胎盘乙型肝炎病毒感染与宫内传播的关系
作者：闫永平 徐德忠 王文亮 刘斌 刘志华 门可 张景霞 徐剑秋
单位：闫永平 徐德忠 刘志华 门可 张景霞 西安 第四军医大学流行病学教研室 710032；王文亮 刘斌 病理学教研室；徐剑秋 陕西省妇幼保健院
关键词：肝炎；乙型；疾病传播；垂直；胎盘
中华妇产科杂志990702 【摘要】 目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)宫内传播的危险因素, 并追踪HBV经胎盘传播的途径和胎儿宫内感染的时间。方法 共收集了乙型肝炎表面抗原(HBsAg)携带孕妇131例，其中孕早期人工流产胎盘24例、孕中期引产胎盘和胎儿各6例、足月分娩胎盘和新生儿各101例。孕妇和新生儿血清HBsAg 和HBV DNA检测分别采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和聚合酶链反应(PCR)法。胎盘的HBsAg、HBxAg、HBcAg检测和HBV DNA检测分别采用ABC免疫组织化学染色法和原位杂交法。结果 孕早期、孕中期和足月分娩胎盘的HBV感染率分别为4.2% (1/24), 1/6, 和44.6% (45/101)。1例孕中期引产胎儿的肝脏中检测到HBV蛋白和DNA,其胎盘从母面到胎儿面各层细胞也均受染。101例新生儿中,8例(7.9%)发生了宫内感染。胎盘绒毛毛细血管内皮细胞的HBV感染发生宫内传播的相对危险度比值为18.46(95%可信限=2.83～152.78)。结论 胎盘绒毛毛细血管内皮细胞感染是宫内传播的主要危险因素。HBV经胎盘感染胎儿的途径可能是通过胎盘细胞至细胞的传递而实现的。宫内感染可发生在孕中期，但主要的发生时间是孕晚期。
, 百拇医药
The Role of Placenta in Hepatitis B Virus Intrauterine Transmission
YAN Yongping, XU Dezhong, WANG Wenliang, et al.
Fourth Military Medical University, Xi’an 710032
【Abstract】 Objectives To determine the role of placenta in hepatitis B virus (HBV) intrauterine transmission, and to trace the route of transplacental transmission and the timing of HBV infection in uterus. Methods We collected 101 term placentas and newborn infants, 24 aborted first-trimester placentas, and 6 induced aborted fetuses and placentas from 131 HBsAg carrying pregnant women. Serologic HBV markers (HBsAg and HBV DNA) of pregnant women and newborns were detected by ELISA and PCR. The HBsAg, HBxAg, HBcAg and HBV DNA in placentas were determined by ABC immunohistochemical staining and in-situ hybridization. Results The HBV infection rates of placentas from first-trimester, second-trimester to term periods were 4.2%(1/24), 1/6, and 44.6%(45/101), respectively. In one induced aborted fetal liver tissue (19-week of pregnancy), the proteins and DNA of HBV were detected, and its placental villous capillary endothelial cells were also infected. The OR of HBV infection of villous capillary endothelial cells in intrauterine transmission was 18.46(95% CI=2.83～152.78). Conclusions HBV infection of placental capillary endothelial cell is a major risk factor of intrauterine transmission. HBV transplacental transmission route may be placental cell to cell transfer. The intrauterine infection may occur as early as on the 19th week of pregnancy, but the main timing is possibly in the third-trimester of pregnancy.
