假阴性。本研究均采用初产妇的外周血血浆以避免上次妊娠的胎儿细胞DNA遗留于本次妊娠的母体外周血中[8]。
总之，随着母体血浆存在游离胎儿DNA理论进一步研究验证，配合套式聚合酶链反应技术的应用，使性连锁遗传病的非创伤性产前基因诊断有望尽早地应用于临床。
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参考文献
[1] Corone AE, Johnson PM, Hutton D, et al. Trophoblast cell in peripheral blood from pregnant women. Lancet, 1984, 75:2101-2106.
[2] Simpson JL, Elias S. Isolating fetal cells in maternal circulation for prenatal diagnosis. Prenat Diagn, 1994, 14:1229-1242.
[3] Ganshirt-Ahlert D, Burschyk M, Garritsen HSP, et al. Magnetic cell sorting and the transferrin receptor as potential means of prenatal diagnosis from maternal blood. Am J Obstet Gynecol, 1992, 166:1350-1355.
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[4] Simpson JL, Elias S. Isolating fetal cells from maternal blood: advances in prenatal diagnosis through molecular technology. JAMA, 1993, 270:2357-2361.
[5] Ganshirt-Ahlert D, Borjesson-Stoll R, Burschyk M, et al. Detection of fetal trisomies 12 and 18 from maternal blood using triple gradient and magnetic cell sorting. Am J Reprod Immunol, 1993, 30:194-201.
[6] Lo YMD, Corbetta N, Chamberiain PF, et al. Presence of fetal DNA in Maternal plasma and serum. Lancet, 1997, 350:485-487.
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[7] Lo YMD, Patal P, Sampietro M, et al. Detection of single-copy fetal DNA sequence from maternal blood. Lancet, 1990, 335:1463-1464.
[8] Bianchi DW, Zickwolf GK, Weil GJ, et al. Male fetal progenitor cell persist in maternal blood for as long as 27 years postpartum. Proc Natl Acad Sci (U.S.A), 1996, 93:705-708.
(收稿：1998-05-28 修回：1998-09-14), http://www.100md.com