孕妇血清中乙型肝炎病毒DNA含量与胎儿宫内感染的关系
作者：刘志华 徐德忠 闫永平 门可 张景霞 徐剑秋 蒋美玲
单位：710033 西安，第四军医大学流行病学教研室(刘志华，徐德忠，闫永平，门可，张景霞)；陕西省妇幼保健院(徐剑秋，蒋美玲)
关键词：肝炎病毒；乙型；疾病传播；垂直；DNA；病毒；肝炎；乙型
中华妇产科杂志990301 【摘要】 目的 探讨孕妇血清中乙型肝炎病毒DNA (HBV DNA)含量与胎儿宫内感染发生率的关系。方法 用斑点杂交法检测185例乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阳性孕妇血清中HBV DNA及新生儿HBsAg。结果 胎儿发生宫内感染与其母亲血清HBV DNA含量有关，随着孕妇血清中HBV DNA含量的增高，胎儿发生宫内感染的危险性也呈增高的趋势。结论 孕妇血清HBV DNA含量升高是胎儿发生乙型肝炎病毒感染的重要因素之一。
The Relationship of Serum Hepatitis B Virus DNA Load in HBsAg Positive Pregnant Women to the Intrauterine Infection of Newborns LIU Zhihua, XU Dezhong, YAN Yongping, et al. Fourth Military Medical University, Xi'an 710033
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To study the relationship of serum hepatitis B virus (HBV) DNA load in HBsAg positive pregnant women to intrauterine infection of their newborns. Methods Serum HBV DNA were determined by dot-blot hybridization in 185 HBsAg positive pregnant women. Serum HBsAg were tested by ELISA in their newborns within 24 hours after birth. Results The prevalence of intrauterine HBV infection of the newborns was associated with the HBV DNA level of the mothers. With the increase of serum HBV DNA load, the risk of fetal intrauterine infection was increasing. Conclusion Fetal exposure to high level of maternal HBV DNA is one of the important determinant of intrauterine infection.
, 百拇医药
【Key words】 Hepatitis B virus Disease transmission， vertical DNA, virus Hepatitis B
乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)可经垂直传播感染胎儿。新生儿出生后即使接种乙肝疫苗和乙肝高效价免疫球蛋白，也不能阻止其发展成为慢性HBV携带者，仍然是HBV的潜在传染源[1]。因此，宫内感染在世界上的乙肝高发区是一个重大的公共卫生问题。HBV DNA是衡量传染性的直接指标。我们用斑点杂交法检测孕妇血清中的HBV DNA含量，探讨孕妇血清HBV DNA含量与胎儿宫内感染的关系。
资料和方法
一、研究对象
1995～1997年在陕西省妇幼保健院产前门诊筛选乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性的孕妇185例为研究对象。于孕妇分娩前采集静脉血，将分离的血清贮存于-20℃，其新生儿于分娩后24小时内注射乙肝疫苗之前采股静脉血检测HBsAg。新生儿出生后24小时内HBsAg阳性为胎儿宫内感染。
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二、方法
1.血清学检测：孕妇血清HBsAg指标检测，新生儿HBsAg检测采用酶联免疫吸附法(ELISA)，试剂盒购自上海实业科华生物技术公司，操作按说明书进行，阳性与阴性之比≥2.1为阳性。
2.HBV DNA斑点杂交：(1)HBV DNA全基因探针的制备：由PCP19重组质粒中分离。(2)探针的标记：采用地高辛标记(试剂盒购自德国Boehringer Mannheim公司)。HBV探针的标记用随机引物法，显色法检测标记活性。(3)血清标本处理：采用酚-氯仿抽提法[2]。(4)斑点杂交试验：按试剂盒操作程序进行。(5)孕妇血清HBV DNA定量方法：将标准HBV DNA样品(1 ng/μl)按如下稀释度进行稀释，1∶100、1∶200、1∶1 000、1∶2 000、1∶10 000、1∶100 000。其浓度分别为10、5、1、0.5、0.1、0.01 pg/μl。以系列稀释的样品为标准阳性对照，进行斑点杂交，根据杂交信号的强弱分为5个等级，0级<0.01 pg/μl，1级<0.1 pg/μl，2级<0.5 pg/μl，3级<5.0 pg/μl，4级>5.0 pg/μl。用薄层扫描仪(SHIMAZU,CS-9000)对杂交斑点进行扫描，根据不同浓度的标准HBV DNA杂交斑点的扫描峰值作标准曲线，然后以样品杂交斑点的扫描峰值在标准曲线上求出其HBV DNA含量。