, 百拇医药
【Key words】 Hepatitis B Disease transmission, vertical Placenta
乙型肝炎病毒(HBV)可经胎盘传播至胎儿,造成胎儿宫内感染。乙型肝炎表面抗原(HBsAg)携带孕妇的胎儿宫内感染率为5%～15%[1-4]。目前,有关胎盘在HBV宫内传播中的作用报道不多,而且结论不一。本研究试图对HBV宫内传播的危险因素、途径和感染时间等问题作一探讨。报道如下。
材料和方法
一、研究对象
1.孕早期妇女:选择1995年10月至12月,在陕西省妇幼保健院门诊手术室行人工流产术的孕妇，共计287例(孕40～90天),其中24例为HBsAg阳性。
2.孕中期妇女及其胎儿:选择1995年9月至1996年12月,在陕西省妇幼保健院因各种指征行水囊引产术的HBsAg阳性孕妇及其胎儿，各6例(孕19～24周)。
, 百拇医药
3.足月分娩妇女及其新生儿:选择1995年9月至1997年2月,陕西省妇幼保健院HBsAg阳性的足月分娩孕妇及其新生儿，各101例(孕37～43周)。
二、标本收集及处理
1.外周血血清：不同孕期孕妇于术前或分娩前、后采肘静脉血3～5ml；新生儿于出生后24小时内,于注射乙肝高效价免疫球蛋白和乙肝疫苗前,采股静脉血1ml,分离血清，-20℃保存待检。
2.胎盘和引产胎儿不同器官的处理：(1)孕早期胎盘:负压吸宫人工流产术后,立即挑选较完整的绒毛样胎盘组织,浸入约10倍体积的4%多聚甲醛液中固定；(2)孕中期和足月分娩胎盘:于胎盘娩出后30分钟内，切取大小约1cm×1cm×2cm的胎盘组织,浸入上述固定液中；(3)孕中期引产胎儿不同器官:主要包括肝、肾、脾、卵巢或睾丸，上述组织于胎儿娩出后1小时内，行尸体解剖取出各脏器,然后切取大小约0.5cm×0.3cm×0.3cm的组织块,按上述胎盘处理方法进行固定。
, 百拇医药
上述组织标本固定1～2周后,取材、包埋、石蜡固定、连续5 μm切片,待检。
三、实验室检测
1.外周血HBV检测: HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe和抗-HBc检测，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)。HBV DNA检测采用聚合酶链反应(PCR)法[5]。
2.胎盘和引产胎儿不同组织 HBsAg、HBcAg和HBxAg检测：采用ABC免疫组化染色法,试剂盒购自美国Vecta公司。HBV DNA检测采用原位杂交法,地高辛标记和检测试剂盒购自德国Boehringer Mannheim公司。检测方法见文献[6,7]。
四、HBV宫内感染的结果判定
1.胎盘HBV感染的诊断方法: 胎盘不同类型细胞中HBsAg、HBcAg、HBxAg和HBV DNA任一项指标阳性。
, 百拇医药
2.新生儿外周血的检测：新生儿在出生后24小时内,注射乙肝高效价免疫球蛋白和乙肝疫苗前,检测其外周血HBsAg和(或)HBV DNA呈阳性者。
3.胎儿组织的检测：引产胎儿肝脏中检出HBV DNA和HBsAg、HBxAg及HBcAg阳性者。
五、统计学方法
相对危险度的比值比(OR)和趋势χ2检验等计算，均在EPI (5.0版)软件上进行。
结果
一、孕早期妇女及其胎盘HBV感染状况
24例HBsAg阳性孕妇孕早期人工流产的绒毛状组织，经免疫组织化学染色和原位杂交检测，发现有1例蜕膜细胞HBsAg、HBxAg和HBcAg呈棕色阳性着染, HBV DNA呈蓝色颗粒状阳性染色。HBsAg和HBxAg主要位于受感染细胞的胞浆中,呈散在分布。HBcAg和HBV DNA位于受感染细胞的胞核中，呈散在分布。其滋养层细胞和绒毛间质细胞均未见阳性染色。而其他23例胎盘的各类组织细胞均呈阴性染色。孕早期胎盘的HBV感染率为4.2%(1/24)。
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二、孕中期引产胎盘和胎儿HBV感染状况
1.胎盘HBV感染情况：6例HBsAg阳性孕妇胎盘中,1例(病例序号I002)蜕膜细胞、合体滋养细胞和细胞滋养层细胞、绒毛间质细胞及绒毛毛细血管内皮细胞HBsAg、HBxAg、HBcAg和HBV DNA均呈阳性染色。有阳性染色在细胞中的部位分布同孕早期。其余9例胎盘各类细胞均呈阴性染色(表1)。
表1 6例HBsAg阳性孕妇引产胎盘免疫组化和原位杂交染色结果 病例
序号
蜕膜细胞
滋养层细胞
绒毛间质细胞
绒毛毛细血管内皮细胞
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IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
IHC
ISH
I001
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I002
+
+
+
+
