转化生长因子在孕鼠胚胎及胎盘发育中的作用
作者：邹丽 黄瑛 徐可树 易青
单位：邹丽,黄瑛,易青(430022 武汉，同济医科大学附属协和医院妇产科)；徐可树(消化内科)
关键词：
中华妇产科杂志990417 近年来的研究发现,转化生长因子(transforming growth gactor，TGF)β1在胚胎植入部位大量表达，能明显抑制体外滋养细胞的增殖，干扰其分化[1]，调控其对子宫内膜及血管壁的侵蚀作用[2,3]。本研究以给予外源性TGFβ1，构建一个腹腔局部高浓度TGFβ1的动物模型，通过检测孕鼠胚胎及胎盘形态学指标，了解其对大鼠胚胎及胎盘发育的影响。
一、材料与方法
1.实验动物:选择体重220～250 g普通级雌性Wistar大鼠,室温18～28℃,相对湿度40%～70%，屏障系统内饲养，不控制饮食。雌鼠发情期以1∶1比例与雄鼠同笼饲养，每日观察阴栓脱落情况，阴栓脱落之日定为妊娠第0天。
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2.实验方法： (1)试剂与仪器：TGFβ1(美国UPSTATS生物技术公司生产)，小鼠抗人细胞角蛋白单抗(pan-cytokeratin,CK)(美国SIGMA公司生产)，链霉亲合素-生物素免疫组化染色试剂盒和二氨联苯胺(购自武汉博士德生物工程有限公司),切片机，MPIAS-500多媒体彩色病理图像分析系统。 (2)实验分组：将雌鼠随机分为3组，即A、B、C组，每组16只。A组：孕早期给药，自受孕第1天起，每日腹腔内注射TGFβ1 (10 μg/L) 1 ml至第10天止；B组：孕晚期给药，自受孕第11天起，每日腹腔内注射TGFβ1 (10 μg/L) 1 ml至第18天止；C组：空白对照，自受孕第1天起，每日腹腔内注射生理盐水1 ml至第10天止。3组孕鼠均分别于妊娠第6、10、14、18天处死，剖宫取胎，观察并记录胎鼠数及重量、胎盘重量及大小，对子宫和胎盘进行组织学检查。 (3)组织学标本制备及染色：取子宫和胎盘组织经10%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，采用免疫组化ABC法进行检测。阳性对照用CK阳性的鳞癌标本，磷酸盐缓冲液(PBS)代替I抗作阴性对照。每个标本兼作HE染色。 (4)染色结果判定: 根据阳性细胞数作半定量计算：(-)：阳性细胞数<5%；(+)：阳性细胞数5%～30%；(+ +)：阳性细胞数30%～50%；(+ + +)：阳性细胞数>50%；用MPIAS-500多媒体彩色病理图像分析系统测量阳性细胞积分吸光度(A)值。
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3.统计学方法： 采用配对t检验对计量资料进行分析。
二、结果
1.胎鼠及胎盘重量测量：3组(48只)孕鼠的子鼠数均为8～11只，3组之间比较，差异无显著性。A组胎鼠发育迟缓,见表1。胎盘重量从第6天起呈线性递增(其中B组与C组胎盘增长速度大于A组)，第14天后不再增长，即达平台值。
表1 3组胎鼠重量比较(g,
±s) 组别
第6天
第10天
第14天
第18天
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A组
0.64±0.11*
1.07±0.31*
2.44±0.13*
4.05±0.26*
B组
0.80±0.11
1.31±0.07
2.56±0.12
4.59±0.07
C组
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0.81±0.09
1.29±0.09
2.65±0.14
4.60±0.09
*与C组比较，P<0.05
2.胎盘及子宫组织切片染色结果：胎盘组织免疫组化染色切片中，阳性染色表现为胞浆呈棕黄色，胞核呈蓝色。3组孕鼠组织切片阳性细胞数见表2。
表2 3组孕鼠胎盘免疫组化染色阳性细胞数比较 组别
第6天
第10天
第14天
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第18天
A组
+
+
-
-
B组
+
+ +
+
-
C组
+
+ +
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+
