子宫内膜异位症患者腹腔液对正常自然杀伤细胞活性的影响
作者：李文 杨帆 金志军 杨云纺
单位：第二军医大学附属长征医院妇产科 200003 上海
关键词：
中华妇产科杂志990820 子宫内膜异位症(EM)患者外周血及腹腔液自然杀伤(NK)细胞活性明显降低，特别以腹腔液NK细胞活性下降显著，推测可能是促使子宫内膜细胞在盆腔内种植的原因之一。本研究通过将EM患者的腹腔液在体外与正常人的外周血淋巴细胞共同孵育后，观察其中NK细胞活性变化，以探讨EM患者的腹腔液对NK细胞活性的影响。
一、资料与方法
1. 研究对象：1995年10月～1996年10月，51例患者因不孕、腹痛或要求输卵管绝育在我院行腹腔镜检查，年龄为26～38岁，平均(28.3±4.5)岁。40例诊断为EM(患者组)。根据1985美国生育协会的诊断标准[1]：Ⅰ期12例，Ⅱ期13例，Ⅲ期9例，Ⅳ期6例。另11例作为对照组。腹腔镜检查时，抽取子宫直肠窝的全部腹腔液，收集在无菌肝素试管中，3000 r/min，离心8分钟，上清液置-20℃保存。
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2.方法：效应细胞的制备：抽取5例正常女性的外周血，肝素化后用淋巴细胞分离液常规分离，Hank′s液洗涤两次后用培养液(含10%小牛血清的RPMI 1640)调节细胞浓度至2×106细胞/ml。效应细胞的处理：取1 ml效应细胞加1 ml腹腔液(空白对照用培养液)，置5%CO2培养箱中37℃培养2、12、24小时，3000 r/min离心5分钟，去上清。Hank′s液2 ml洗涤，重复4次；用含10%的小牛血清的RPMI 1640制成2×106细胞/ml的细胞悬液。靶细胞的制备：培养24～48小时对数生长期的Hela细胞，Hank′s液洗涤2次，用培养液调节细胞浓度至1×105细胞/ml；在40孔板中，每孔加靶细胞100 μl，效应细胞100 μl，每个标本需复孔3只，37℃，5% CO2培养箱中培养4小时后1 500 r/min离心5分钟；各孔取上清液100 μl，置于另一40孔板的对应孔，37℃保温5分钟，加底物液100 μl/孔，室温下10分钟后加0.1 mol柠檬酸30 μl/孔，终止酶促反应。用570 nm波长测定各孔吸光度(A)值，NK细胞活性的抑制率(%)=(对照孔释放平均A值-样本孔释放平均A值/对照孔释放平均A值)×100%。
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3.统计处理：数据均以
±s表示，两样本间行t检验、等级相关分析。
二、结果
在作用2小时时，对照组和患者组腹腔液对正常人外周血NK细胞活性的抑制率分别为(37.1±18.9)%和(65.2±21.8)%，差异有非常显著性(P<0.01)。如果延长腹腔液与淋巴细胞的作用时间，则腹腔液对NK细胞活性的抑制率也随之升高。在作用时间为12和24小时时，患者组腹腔液对NK细胞活性的抑制率分别为(73.0±29.7)%和(78.3±36.2)%，均明显高于作用2小时时的抑制率(P<0.05)。对照组的抑制作用也有升高，但不显著。
随着临床分期的加重，患者组腹腔液对NK细胞活性的抑制率也增高，等级相关分析显示，二者呈正相关(r=0.602 3，P<0.05)。
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三、讨论
众所周知，行经妇女子宫内膜细胞随经血返流的发生率很高[2]，但并非所有这些妇女都患有EM。这提示EM患者在发病以前腹腔内微环境可能已发生了某些病理改变，而这些改变使得返流的子宫内膜细胞易于在腹腔内种植。
子宫内膜异位症，特别是Ⅰ～Ⅱ期EM合并不孕症的患者腹腔液的微环境有明显的改变。这种改变可能会影响到NK细胞的活性。有研究显示，EM患者外周血及腹腔液中NK细胞活性下降，而且以腹腔液中的NK细胞活性下降为明显[3-5]。推测由于NK细胞活性的下降，导致随经血返流的子宫内膜细胞不能被NK细胞完全清除，而在腹腔内种植。这可能是EM的发病机理之一。
本研究观察到，对照组和患者组腹腔液均可使正常人外周血NK细胞活性明显下降，这种抑制作用随着EM的严重程度而加重。说明正常人群和EM患者的腹腔液中，均可能存在着影响NK细胞活性的成分。在生理情况下，这些成分对NK细胞活性的抑制，尚不能影响NK细胞清除返流的子宫内膜细胞；而当这些成分的质或量发生改变时，NK细胞的活性受到明显的抑制，而发生EM。本研究还观察到，随着孵育时间延长，NK细胞活性受抑制的程度加深。Somigliana等[6]发现，子宫内膜细胞培养基的上清液对NK细胞介导的细胞毒性具有明显的抑制作用。而且，培养EM患者子宫内膜细胞的培养基对NK细胞的细胞毒性的抑制程度明显高于非EM患者子宫内膜细胞的培养基。提示人子宫内膜细胞能释放可溶性非特异成分，干扰NK细胞的活性。这可以解释Oosterlynck等[7]观察到的腹腔液NK细胞活性与EM分期呈负相关。推测由于腹腔液微环境的改变，使NK细胞活性受到抑制，返流的子宫内膜细胞易于种植形成EM。
