紫杉醇诱导绒癌JAR细胞的凋亡
作者：陈怀增 石一复 郑伟
单位：300006 杭州，浙江医科大学附属妇产科医院
关键词：
中华妇产科杂志990220 紫杉醇对晚期卵巢癌及转移性乳腺癌、肺癌具有明显疗效。紫杉醇具有独特的抗肿瘤机理，其诱导细胞调亡仅在白血病、卵巢癌及乳腺癌的体外实验中有所报道[1-3]。本研究旨在阐明紫杉醇诱导绒癌细胞调亡的生化、形态学以及细胞周期的改变，以探讨其发生机理。
一、材料和方法
1.细胞株及细胞培养： 人绒癌JAR细胞株由中国科学院上海细胞所细胞库提供，含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，于5%CO2,37℃孵箱内孵育。
2.DNA琼脂凝胶电泳： 紫杉醇(北京协和药厂生产)分为1、3、10、30 、100nmol/L 5种浓度。生理盐水作为对照。作用24小时后收集细胞，蛋白酶裂解，酚-氯仿纯化，1.5% 琼脂电泳，成像仪摄片并记录。
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3.核酸染色(Feulgen反应)： 紫杉醇药物处理JAR 细胞24小时后，用组织化学方法对核酸进行染色[4]。
4.电镜观察调亡小体： 设对照及30nmol/L浓度各1例，常规超薄切片，铀铅染色后电镜观察。
5.测定细胞周期分布：设紫杉醇10、30、100nmol/L及对照，12小时、48小时两种时间，经FACs型流式细胞仪测定细胞周期分布百分率。
二、结果
1.JAR细胞DNA的断裂情况： 30nmol/L以上浓度的紫杉醇与JAR细胞作用24小时后，可见典型的“阶梯状”DNA断裂条带，条带密度随紫杉醇浓度升高而增高。另一方面，100nmol/L紫杉醇与JAR细胞作用18小时后，也出现DNA断裂条带。
2.JAR细胞核酸形态的改变： 对照细胞核大，染色均匀，核边界清楚。随着紫杉醇浓度的升高，细胞染色质浓集，细胞变小，低浓度时可清晰分辨染色体，而高浓度时染色体浓集成点状。
, 百拇医药
3.凋亡小体：电镜下观察， 对照细胞核呈圆形、规则，染色质分布均匀，可见1～2个核仁。紫杉醇作用24小时，部分细胞核染色质浓集，紧靠核膜，核膜内陷，不规则。细胞外可见凋亡小体，内有浓集染色质，胞浆物质浓缩(图1，2)。
图1 对照细胞核成圆形、规则，染色质分布均匀，可见1～2个核仁。 ×12 000
图2 紫杉醇(30 nmol/L)作用24小时后，细胞染色质浓集，不规则，可见凋亡小体。×7 100
4.细胞周期分布：10、30、100nmol/L浓度紫杉醇与JAR细胞作用12小时及24小时后，G2/M 期百分率随浓度增高而递增，G2/M期和S期比值也呈递增关系。随时间延长，比值升高更为明显(见表1)。
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表1 紫杉醇与JAR细胞作用后细胞周期分布(%) 作用时间
G1期
S期
G2/M期
G2/S期
12小时
对照
38.0
59.9
2.1
0.035
紫杉醇
, 百拇医药
10nmol/L
34.9
27.3
37.7
1.383
30nmol/L
19.5
75.0
5.5
0.073*
100nmol/L
15.6
, http://www.100md.com
24.9
59.4
2.386
24小时
对照
32.0
64.6
3.5
0.054
紫杉醇
10nmol/L
37.9
52
, 百拇医药
10.0
0.192
30nmol/L
60.2
4.2
35.6
8.476
100nmol/L
54.4
7.4
38.2
5.162
*为实验误差
, http://www.100md.com
三、讨论
本研究应用DNA 琼脂凝胶电泳，发现紫杉醇与JAR细胞作用后，出现典型的DNA断裂条带，且条带密度和紫杉醇作用时间及浓度呈依赖关系。应用核酸染色及电镜观察，出现明显的凋亡小体，细胞形态与文献报道相同，提示紫杉醇诱导JAR细胞死亡是一个凋亡过程。
Bhalla等[1]的研究发现，紫杉醇诱导早粒细胞性白血病细胞(HL-60)凋亡发生在分裂期阻滞之后。Donaldson等[5]也发现，紫杉醇对细胞周期同步在G0/G1期和G2/M期的细胞，均能在20小时内诱导细胞凋亡，而且G0/G1期细胞和G2/M 期细胞一样，也经历了分裂期阻滞，提示紫杉醇诱发的细胞分裂期阻滞是凋亡发生的重要前提。本研究发现，绒癌JAR细胞在紫杉醇作用12小时后明显被阻滞在G2/M期，而此时细胞尚未崩解成凋亡小体，提示由于紫杉醇的作用，细胞 DNA 受到损害，细胞阻滞在分裂期，但损害不能被内在机制修复，从而激活促细胞凋亡的因子，使细胞发生凋亡。