-
A组胎盘病理学改变主要表现为：(1)妊娠第6、10、14、18天时，胎盘的阳性细胞数均较C组相应减少，免疫组化阳性细胞积分A值显示，第10、14天最高；(2)某些阳性细胞形态发生改变，细胞皱缩变长，呈塌陷状；(3)与C组中典型阳性细胞具有同样形态的细胞，免疫组化染色为阴性；(4)阳性细胞侵入子宫壁的深度变浅或不浸润，肌层很难见到阳性细胞；(5)阳性细胞浸润血管的现象减少；(6)基带滋养层增厚。B组形态学改变不明显。
三、讨论
1.TGFβ1对胚胎及胎盘发育的影响：TGFβ1在人和动物的胚胎及胎盘发育中起着非常重要的作用。本实验发现，高浓度的TGFβ1可导致胚胎及胎盘发育迟缓。其作用机理可能与TGFβ1调控滋养细胞的增殖、分化及其对子宫内膜及血管壁的侵蚀有关。滋养细胞的分化存在两种途径：由细胞滋养细胞直接分化为合体滋养细胞，或由细胞滋养细胞演变为中间型滋养细胞，再分化为合体滋养细胞[4]。国外许多文献报道， CK是滋养细胞较特异的一种表型标志，在从细胞滋养细胞到合体滋养细胞的正常分化过程中，滋养细胞将改变其形态和酶组织学特征。缺氧等刺激将会促使细胞滋养细胞增殖并融合成为合体滋养细胞，在此过程中，始终伴随着滋养细胞表达CK的改变[5]。我们认为，本实验免疫组化染色的阳性细胞为中间型滋养细胞。由于中间型滋养细胞对子宫内膜及血管壁的侵蚀力最强，这种侵蚀力不仅是决定胚胎着床深浅的关键因素，而且是形成正常的绒毛间隙以利于胎儿与母体之间进行血液和物质交换的前提条件。
, 百拇医药
2.TGFβ1对滋养细胞增殖分化及侵蚀力的影响：滋养细胞分泌的TGFβ1作为一种局部细胞因子，以自分泌或旁分泌的方式作用于自身及周边的滋养细胞,对其增殖分化产生影响。本研究显示，孕早期注射TGFβ1后，各期细胞表达CK的强度减弱，说明TGFβ1对滋养细胞的增殖及分化有明显的抑制作用,促使滋养细胞衰老，因而其对子宫内膜及血管壁的侵蚀力也减弱。本研究亦发现，孕早期注射TGFβ1后，滋养细胞对子宫内膜的侵蚀程度及其侵入螺旋动脉取代血管内皮细胞的行为均明显减弱,表明TGFβ1可减弱滋养细胞尤其是中间型滋养细胞的侵蚀力。
此外，本研究还发现TGFβ1仅对孕早期胚胎及胎盘的植入和发育过程起作用，而对孕晚期则无明显效应。
本课题受国家自然科学基金资助(基金编号：39610710055)
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参考文献
1 Hamlin GP, Soaves MJ. Regulation of deoxyribonucleic acid synthesis in proliferating and differentiating trophoblast cells: involvement of transferrin, transforming growth factor β and tyrosine kinases. Endocrinology, 1995, 136:322-331.
2 Graham CH, Lala PK. Mechanism of control of trophoblast invasion in situ. J Cell Physiol, 1991,148:228-234.
3 Strickland S, Richards WG. Invasion of the trophoblasts. Cell, 1992,77:355-357.
, 百拇医药
4 Yeh IT, Kurman RJ. Functional and morphologic expression of trophoblast. Lab Invest, 1989,61:1-4.
5 Neudeck H, Oei SL, Stiemer B, et al. Binding of antibodies against high and low molecular weight cytokeratin proteins in the human placenta with special reference to infarcts, proliferation and differentiation processes. Histochemical Journal, 1997,29:419-430.