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参考文献
1 Revised A. American fertility society classi- fication of endometriosis: 1985. Fertil Steril. 1985, 43: 351-352.
2 Kruitwagen RF, Poels LG, Willemsen WN, et al. Retrograde seeding of endometrial epithelial cells by uterine-tubal flushing. Fertil Steril, 1991, 56: 414-420.
3 Oosterlynck DJ, Meuleman C, Waer M, et al. The natural killer activity of peritoneal fluid lymphocytes is decreased in women with endometriosis. Fertil Steril, 1992, 58: 290-295.
, http://www.100md.com
4 Wilson TJ, Munnery L, Hertzog PJ, et al. Decreased natural killer cell activity in endometriosis patients: relationship to diseased pathogenesis. Fertil Steril, 1994, 62: 1086-1088.
5 Garzetti GG, Ciavattini A, Proviniciali M, et al. Natural killer cell activity in endome- triosis: correlation between estradiol levels and cytotoxity. Obstet Gynecol, 1993, 81: 665-668.
6 Somigliana E, Vigano P, Gaffuri B, et al. Modulation of NK cell lytic function by endometrial secretory factors: potential role in endometriosis. Am J Reprod Immunol, 1996, 36: 295-300.
7 Oosterlynck DJ, Cornillie FJ, Waer I, et al. Women with endometriosis show a defect in natural killer activity resulting in a decreased cytotoxicity to autologous endometrium. Fertil Steril, 1991, 56: 45-51.
(收稿：1998-06-01 修回：1999-04-30), 百拇医药
单位：第二军医大学附属长征医院妇产科 200003 上海
关键词：
中华妇产科杂志990820 子宫内膜异位症(EM)患者外周血及腹腔液自然杀伤(NK)细胞活性明显降低，特别以腹腔液NK细胞活性下降显著，推测可能是促使子宫内膜细胞在盆腔内种植的原因之一。本研究通过将EM患者的腹腔液在体外与正常人的外周血淋巴细胞共同孵育后，观察其中NK细胞活性变化，以探讨EM患者的腹腔液对NK细胞活性的影响。
一、资料与方法
1. 研究对象：1995年10月～1996年10月，51例患者因不孕、腹痛或要求输卵管绝育在我院行腹腔镜检查，年龄为26～38岁，平均(28.3±4.5)岁。40例诊断为EM(患者组)。根据1985美国生育协会的诊断标准[1]：Ⅰ期12例，Ⅱ期13例，Ⅲ期9例，Ⅳ期6例。另11例作为对照组。腹腔镜检查时，抽取子宫直肠窝的全部腹腔液，收集在无菌肝素试管中，3000 r/min，离心8分钟，上清液置-20℃保存。
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2.方法：效应细胞的制备：抽取5例正常女性的外周血，肝素化后用淋巴细胞分离液常规分离，Hank′s液洗涤两次后用培养液(含10%小牛血清的RPMI 1640)调节细胞浓度至2×106细胞/ml。效应细胞的处理：取1 ml效应细胞加1 ml腹腔液(空白对照用培养液)，置5%CO2培养箱中37℃培养2、12、24小时，3000 r/min离心5分钟，去上清。Hank′s液2 ml洗涤，重复4次；用含10%的小牛血清的RPMI 1640制成2×106细胞/ml的细胞悬液。靶细胞的制备：培养24～48小时对数生长期的Hela细胞，Hank′s液洗涤2次，用培养液调节细胞浓度至1×105细胞/ml；在40孔板中，每孔加靶细胞100 μl，效应细胞100 μl，每个标本需复孔3只，37℃，5% CO2培养箱中培养4小时后1 500 r/min离心5分钟；各孔取上清液100 μl，置于另一40孔板的对应孔，37℃保温5分钟，加底物液100 μl/孔，室温下10分钟后加0.1 mol柠檬酸30 μl/孔，终止酶促反应。用570 nm波长测定各孔吸光度(A)值，NK细胞活性的抑制率(%)=(对照孔释放平均A值-样本孔释放平均A值/对照孔释放平均A值)×100%。
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3.统计处理：数据均以