, http://www.100md.com
绒癌是当前对化疗最敏感的恶性肿瘤之一。近年来，虽然治愈率不断提高，但对耐药患者仍无有效药物。紫杉醇具有和以往药物不同的独特作用机理，提示可用于对绒癌耐药患者的治疗。
参考文献
1 Bhalla K, Huang Y, Tang C, et al. Taxol induces internucleosomal DNA fragmentation associated with programmed cell death in human myeloid leukemia cell. Leukemia, 1993, 7: 563-575.
2 Willingham M, Bhalla K. Transient mitotic phase localization of bcl-2 oncoprotein in human carcinoma cells and its possible role in prevention of apoptosis. J Histochem Cytochem, 1994, 42: 441-450.
, 百拇医药
3 陈丽荣，郑树，Willingham MC, et al. 紫杉醇诱发人乳癌细胞凋亡的机制研究. 中华肿瘤杂志，1997，19：103-105.
4 陈啸梅，周文郁，彭俊云主编.组织化学手册.北京：人民卫生出版社，1982.47-48.
5 Donaldson KL, Godlsby G, Kiener DA, et al. Activation of p34 cdc2 coincident with taxol-induced apoptosis. Cell Growth Differ, 1994, 5: 1041-1050.
(收稿：1998-02-26 修回：1998-11-19), http://www.100md.com
单位：300006 杭州，浙江医科大学附属妇产科医院
关键词：
中华妇产科杂志990220 紫杉醇对晚期卵巢癌及转移性乳腺癌、肺癌具有明显疗效。紫杉醇具有独特的抗肿瘤机理，其诱导细胞调亡仅在白血病、卵巢癌及乳腺癌的体外实验中有所报道[1-3]。本研究旨在阐明紫杉醇诱导绒癌细胞调亡的生化、形态学以及细胞周期的改变，以探讨其发生机理。
一、材料和方法
1.细胞株及细胞培养： 人绒癌JAR细胞株由中国科学院上海细胞所细胞库提供，含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，于5%CO2,37℃孵箱内孵育。
2.DNA琼脂凝胶电泳： 紫杉醇(北京协和药厂生产)分为1、3、10、30 、100nmol/L 5种浓度。生理盐水作为对照。作用24小时后收集细胞，蛋白酶裂解，酚-氯仿纯化，1.5% 琼脂电泳，成像仪摄片并记录。
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3.核酸染色(Feulgen反应)： 紫杉醇药物处理JAR 细胞24小时后，用组织化学方法对核酸进行染色[4]。
4.电镜观察调亡小体： 设对照及30nmol/L浓度各1例，常规超薄切片，铀铅染色后电镜观察。
5.测定细胞周期分布：设紫杉醇10、30、100nmol/L及对照，12小时、48小时两种时间，经FACs型流式细胞仪测定细胞周期分布百分率。
二、结果
1.JAR细胞DNA的断裂情况： 30nmol/L以上浓度的紫杉醇与JAR细胞作用24小时后，可见典型的“阶梯状”DNA断裂条带，条带密度随紫杉醇浓度升高而增高。另一方面，100nmol/L紫杉醇与JAR细胞作用18小时后，也出现DNA断裂条带。
2.JAR细胞核酸形态的改变： 对照细胞核大，染色均匀，核边界清楚。随着紫杉醇浓度的升高，细胞染色质浓集，细胞变小，低浓度时可清晰分辨染色体，而高浓度时染色体浓集成点状。
, 百拇医药
3.凋亡小体：电镜下观察， 对照细胞核呈圆形、规则，染色质分布均匀，可见1～2个核仁。紫杉醇作用24小时，部分细胞核染色质浓集，紧靠核膜，核膜内陷，不规则。细胞外可见凋亡小体，内有浓集染色质，胞浆物质浓缩(图1，2)。