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+
+
I003
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I004
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I005
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I006
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注：IHC：免疫组织化学染色； ISH：原位杂交
2. 引产胎儿肝、脾、肾和睾丸或卵巢HBV感染情况：在6例胎儿的肝、脾、肾和2例睾丸、4例卵巢中,有1例(病例序号I002)胎儿肝细胞HBsAg和HBcAg免疫组织化学均呈阳性染色，HBsAg弥漫分布于肝细胞的胞浆中,HBcAg散在分布于肝细胞的胞核中。该例胎儿的肝细胞HBV DNA也呈阳性染色，散在分布,主要见于受感染细胞的胞核中。而在该例胎儿的脾、肾和卵巢组织中未见HBV DNA阳性染色。其余5例肝、脾、肾和2例睾丸、3例卵巢HBV DNA原位杂交均呈阴性。孕中期引产胎儿的HBV感染率为(1/6)。
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三、足月分娩胎盘和新生儿HBV感染状况
101例足月分娩胎盘中,HBsAg、HBxAg和HB- cAg阳性率分别为33.7% (34/101)、37.6%(38/101)和20.8%(21/101)，感染的细胞多呈局灶性分布,少数可见弥漫性分布。45例(44.6%)呈HBV DNA阳性染色，感染的细胞多呈局灶性分布,少数呈弥漫性分布。胎盘HBV总的感染率为44.6%(45/101)。胎盘蜕膜HBV感染率为43.6% (44/101)。胎盘屏障中细胞感染率为40.6%(41/101),其中滋养层细胞为40.6%(41/101),绒毛间质细胞为36.6% (37/101),绒毛毛细血管内皮细胞为18.8% (19/101)。45例受感染的胎盘中，6例新生儿发生宫内HBV感染，而56例未感染的胎盘中，仅2例发生HBV宫内感染，OR值为4.15， 95%可信限(95%CI)为0.69-32.06(χ2=2.06, P=0.15)。
在胎盘不同类型细胞HBV感染中，蜕膜细胞、滋养层细胞、绒毛间质细胞和绒毛毛细血管内皮细胞的HBV感染发生宫内传播的OR值分别为4.34、5.21、6.00和18.46(表2)。表2 胎盘不同类型细胞HBV感染与宫内感染的关系 细胞类型
, 百拇医药
发生宫
内感染
例数
未发生宫
内感染
例数
OR值
95%CI
P值
+
-
+
-
蜕膜细胞
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6
2
38
55
4.34
0.72～ 33.53
0.134 3
滋养层细胞
6
2
34
59
5.21
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0.86～ 40.32
0.079 0
绒毛间质
6
2
31
62
6.00
0.99～ 46.61
0.049 4
细胞
绒毛毛细血管
6
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2
13
80
18.46
2.83～152.78
0.000 2
内皮细胞
讨论
一、胎盘的HBV感染
Lucifora等[8,9]分别在3例和9例HBsAg携带孕妇的足月分娩胎盘中，发现有HBsAg和HBcAg的存在。本研究结果表明，在不同孕期的胎盘组织细胞中不但有HBV蛋白的存在,而且还有HBV DNA存在。HBsAg和HBxAg主要位于受感染细胞的胞浆内,而HBcAg和HBV DNA主要位于胞核内。从而提示，HBV可进入不同孕期胎盘的细胞内,并且很可能在其中复制和表达。
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二、宫内感染HBV的危险因素
在101新生儿中,8例出生时检测出HBsAg和(或)HBV DNA,宫内感染率为7.92%。与既往报道的宫内感染率5%～15%一致。