(收稿：1998-08-17 修回：1998-12-08), 百拇医药
单位：邹丽,黄瑛,易青(430022 武汉，同济医科大学附属协和医院妇产科)；徐可树(消化内科)
关键词：
中华妇产科杂志990417 近年来的研究发现,转化生长因子(transforming growth gactor，TGF)β1在胚胎植入部位大量表达，能明显抑制体外滋养细胞的增殖，干扰其分化[1]，调控其对子宫内膜及血管壁的侵蚀作用[2,3]。本研究以给予外源性TGFβ1，构建一个腹腔局部高浓度TGFβ1的动物模型，通过检测孕鼠胚胎及胎盘形态学指标，了解其对大鼠胚胎及胎盘发育的影响。
一、材料与方法
1.实验动物:选择体重220～250 g普通级雌性Wistar大鼠,室温18～28℃,相对湿度40%～70%，屏障系统内饲养，不控制饮食。雌鼠发情期以1∶1比例与雄鼠同笼饲养，每日观察阴栓脱落情况，阴栓脱落之日定为妊娠第0天。
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2.实验方法： (1)试剂与仪器：TGFβ1(美国UPSTATS生物技术公司生产)，小鼠抗人细胞角蛋白单抗(pan-cytokeratin,CK)(美国SIGMA公司生产)，链霉亲合素-生物素免疫组化染色试剂盒和二氨联苯胺(购自武汉博士德生物工程有限公司),切片机，MPIAS-500多媒体彩色病理图像分析系统。 (2)实验分组：将雌鼠随机分为3组，即A、B、C组，每组16只。A组：孕早期给药，自受孕第1天起，每日腹腔内注射TGFβ1 (10 μg/L) 1 ml至第10天止；B组：孕晚期给药，自受孕第11天起，每日腹腔内注射TGFβ1 (10 μg/L) 1 ml至第18天止；C组：空白对照，自受孕第1天起，每日腹腔内注射生理盐水1 ml至第10天止。3组孕鼠均分别于妊娠第6、10、14、18天处死，剖宫取胎，观察并记录胎鼠数及重量、胎盘重量及大小，对子宫和胎盘进行组织学检查。 (3)组织学标本制备及染色：取子宫和胎盘组织经10%甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片，采用免疫组化ABC法进行检测。阳性对照用CK阳性的鳞癌标本，磷酸盐缓冲液(PBS)代替I抗作阴性对照。每个标本兼作HE染色。 (4)染色结果判定: 根据阳性细胞数作半定量计算：(-)：阳性细胞数<5%；(+)：阳性细胞数5%～30%；(+ +)：阳性细胞数30%～50%；(+ + +)：阳性细胞数>50%；用MPIAS-500多媒体彩色病理图像分析系统测量阳性细胞积分吸光度(A)值。
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3.统计学方法： 采用配对t检验对计量资料进行分析。
二、结果
1.胎鼠及胎盘重量测量：3组(48只)孕鼠的子鼠数均为8～11只，3组之间比较，差异无显著性。A组胎鼠发育迟缓,见表1。胎盘重量从第6天起呈线性递增(其中B组与C组胎盘增长速度大于A组)，第14天后不再增长，即达平台值。
表1 3组胎鼠重量比较(g,
±s) 组别第6天
第10天
第14天
第18天
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A组
0.64±0.11*
1.07±0.31*
2.44±0.13*
4.05±0.26*
B组
0.80±0.11
1.31±0.07
2.56±0.12
4.59±0.07
C组
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0.81±0.09
1.29±0.09
2.65±0.14
4.60±0.09
*与C组比较，P<0.05
2.胎盘及子宫组织切片染色结果：胎盘组织免疫组化染色切片中，阳性染色表现为胞浆呈棕黄色，胞核呈蓝色。3组孕鼠组织切片阳性细胞数见表2。
表2 3组孕鼠胎盘免疫组化染色阳性细胞数比较 组别
第6天
第10天
第14天
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第18天
A组
+
+
-
-
B组
+
+ +
+
-
C组
+
+ +
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+
-