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三、统计学方法
等级资料采用线性趋式分析。数据用EPI(5.0版)软件处理。
结 果
一、宫内感染的发生情况
185例HBsAg阳性孕妇所分娩的新生儿的血清经ELISA检测，有8例HBsAg阳性，宫内感染率为4.3%。
二、孕妇血清HBV DNA含量与胎儿宫内感染
胎儿宫内感染率，随着孕妇血清HBV DNA含量的增加而呈增高趋势(χ2＝15.49，P<0.01)。因0级宫内感染为0例，故将0级与1级合并，再计算各层OR值，OR值从1.00升至31.43，也呈增高的趋势。见表1。
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表1 孕妇血清HBV DNA分级与胎儿宫内感染的关系 HBV DNA分级
总例数
宫内感染
OR值
例数
百分比(%)
0级
39
0
0.00…
1级
72
, http://www.100md.com 1
1.39
1.00
2级
29
1
3.45
3.96
3级
18
0
0.00…
4级
27
, 百拇医药
6
22.22
31.43
讨 论 新生儿普遍接种乙肝疫苗以来，新生儿乙肝的感染率已经明显下降。但对于发生宫内感染的胎儿，出生后使用乙肝疫苗无效，极易成为慢性HBV携带者，并最终导致肝癌、肝硬化。宫内感染的原因很复杂，目前尚不明确。以往文献报道，与先兆早产、孕妇HBeAg阳性有关[2，3]。
乙型肝炎e抗原(HBeAg)是存在于病毒颗粒之外的一种可溶性蛋白，实际上是传染性的间接指标。虽然，HBeAg阳性是HBV复制的指标，但HBeAg阳性与HBV DNA并不一致。有研究证实，HBeAg阴性而抗HBe阳性的孕妇中，曾检出乙肝病毒基因[4]，这些孕妇体内存在有复制能力的突变株。突变发生于PreC的1896位点，突变形成终止密码子，导致HBeAg不能合成与分泌；另一方面，一小部分HBeAg阳性而HBV DNA阴性的孕妇，其婴儿被感染的危险性甚小[5]。
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血清HBV DNA是反映病毒在体内复制和宿主传染性的直接指标[6]。因此，用血清HBV DNA的含量估计宿主的传染性更为直接可靠。本研究结果也表明，随着孕妇血清HBV DNA含量的增加，胎儿发生宫内传染的危险性也增高。孕妇血清HBV DNA含量标志着其乙肝传染性的强弱。由此推论，孕妇传染性强是宫内感染的重要原因。
定量检测母血中HBV DNA的含量，可以反映孕妇传染性的强弱，进而估计HBsAg阳性孕妇的胎儿发生宫内感染危险性的高低，然后针对高危人群采取适当措施，以降低宫内感染的发生率。朱启榕等[7]报道，携带HBV的孕妇产前给予多次注射乙肝高效价免疫球蛋白(HBIG)可以有效减少胎儿宫内HBV感染，并推测其原理是降低了外周血HBV含量。这一问题尚待进一步研究。
本课题受国家自然科学基金资助(基金编号：39370611)
参考文献
, http://www.100md.com
1 Ghendon Y. Perinatal transmission of hepatitis B virus in high-incidence countries.J Virol Meth,1987，17:69-79.
2 林万明主编.临床基因探针诊断实验技术.上海：上海科学技术出版社,1993. 324-325.
3 门可,王福生,徐德忠，等.乙型肝炎病毒宫内感染及其相关因素的研究. 第四军医大学学报,1996，17:28-29.
4 Carman WF,Hadziyannis S,McGarvey JJ, et al. Mutation preventingformation of hepatitis B e antigen in patients with chronic hepatitis B infection. Lancet, 1989,2:588-591.
, http://www.100md.com
5 Scott JS, Pan PE, Pace RA, et al.The absence of hepatitis B virus DNA in hepatitis B e antigen positive sera from chronic hepatitis B surface antigen carriers in China.J Med Virol， 1990，30:103-106.
6 Sumazaki R, Motz M, Wolf H, et al. Detection of hepatitis B virus in serum using amplification of viral DNA by means of polymerse chain reaction.J Med Virol,1989，27:304-308.
7 朱启榕,吕晴,顾新焕，等. 阻断乙型肝炎病毒宫内传播的初步研究.中华儿科杂志,1995，33:93-95.