唐时幸等[5]应用斑点杂交,在2例引产的胎盘中检测到HBV DNA，并认为HBV可通过胎盘屏障,或先感染胎盘并在其中复制再感染胎儿。但究竟是胎盘的哪些细胞受到感染尚不清楚。本研究发现，在6例孕中期引产的胎盘中有1例蜕膜细胞、滋养层细胞、绒毛间质细胞和毛细血管内皮细胞均受到HBV感染，而该例引产胎儿的肝脏HBV DNA和HBsAg、HBxAg及HBcAg均呈阳性染色。从101例足月分娩胎盘HBV感染情况来看,19例胎盘绒毛毛细血管内皮细胞受到感染,其中6例新生儿(31.6%)发生了宫内传播。病例对照研究表明，绒毛毛细血管内皮细胞感染是HBV宫内感染的主要危险因素(OR=18.46, P<0.01)。而且HBV感染胎盘造成宫内感染的危险度，从胎盘屏障第一层绒毛滋养层细胞(OR=5.21)、绒毛间质细胞(OR=6.00)，至最后一道防线绒毛毛细血管内皮细胞(OR=18.46)逐渐增大,从而表明胎盘屏障,尤其是绒毛毛细管内皮细胞HBV感染与否是宫内感染发生的关键因素之一。但在不区分是那类细胞感染时,胎盘HBV感染并非与宫内传播的发生有必然联系。故本研究结果不支持胎盘感染必然造成宫内感染的假想[10]。
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另外,尚有2例未发现胎盘感染,但发生了宫内传播，其原因可能是:(1)检测方法尚不够灵敏，如果应用原位PCR，能进一步提高组织中病毒感染的检出率[11]；(2)系其他原因所致的宫内感染, Lin等[4]的研究表明,先兆流产和(或)先兆早产的胎盘渗漏可能会造成母血交流,从而导致宫内感染的发生。尽管有19例绒毛毛细血管内皮细胞受到感染,可并非每例新生儿发生宫内传播,主要原因可能是:(1) HBV尚未能进一步突破绒毛毛细血管内皮细胞而进入胎儿;(2)与胎盘本身具有防止病毒感染的某种屏障功能有关,如胎盘具有产生干扰素的能力；(3) 既使HBV进入胎儿后,一方面HBV DNA处于不表达状态,另一方面有可能隐匿于肝脏或肝外组织中,而外周血难以检测到。所以对这部分婴儿的长期随访十分重要,目前这项工作正在进行中。
三、HBV经胎盘感染胎儿的途径
本研究发现，从孕早期至足月分娩，胎盘HBV感染有逐渐增加的现象；另外HBV感染的45例足月分娩胎盘中,从胎盘的母面至胎儿面HBV感染率有逐渐下降趋势，但胎儿发生宫内感染的OR值却逐渐增大。提示HBV经胎盘感染胎儿可能是通过细胞与细胞间的传递方式实现的，即母血HBV 经蜕膜毛细血管内皮细胞和蜕膜细胞和(或)绒毛间隙直接感染绒毛滋养层细胞,然后进一步感染绒毛间质细胞,最终感染绒毛毛细血管内皮细胞而造成胎儿宫内感染发生。
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四、HBV经胎盘感染胎儿的可能时间
从既往HBsAg携带孕妇的引产胎儿研究中表明,胎肝中有HBV DNA存在的胎龄大多在28周以后。本研究在24例HBsAg阳性孕妇孕早期(孕40～90天)人工流产胎盘中仅发现有1例(孕50天)蜕膜细胞受染,从而表明孕早期HBV虽然可感染胎盘的蜕膜组织,但突破胎盘屏障感染胎儿的可能性有待进一步研究。6例孕中期引产的胎盘中，1例胎盘(孕周为19周) 蜕膜细胞、绒毛滋养层细胞和绒毛间质细胞受感染，并且突破了胎盘屏障的最后一道防线,即绒毛毛细血管内皮细胞,导致其胎儿发生宫内感染,从而证实HBV经胎盘感染胎儿的时间可发生在孕中期。而随着妊娠发展至孕晚期,由于滋养层逐渐变的很薄,并形成绒毛-血管膜, 有可能使HBV更易突破较薄的胎盘屏障。本研究发现19例(孕38～43周)足月分娩胎盘的绒毛毛细血管内皮细胞在足月分娩时已受染,其中6例新生儿发生了宫内感染,从而表明HBV经胎盘感染胎儿的时间主要发生于孕晚期。
本课题受国家自然科学基金资助(基金编号： 39370611)
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参考文献
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2 朱启榕, 段恕诚，徐华芳，等. 乙型肝炎病毒从母亲到婴儿的产前传播. 中华流行病学杂志, 1989, 7:159-161.
3 门可, 王福生，徐德忠，等. 乙肝病毒宫内感染及其相关因素的研究. 第四军医大学学报, 1996, 17:28-29.
4 Lin HH, Lee T, Chen D, et al. Transplacental leakege of HBsAg-positive maternal blood as the most likely route in causing intrauterine infection with hepatitis B virus. J Pediatr, 1987, 111:877-881.
, 百拇医药
5 唐时幸, 于光烈，程绍尧. 乙肝病毒宫内传播机制及影响因素的研究. 中华流行病学杂志, 1991, 12:325-327.
6 闫永平, 徐德忠，王文亮，等. 乙肝表面抗原阳性不同孕期胎盘乙肝病毒感染状态的研究. 中华医学杂志, 1998, 78:76-77.
7 YAN Yongping, XU Dezhong, WANG Wenliang, et al. Detection of HBV DNA in term placentas of HBsAg carrier mothers. 第四军医大学学报, 1998, 19:224-225.