图1 对照细胞核成圆形、规则，染色质分布均匀，可见1～2个核仁。 ×12 000
图2 紫杉醇(30 nmol/L)作用24小时后，细胞染色质浓集，不规则，可见凋亡小体。×7 100
4.细胞周期分布：10、30、100nmol/L浓度紫杉醇与JAR细胞作用12小时及24小时后，G2/M 期百分率随浓度增高而递增，G2/M期和S期比值也呈递增关系。随时间延长，比值升高更为明显(见表1)。
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表1 紫杉醇与JAR细胞作用后细胞周期分布(%) 作用时间
G1期
S期
G2/M期
G2/S期
12小时
对照
38.0
59.9
2.1
0.035
紫杉醇
, 百拇医药
10nmol/L
34.9
27.3
37.7
1.383
30nmol/L
19.5
75.0
5.5
0.073*
100nmol/L
15.6
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24.9
59.4
2.386
24小时
对照
32.0
64.6
3.5
0.054
紫杉醇
10nmol/L
37.9
52
, 百拇医药
10.0
0.192
30nmol/L
60.2
4.2
35.6
8.476
100nmol/L
54.4
7.4
38.2
5.162
*为实验误差
, http://www.100md.com
三、讨论
本研究应用DNA 琼脂凝胶电泳，发现紫杉醇与JAR细胞作用后，出现典型的DNA断裂条带，且条带密度和紫杉醇作用时间及浓度呈依赖关系。应用核酸染色及电镜观察，出现明显的凋亡小体，细胞形态与文献报道相同，提示紫杉醇诱导JAR细胞死亡是一个凋亡过程。
Bhalla等[1]的研究发现，紫杉醇诱导早粒细胞性白血病细胞(HL-60)凋亡发生在分裂期阻滞之后。Donaldson等[5]也发现，紫杉醇对细胞周期同步在G0/G1期和G2/M期的细胞，均能在20小时内诱导细胞凋亡，而且G0/G1期细胞和G2/M 期细胞一样，也经历了分裂期阻滞，提示紫杉醇诱发的细胞分裂期阻滞是凋亡发生的重要前提。本研究发现，绒癌JAR细胞在紫杉醇作用12小时后明显被阻滞在G2/M期，而此时细胞尚未崩解成凋亡小体，提示由于紫杉醇的作用，细胞 DNA 受到损害，细胞阻滞在分裂期，但损害不能被内在机制修复，从而激活促细胞凋亡的因子，使细胞发生凋亡。
, http://www.100md.com
绒癌是当前对化疗最敏感的恶性肿瘤之一。近年来，虽然治愈率不断提高，但对耐药患者仍无有效药物。紫杉醇具有和以往药物不同的独特作用机理，提示可用于对绒癌耐药患者的治疗。
参考文献
1 Bhalla K, Huang Y, Tang C, et al. Taxol induces internucleosomal DNA fragmentation associated with programmed cell death in human myeloid leukemia cell. Leukemia, 1993, 7: 563-575.
2 Willingham M, Bhalla K. Transient mitotic phase localization of bcl-2 oncoprotein in human carcinoma cells and its possible role in prevention of apoptosis. J Histochem Cytochem, 1994, 42: 441-450.
, 百拇医药
3 陈丽荣，郑树，Willingham MC, et al. 紫杉醇诱发人乳癌细胞凋亡的机制研究. 中华肿瘤杂志，1997，19：103-105.
4 陈啸梅，周文郁，彭俊云主编.组织化学手册.北京：人民卫生出版社，1982.47-48.
5 Donaldson KL, Godlsby G, Kiener DA, et al. Activation of p34 cdc2 coincident with taxol-induced apoptosis. Cell Growth Differ, 1994, 5: 1041-1050.
(收稿：1998-02-26 修回：1998-11-19), http://www.100md.com