(收稿：1998-06-12 修回：1998-12-22), http://www.100md.com
单位：710033 西安，第四军医大学流行病学教研室(刘志华，徐德忠，闫永平，门可，张景霞)；陕西省妇幼保健院(徐剑秋，蒋美玲)
关键词：肝炎病毒；乙型；疾病传播；垂直；DNA；病毒；肝炎；乙型
中华妇产科杂志990301 【摘要】 目的 探讨孕妇血清中乙型肝炎病毒DNA (HBV DNA)含量与胎儿宫内感染发生率的关系。方法 用斑点杂交法检测185例乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)阳性孕妇血清中HBV DNA及新生儿HBsAg。结果 胎儿发生宫内感染与其母亲血清HBV DNA含量有关，随着孕妇血清中HBV DNA含量的增高，胎儿发生宫内感染的危险性也呈增高的趋势。结论 孕妇血清HBV DNA含量升高是胎儿发生乙型肝炎病毒感染的重要因素之一。
The Relationship of Serum Hepatitis B Virus DNA Load in HBsAg Positive Pregnant Women to the Intrauterine Infection of Newborns LIU Zhihua, XU Dezhong, YAN Yongping, et al. Fourth Military Medical University, Xi'an 710033
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【Abstract】 Objective To study the relationship of serum hepatitis B virus (HBV) DNA load in HBsAg positive pregnant women to intrauterine infection of their newborns. Methods Serum HBV DNA were determined by dot-blot hybridization in 185 HBsAg positive pregnant women. Serum HBsAg were tested by ELISA in their newborns within 24 hours after birth. Results The prevalence of intrauterine HBV infection of the newborns was associated with the HBV DNA level of the mothers. With the increase of serum HBV DNA load, the risk of fetal intrauterine infection was increasing. Conclusion Fetal exposure to high level of maternal HBV DNA is one of the important determinant of intrauterine infection.
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【Key words】 Hepatitis B virus Disease transmission， vertical DNA, virus Hepatitis B
乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)可经垂直传播感染胎儿。新生儿出生后即使接种乙肝疫苗和乙肝高效价免疫球蛋白，也不能阻止其发展成为慢性HBV携带者，仍然是HBV的潜在传染源[1]。因此，宫内感染在世界上的乙肝高发区是一个重大的公共卫生问题。HBV DNA是衡量传染性的直接指标。我们用斑点杂交法检测孕妇血清中的HBV DNA含量，探讨孕妇血清HBV DNA含量与胎儿宫内感染的关系。
资料和方法
一、研究对象
1995～1997年在陕西省妇幼保健院产前门诊筛选乙型肝炎表面抗原(HBsAg)阳性的孕妇185例为研究对象。于孕妇分娩前采集静脉血，将分离的血清贮存于-20℃，其新生儿于分娩后24小时内注射乙肝疫苗之前采股静脉血检测HBsAg。新生儿出生后24小时内HBsAg阳性为胎儿宫内感染。
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二、方法
1.血清学检测：孕妇血清HBsAg指标检测，新生儿HBsAg检测采用酶联免疫吸附法(ELISA)，试剂盒购自上海实业科华生物技术公司，操作按说明书进行，阳性与阴性之比≥2.1为阳性。
2.HBV DNA斑点杂交：(1)HBV DNA全基因探针的制备：由PCP19重组质粒中分离。(2)探针的标记：采用地高辛标记(试剂盒购自德国Boehringer Mannheim公司)。HBV探针的标记用随机引物法，显色法检测标记活性。(3)血清标本处理：采用酚-氯仿抽提法[2]。(4)斑点杂交试验：按试剂盒操作程序进行。(5)孕妇血清HBV DNA定量方法：将标准HBV DNA样品(1 ng/μl)按如下稀释度进行稀释，1∶100、1∶200、1∶1 000、1∶2 000、1∶10 000、1∶100 000。其浓度分别为10、5、1、0.5、0.1、0.01 pg/μl。以系列稀释的样品为标准阳性对照，进行斑点杂交，根据杂交信号的强弱分为5个等级，0级<0.01 pg/μl，1级<0.1 pg/μl，2级<0.5 pg/μl，3级<5.0 pg/μl，4级>5.0 pg/μl。用薄层扫描仪(SHIMAZU,CS-9000)对杂交斑点进行扫描，根据不同浓度的标准HBV DNA杂交斑点的扫描峰值作标准曲线，然后以样品杂交斑点的扫描峰值在标准曲线上求出其HBV DNA含量。