8 Lucifora G, Martines F, Calabro S, et al. HBcAg identification in the placental cytotypes of symptom-free HBsAg-carrier mothers: a study with the immunoperoxidase method. Am J Obstet Gynecol, 1990, 163:235-239.
, 百拇医药
9 Lucifora G, Calabro S, Carroccio G, et al. Immunocytochemical HBsAg evidence in placentas of asymptomatic carrier mothers. Am J Obstet Gynecol, 1988, 159:839-842.
10 Lin HH. HBsAg in placentas. Am J Obstet Gynecol, 1990, 169: 1361.
11 Zaki SR. In-situ polymerase chain reaction amplification: applications and current limitations. AIDS, 1994, 8:1186-1188.
(收稿：1998-11-01 修回：1999-02-08), 百拇医药
单位：闫永平 徐德忠 刘志华 门可 张景霞 西安 第四军医大学流行病学教研室 710032；王文亮 刘斌 病理学教研室；徐剑秋 陕西省妇幼保健院
关键词：肝炎；乙型；疾病传播；垂直；胎盘
中华妇产科杂志990702 【摘要】 目的 探讨乙型肝炎病毒(HBV)宫内传播的危险因素, 并追踪HBV经胎盘传播的途径和胎儿宫内感染的时间。方法 共收集了乙型肝炎表面抗原(HBsAg)携带孕妇131例，其中孕早期人工流产胎盘24例、孕中期引产胎盘和胎儿各6例、足月分娩胎盘和新生儿各101例。孕妇和新生儿血清HBsAg 和HBV DNA检测分别采用酶联免疫吸附试验(ELISA)和聚合酶链反应(PCR)法。胎盘的HBsAg、HBxAg、HBcAg检测和HBV DNA检测分别采用ABC免疫组织化学染色法和原位杂交法。结果 孕早期、孕中期和足月分娩胎盘的HBV感染率分别为4.2% (1/24), 1/6, 和44.6% (45/101)。1例孕中期引产胎儿的肝脏中检测到HBV蛋白和DNA,其胎盘从母面到胎儿面各层细胞也均受染。101例新生儿中,8例(7.9%)发生了宫内感染。胎盘绒毛毛细血管内皮细胞的HBV感染发生宫内传播的相对危险度比值为18.46(95%可信限=2.83～152.78)。结论 胎盘绒毛毛细血管内皮细胞感染是宫内传播的主要危险因素。HBV经胎盘感染胎儿的途径可能是通过胎盘细胞至细胞的传递而实现的。宫内感染可发生在孕中期，但主要的发生时间是孕晚期。
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The Role of Placenta in Hepatitis B Virus Intrauterine Transmission
YAN Yongping, XU Dezhong, WANG Wenliang, et al.
Fourth Military Medical University, Xi’an 710032
【Abstract】 Objectives To determine the role of placenta in hepatitis B virus (HBV) intrauterine transmission, and to trace the route of transplacental transmission and the timing of HBV infection in uterus. Methods We collected 101 term placentas and newborn infants, 24 aborted first-trimester placentas, and 6 induced aborted fetuses and placentas from 131 HBsAg carrying pregnant women. Serologic HBV markers (HBsAg and HBV DNA) of pregnant women and newborns were detected by ELISA and PCR. The HBsAg, HBxAg, HBcAg and HBV DNA in placentas were determined by ABC immunohistochemical staining and in-situ hybridization. Results The HBV infection rates of placentas from first-trimester, second-trimester to term periods were 4.2%(1/24), 1/6, and 44.6%(45/101), respectively. In one induced aborted fetal liver tissue (19-week of pregnancy), the proteins and DNA of HBV were detected, and its placental villous capillary endothelial cells were also infected. The OR of HBV infection of villous capillary endothelial cells in intrauterine transmission was 18.46(95% CI=2.83～152.78). Conclusions HBV infection of placental capillary endothelial cell is a major risk factor of intrauterine transmission. HBV transplacental transmission route may be placental cell to cell transfer. The intrauterine infection may occur as early as on the 19th week of pregnancy, but the main timing is possibly in the third-trimester of pregnancy.