±s表示，两样本间行t检验、等级相关分析。二、结果
在作用2小时时，对照组和患者组腹腔液对正常人外周血NK细胞活性的抑制率分别为(37.1±18.9)%和(65.2±21.8)%，差异有非常显著性(P<0.01)。如果延长腹腔液与淋巴细胞的作用时间，则腹腔液对NK细胞活性的抑制率也随之升高。在作用时间为12和24小时时，患者组腹腔液对NK细胞活性的抑制率分别为(73.0±29.7)%和(78.3±36.2)%，均明显高于作用2小时时的抑制率(P<0.05)。对照组的抑制作用也有升高，但不显著。
随着临床分期的加重，患者组腹腔液对NK细胞活性的抑制率也增高，等级相关分析显示，二者呈正相关(r=0.602 3，P<0.05)。
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三、讨论
众所周知，行经妇女子宫内膜细胞随经血返流的发生率很高[2]，但并非所有这些妇女都患有EM。这提示EM患者在发病以前腹腔内微环境可能已发生了某些病理改变，而这些改变使得返流的子宫内膜细胞易于在腹腔内种植。
子宫内膜异位症，特别是Ⅰ～Ⅱ期EM合并不孕症的患者腹腔液的微环境有明显的改变。这种改变可能会影响到NK细胞的活性。有研究显示，EM患者外周血及腹腔液中NK细胞活性下降，而且以腹腔液中的NK细胞活性下降为明显[3-5]。推测由于NK细胞活性的下降，导致随经血返流的子宫内膜细胞不能被NK细胞完全清除，而在腹腔内种植。这可能是EM的发病机理之一。
本研究观察到，对照组和患者组腹腔液均可使正常人外周血NK细胞活性明显下降，这种抑制作用随着EM的严重程度而加重。说明正常人群和EM患者的腹腔液中，均可能存在着影响NK细胞活性的成分。在生理情况下，这些成分对NK细胞活性的抑制，尚不能影响NK细胞清除返流的子宫内膜细胞；而当这些成分的质或量发生改变时，NK细胞的活性受到明显的抑制，而发生EM。本研究还观察到，随着孵育时间延长，NK细胞活性受抑制的程度加深。Somigliana等[6]发现，子宫内膜细胞培养基的上清液对NK细胞介导的细胞毒性具有明显的抑制作用。而且，培养EM患者子宫内膜细胞的培养基对NK细胞的细胞毒性的抑制程度明显高于非EM患者子宫内膜细胞的培养基。提示人子宫内膜细胞能释放可溶性非特异成分，干扰NK细胞的活性。这可以解释Oosterlynck等[7]观察到的腹腔液NK细胞活性与EM分期呈负相关。推测由于腹腔液微环境的改变，使NK细胞活性受到抑制，返流的子宫内膜细胞易于种植形成EM。
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参考文献
1 Revised A. American fertility society classi- fication of endometriosis: 1985. Fertil Steril. 1985, 43: 351-352.
2 Kruitwagen RF, Poels LG, Willemsen WN, et al. Retrograde seeding of endometrial epithelial cells by uterine-tubal flushing. Fertil Steril, 1991, 56: 414-420.
3 Oosterlynck DJ, Meuleman C, Waer M, et al. The natural killer activity of peritoneal fluid lymphocytes is decreased in women with endometriosis. Fertil Steril, 1992, 58: 290-295.
, http://www.100md.com
4 Wilson TJ, Munnery L, Hertzog PJ, et al. Decreased natural killer cell activity in endometriosis patients: relationship to diseased pathogenesis. Fertil Steril, 1994, 62: 1086-1088.
5 Garzetti GG, Ciavattini A, Proviniciali M, et al. Natural killer cell activity in endome- triosis: correlation between estradiol levels and cytotoxity. Obstet Gynecol, 1993, 81: 665-668.
6 Somigliana E, Vigano P, Gaffuri B, et al. Modulation of NK cell lytic function by endometrial secretory factors: potential role in endometriosis. Am J Reprod Immunol, 1996, 36: 295-300.
7 Oosterlynck DJ, Cornillie FJ, Waer I, et al. Women with endometriosis show a defect in natural killer activity resulting in a decreased cytotoxicity to autologous endometrium. Fertil Steril, 1991, 56: 45-51.
(收稿：1998-06-01 修回：1999-04-30), 百拇医药