A组胎盘病理学改变主要表现为：(1)妊娠第6、10、14、18天时，胎盘的阳性细胞数均较C组相应减少，免疫组化阳性细胞积分A值显示，第10、14天最高；(2)某些阳性细胞形态发生改变，细胞皱缩变长，呈塌陷状；(3)与C组中典型阳性细胞具有同样形态的细胞，免疫组化染色为阴性；(4)阳性细胞侵入子宫壁的深度变浅或不浸润，肌层很难见到阳性细胞；(5)阳性细胞浸润血管的现象减少；(6)基带滋养层增厚。B组形态学改变不明显。
三、讨论
1.TGFβ1对胚胎及胎盘发育的影响：TGFβ1在人和动物的胚胎及胎盘发育中起着非常重要的作用。本实验发现，高浓度的TGFβ1可导致胚胎及胎盘发育迟缓。其作用机理可能与TGFβ1调控滋养细胞的增殖、分化及其对子宫内膜及血管壁的侵蚀有关。滋养细胞的分化存在两种途径：由细胞滋养细胞直接分化为合体滋养细胞，或由细胞滋养细胞演变为中间型滋养细胞，再分化为合体滋养细胞[4]。国外许多文献报道， CK是滋养细胞较特异的一种表型标志，在从细胞滋养细胞到合体滋养细胞的正常分化过程中，滋养细胞将改变其形态和酶组织学特征。缺氧等刺激将会促使细胞滋养细胞增殖并融合成为合体滋养细胞，在此过程中，始终伴随着滋养细胞表达CK的改变[5]。我们认为，本实验免疫组化染色的阳性细胞为中间型滋养细胞。由于中间型滋养细胞对子宫内膜及血管壁的侵蚀力最强，这种侵蚀力不仅是决定胚胎着床深浅的关键因素，而且是形成正常的绒毛间隙以利于胎儿与母体之间进行血液和物质交换的前提条件。
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2.TGFβ1对滋养细胞增殖分化及侵蚀力的影响：滋养细胞分泌的TGFβ1作为一种局部细胞因子，以自分泌或旁分泌的方式作用于自身及周边的滋养细胞,对其增殖分化产生影响。本研究显示，孕早期注射TGFβ1后，各期细胞表达CK的强度减弱，说明TGFβ1对滋养细胞的增殖及分化有明显的抑制作用,促使滋养细胞衰老，因而其对子宫内膜及血管壁的侵蚀力也减弱。本研究亦发现，孕早期注射TGFβ1后，滋养细胞对子宫内膜的侵蚀程度及其侵入螺旋动脉取代血管内皮细胞的行为均明显减弱,表明TGFβ1可减弱滋养细胞尤其是中间型滋养细胞的侵蚀力。
此外，本研究还发现TGFβ1仅对孕早期胚胎及胎盘的植入和发育过程起作用，而对孕晚期则无明显效应。
本课题受国家自然科学基金资助(基金编号：39610710055)
, http://www.100md.com
参考文献
1 Hamlin GP, Soaves MJ. Regulation of deoxyribonucleic acid synthesis in proliferating and differentiating trophoblast cells: involvement of transferrin, transforming growth factor β and tyrosine kinases. Endocrinology, 1995, 136:322-331.
2 Graham CH, Lala PK. Mechanism of control of trophoblast invasion in situ. J Cell Physiol, 1991,148:228-234.
3 Strickland S, Richards WG. Invasion of the trophoblasts. Cell, 1992,77:355-357.
, 百拇医药
4 Yeh IT, Kurman RJ. Functional and morphologic expression of trophoblast. Lab Invest, 1989,61:1-4.
5 Neudeck H, Oei SL, Stiemer B, et al. Binding of antibodies against high and low molecular weight cytokeratin proteins in the human placenta with special reference to infarcts, proliferation and differentiation processes. Histochemical Journal, 1997,29:419-430.
(收稿：1998-08-17 修回：1998-12-08), 百拇医药