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三、统计学方法
等级资料采用线性趋式分析。数据用EPI(5.0版)软件处理。
结 果
一、宫内感染的发生情况
185例HBsAg阳性孕妇所分娩的新生儿的血清经ELISA检测，有8例HBsAg阳性，宫内感染率为4.3%。
二、孕妇血清HBV DNA含量与胎儿宫内感染
胎儿宫内感染率，随着孕妇血清HBV DNA含量的增加而呈增高趋势(χ2＝15.49，P<0.01)。因0级宫内感染为0例，故将0级与1级合并，再计算各层OR值，OR值从1.00升至31.43，也呈增高的趋势。见表1。
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表1 孕妇血清HBV DNA分级与胎儿宫内感染的关系 HBV DNA分级
总例数
宫内感染
OR值
例数
百分比(%)
0级
39
0
0.00…
1级
72
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1.39
1.00
2级
29
1
3.45
3.96
3级
18
0
0.00…
4级
27
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6
22.22
31.43
讨 论 新生儿普遍接种乙肝疫苗以来，新生儿乙肝的感染率已经明显下降。但对于发生宫内感染的胎儿，出生后使用乙肝疫苗无效，极易成为慢性HBV携带者，并最终导致肝癌、肝硬化。宫内感染的原因很复杂，目前尚不明确。以往文献报道，与先兆早产、孕妇HBeAg阳性有关[2，3]。
乙型肝炎e抗原(HBeAg)是存在于病毒颗粒之外的一种可溶性蛋白，实际上是传染性的间接指标。虽然，HBeAg阳性是HBV复制的指标，但HBeAg阳性与HBV DNA并不一致。有研究证实，HBeAg阴性而抗HBe阳性的孕妇中，曾检出乙肝病毒基因[4]，这些孕妇体内存在有复制能力的突变株。突变发生于PreC的1896位点，突变形成终止密码子，导致HBeAg不能合成与分泌；另一方面，一小部分HBeAg阳性而HBV DNA阴性的孕妇，其婴儿被感染的危险性甚小[5]。
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血清HBV DNA是反映病毒在体内复制和宿主传染性的直接指标[6]。因此，用血清HBV DNA的含量估计宿主的传染性更为直接可靠。本研究结果也表明，随着孕妇血清HBV DNA含量的增加，胎儿发生宫内传染的危险性也增高。孕妇血清HBV DNA含量标志着其乙肝传染性的强弱。由此推论，孕妇传染性强是宫内感染的重要原因。
定量检测母血中HBV DNA的含量，可以反映孕妇传染性的强弱，进而估计HBsAg阳性孕妇的胎儿发生宫内感染危险性的高低，然后针对高危人群采取适当措施，以降低宫内感染的发生率。朱启榕等[7]报道，携带HBV的孕妇产前给予多次注射乙肝高效价免疫球蛋白(HBIG)可以有效减少胎儿宫内HBV感染，并推测其原理是降低了外周血HBV含量。这一问题尚待进一步研究。
本课题受国家自然科学基金资助(基金编号：39370611)
参考文献
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1 Ghendon Y. Perinatal transmission of hepatitis B virus in high-incidence countries.J Virol Meth,1987，17:69-79.
2 林万明主编.临床基因探针诊断实验技术.上海：上海科学技术出版社,1993. 324-325.
3 门可,王福生,徐德忠，等.乙型肝炎病毒宫内感染及其相关因素的研究. 第四军医大学学报,1996，17:28-29.
4 Carman WF,Hadziyannis S,McGarvey JJ, et al. Mutation preventingformation of hepatitis B e antigen in patients with chronic hepatitis B infection. Lancet, 1989,2:588-591.
, http://www.100md.com
5 Scott JS, Pan PE, Pace RA, et al.The absence of hepatitis B virus DNA in hepatitis B e antigen positive sera from chronic hepatitis B surface antigen carriers in China.J Med Virol， 1990，30:103-106.
6 Sumazaki R, Motz M, Wolf H, et al. Detection of hepatitis B virus in serum using amplification of viral DNA by means of polymerse chain reaction.J Med Virol,1989，27:304-308.
7 朱启榕,吕晴,顾新焕，等. 阻断乙型肝炎病毒宫内传播的初步研究.中华儿科杂志,1995，33:93-95.
(收稿：1998-06-12 修回：1998-12-22), http://www.100md.com