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【Key words】 Hepatitis B Disease transmission, vertical Placenta
乙型肝炎病毒(HBV)可经胎盘传播至胎儿,造成胎儿宫内感染。乙型肝炎表面抗原(HBsAg)携带孕妇的胎儿宫内感染率为5%～15%[1-4]。目前,有关胎盘在HBV宫内传播中的作用报道不多,而且结论不一。本研究试图对HBV宫内传播的危险因素、途径和感染时间等问题作一探讨。报道如下。
材料和方法
一、研究对象
1.孕早期妇女:选择1995年10月至12月,在陕西省妇幼保健院门诊手术室行人工流产术的孕妇，共计287例(孕40～90天),其中24例为HBsAg阳性。
2.孕中期妇女及其胎儿:选择1995年9月至1996年12月,在陕西省妇幼保健院因各种指征行水囊引产术的HBsAg阳性孕妇及其胎儿，各6例(孕19～24周)。
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3.足月分娩妇女及其新生儿:选择1995年9月至1997年2月,陕西省妇幼保健院HBsAg阳性的足月分娩孕妇及其新生儿，各101例(孕37～43周)。
二、标本收集及处理
1.外周血血清：不同孕期孕妇于术前或分娩前、后采肘静脉血3～5ml；新生儿于出生后24小时内,于注射乙肝高效价免疫球蛋白和乙肝疫苗前,采股静脉血1ml,分离血清，-20℃保存待检。
2.胎盘和引产胎儿不同器官的处理：(1)孕早期胎盘:负压吸宫人工流产术后,立即挑选较完整的绒毛样胎盘组织,浸入约10倍体积的4%多聚甲醛液中固定；(2)孕中期和足月分娩胎盘:于胎盘娩出后30分钟内，切取大小约1cm×1cm×2cm的胎盘组织,浸入上述固定液中；(3)孕中期引产胎儿不同器官:主要包括肝、肾、脾、卵巢或睾丸，上述组织于胎儿娩出后1小时内，行尸体解剖取出各脏器,然后切取大小约0.5cm×0.3cm×0.3cm的组织块,按上述胎盘处理方法进行固定。
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上述组织标本固定1～2周后,取材、包埋、石蜡固定、连续5 μm切片,待检。
三、实验室检测
1.外周血HBV检测: HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe和抗-HBc检测，采用酶联免疫吸附试验(ELISA)。HBV DNA检测采用聚合酶链反应(PCR)法[5]。
2.胎盘和引产胎儿不同组织 HBsAg、HBcAg和HBxAg检测：采用ABC免疫组化染色法,试剂盒购自美国Vecta公司。HBV DNA检测采用原位杂交法,地高辛标记和检测试剂盒购自德国Boehringer Mannheim公司。检测方法见文献[6,7]。
四、HBV宫内感染的结果判定
1.胎盘HBV感染的诊断方法: 胎盘不同类型细胞中HBsAg、HBcAg、HBxAg和HBV DNA任一项指标阳性。
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2.新生儿外周血的检测：新生儿在出生后24小时内,注射乙肝高效价免疫球蛋白和乙肝疫苗前,检测其外周血HBsAg和(或)HBV DNA呈阳性者。
3.胎儿组织的检测：引产胎儿肝脏中检出HBV DNA和HBsAg、HBxAg及HBcAg阳性者。
五、统计学方法
相对危险度的比值比(OR)和趋势χ2检验等计算，均在EPI (5.0版)软件上进行。
结果
一、孕早期妇女及其胎盘HBV感染状况
24例HBsAg阳性孕妇孕早期人工流产的绒毛状组织，经免疫组织化学染色和原位杂交检测，发现有1例蜕膜细胞HBsAg、HBxAg和HBcAg呈棕色阳性着染, HBV DNA呈蓝色颗粒状阳性染色。HBsAg和HBxAg主要位于受感染细胞的胞浆中,呈散在分布。HBcAg和HBV DNA位于受感染细胞的胞核中，呈散在分布。其滋养层细胞和绒毛间质细胞均未见阳性染色。而其他23例胎盘的各类组织细胞均呈阴性染色。孕早期胎盘的HBV感染率为4.2%(1/24)。
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二、孕中期引产胎盘和胎儿HBV感染状况
1.胎盘HBV感染情况：6例HBsAg阳性孕妇胎盘中,1例(病例序号I002)蜕膜细胞、合体滋养细胞和细胞滋养层细胞、绒毛间质细胞及绒毛毛细血管内皮细胞HBsAg、HBxAg、HBcAg和HBV DNA均呈阳性染色。有阳性染色在细胞中的部位分布同孕早期。其余9例胎盘各类细胞均呈阴性染色(表1)。
表1 6例HBsAg阳性孕妇引产胎盘免疫组化和原位杂交染色结果 病例
序号
蜕膜细胞
滋养层细胞
绒毛间质细胞
绒毛毛细血管内皮细胞
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注：IHC：免疫组织化学染色； ISH：原位杂交
2. 引产胎儿肝、脾、肾和睾丸或卵巢HBV感染情况：在6例胎儿的肝、脾、肾和2例睾丸、4例卵巢中,有1例(病例序号I002)胎儿肝细胞HBsAg和HBcAg免疫组织化学均呈阳性染色，HBsAg弥漫分布于肝细胞的胞浆中,HBcAg散在分布于肝细胞的胞核中。该例胎儿的肝细胞HBV DNA也呈阳性染色，散在分布,主要见于受感染细胞的胞核中。而在该例胎儿的脾、肾和卵巢组织中未见HBV DNA阳性染色。其余5例肝、脾、肾和2例睾丸、3例卵巢HBV DNA原位杂交均呈阴性。孕中期引产胎儿的HBV感染率为(1/6)。
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三、足月分娩胎盘和新生儿HBV感染状况
101例足月分娩胎盘中,HBsAg、HBxAg和HB- cAg阳性率分别为33.7% (34/101)、37.6%(38/101)和20.8%(21/101)，感染的细胞多呈局灶性分布,少数可见弥漫性分布。45例(44.6%)呈HBV DNA阳性染色，感染的细胞多呈局灶性分布,少数呈弥漫性分布。胎盘HBV总的感染率为44.6%(45/101)。胎盘蜕膜HBV感染率为43.6% (44/101)。胎盘屏障中细胞感染率为40.6%(41/101),其中滋养层细胞为40.6%(41/101),绒毛间质细胞为36.6% (37/101),绒毛毛细血管内皮细胞为18.8% (19/101)。45例受感染的胎盘中，6例新生儿发生宫内HBV感染，而56例未感染的胎盘中，仅2例发生HBV宫内感染，OR值为4.15， 95%可信限(95%CI)为0.69-32.06(χ2=2.06, P=0.15)。
在胎盘不同类型细胞HBV感染中，蜕膜细胞、滋养层细胞、绒毛间质细胞和绒毛毛细血管内皮细胞的HBV感染发生宫内传播的OR值分别为4.34、5.21、6.00和18.46(表2)。表2 胎盘不同类型细胞HBV感染与宫内感染的关系 细胞类型
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发生宫
内感染
例数
未发生宫
内感染
例数
OR值
95%CI
P值
+
-
+
-
蜕膜细胞
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6
2
38
55
4.34
0.72～ 33.53
0.134 3
滋养层细胞
6
2
34
59
5.21
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0.86～ 40.32
0.079 0
绒毛间质
6
2
31
62
6.00
0.99～ 46.61
0.049 4
细胞
绒毛毛细血管
6
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2
13
80
18.46
2.83～152.78
0.000 2
内皮细胞
讨论
一、胎盘的HBV感染
Lucifora等[8,9]分别在3例和9例HBsAg携带孕妇的足月分娩胎盘中，发现有HBsAg和HBcAg的存在。本研究结果表明，在不同孕期的胎盘组织细胞中不但有HBV蛋白的存在,而且还有HBV DNA存在。HBsAg和HBxAg主要位于受感染细胞的胞浆内,而HBcAg和HBV DNA主要位于胞核内。从而提示，HBV可进入不同孕期胎盘的细胞内,并且很可能在其中复制和表达。
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二、宫内感染HBV的危险因素
在101新生儿中,8例出生时检测出HBsAg和(或)HBV DNA,宫内感染率为7.92%。与既往报道的宫内感染率5%～15%一致。
唐时幸等[5]应用斑点杂交,在2例引产的胎盘中检测到HBV DNA，并认为HBV可通过胎盘屏障,或先感染胎盘并在其中复制再感染胎儿。但究竟是胎盘的哪些细胞受到感染尚不清楚。本研究发现，在6例孕中期引产的胎盘中有1例蜕膜细胞、滋养层细胞、绒毛间质细胞和毛细血管内皮细胞均受到HBV感染，而该例引产胎儿的肝脏HBV DNA和HBsAg、HBxAg及HBcAg均呈阳性染色。从101例足月分娩胎盘HBV感染情况来看,19例胎盘绒毛毛细血管内皮细胞受到感染,其中6例新生儿(31.6%)发生了宫内传播。病例对照研究表明，绒毛毛细血管内皮细胞感染是HBV宫内感染的主要危险因素(OR=18.46, P<0.01)。而且HBV感染胎盘造成宫内感染的危险度，从胎盘屏障第一层绒毛滋养层细胞(OR=5.21)、绒毛间质细胞(OR=6.00)，至最后一道防线绒毛毛细血管内皮细胞(OR=18.46)逐渐增大,从而表明胎盘屏障,尤其是绒毛毛细管内皮细胞HBV感染与否是宫内感染发生的关键因素之一。但在不区分是那类细胞感染时,胎盘HBV感染并非与宫内传播的发生有必然联系。故本研究结果不支持胎盘感染必然造成宫内感染的假想[10]。
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另外,尚有2例未发现胎盘感染,但发生了宫内传播，其原因可能是:(1)检测方法尚不够灵敏，如果应用原位PCR，能进一步提高组织中病毒感染的检出率[11]；(2)系其他原因所致的宫内感染, Lin等[4]的研究表明,先兆流产和(或)先兆早产的胎盘渗漏可能会造成母血交流,从而导致宫内感染的发生。尽管有19例绒毛毛细血管内皮细胞受到感染,可并非每例新生儿发生宫内传播,主要原因可能是:(1) HBV尚未能进一步突破绒毛毛细血管内皮细胞而进入胎儿;(2)与胎盘本身具有防止病毒感染的某种屏障功能有关,如胎盘具有产生干扰素的能力；(3) 既使HBV进入胎儿后,一方面HBV DNA处于不表达状态,另一方面有可能隐匿于肝脏或肝外组织中,而外周血难以检测到。所以对这部分婴儿的长期随访十分重要,目前这项工作正在进行中。
三、HBV经胎盘感染胎儿的途径
本研究发现，从孕早期至足月分娩，胎盘HBV感染有逐渐增加的现象；另外HBV感染的45例足月分娩胎盘中,从胎盘的母面至胎儿面HBV感染率有逐渐下降趋势，但胎儿发生宫内感染的OR值却逐渐增大。提示HBV经胎盘感染胎儿可能是通过细胞与细胞间的传递方式实现的，即母血HBV 经蜕膜毛细血管内皮细胞和蜕膜细胞和(或)绒毛间隙直接感染绒毛滋养层细胞,然后进一步感染绒毛间质细胞,最终感染绒毛毛细血管内皮细胞而造成胎儿宫内感染发生。
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四、HBV经胎盘感染胎儿的可能时间
从既往HBsAg携带孕妇的引产胎儿研究中表明,胎肝中有HBV DNA存在的胎龄大多在28周以后。本研究在24例HBsAg阳性孕妇孕早期(孕40～90天)人工流产胎盘中仅发现有1例(孕50天)蜕膜细胞受染,从而表明孕早期HBV虽然可感染胎盘的蜕膜组织,但突破胎盘屏障感染胎儿的可能性有待进一步研究。6例孕中期引产的胎盘中，1例胎盘(孕周为19周) 蜕膜细胞、绒毛滋养层细胞和绒毛间质细胞受感染，并且突破了胎盘屏障的最后一道防线,即绒毛毛细血管内皮细胞,导致其胎儿发生宫内感染,从而证实HBV经胎盘感染胎儿的时间可发生在孕中期。而随着妊娠发展至孕晚期,由于滋养层逐渐变的很薄,并形成绒毛-血管膜, 有可能使HBV更易突破较薄的胎盘屏障。本研究发现19例(孕38～43周)足月分娩胎盘的绒毛毛细血管内皮细胞在足月分娩时已受染,其中6例新生儿发生了宫内感染,从而表明HBV经胎盘感染胎儿的时间主要发生于孕晚期。
本课题受国家自然科学基金资助(基金编号： 39370611)
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参考文献
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4 Lin HH, Lee T, Chen D, et al. Transplacental leakege of HBsAg-positive maternal blood as the most likely route in causing intrauterine infection with hepatitis B virus. J Pediatr, 1987, 111:877-881.
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9 Lucifora G, Calabro S, Carroccio G, et al. Immunocytochemical HBsAg evidence in placentas of asymptomatic carrier mothers. Am J Obstet Gynecol, 1988, 159:839-842.
10 Lin HH. HBsAg in placentas. Am J Obstet Gynecol, 1990, 169: 1361.
11 Zaki SR. In-situ polymerase chain reaction amplification: applications and current limitations. AIDS, 1994, 8:1186-1188.
(收稿：1998-11-01 修回：1999-02-08), 百拇医药