宫内窘迫胎鼠脑及肝组织自由基损伤的研究
作者：宋薇薇 韩玉昆 尚涛
单位：中国医科大学第二临床学院妇产科 110003 沈阳
关键词：胎儿窘迫；脑缺血；脑缺氧；超氧化物歧化酶；丙二醛
中华妇产科杂志990808 【摘要】 目的 探讨宫内窘迫胎鼠自由基损伤情况及对不同脏器的影响。方法 通过钳夹双侧子宫动、静脉造成宫内胎鼠完全缺血缺氧，其中A组钳夹5分钟(胎鼠13只)；B组钳夹10分钟(胎鼠10只)；C组钳夹20分钟(胎鼠11只)；对照组为假手术组(胎鼠13只)。另一部分钳夹后再灌注，其中D组钳夹10分钟后再灌注5分钟(胎鼠11只)，E组钳夹10分钟后再灌注20分钟(胎鼠8只)；以B组为对照。以比色法测定脑、肝组织匀浆后的超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量。结果 与对照组比较，B组、C组脑组织SOD含量降低(P<0.05，<0.01)，C组MDA含量升高(P<0.05)。而肝脏仅C组SOD含量降低(P<0.05)。与B组比较，D组脑组织SOD、MDA含量均未发生显著变化；肝组织仅SOD发生显著变化(P<0.05)；E组脑组织SOD及MDA含量变化显著(P分别<0.01，<0.05)；肝组织均未发生显著变化。结论 宫内窘迫时，脑组织首先出现自由基变化，为新生儿缺血缺氧性脑损伤的早期防治提供了理论依据。
, http://www.100md.com
Changes of Free Radicals in Fetal Rats Brain and Liver Following Intrauterine Fetal Distress
SONG Weiwei, HAN Yukun, SHANG Tao.
Second Hospital, China Medical University, Shenyang 110003
【Abstract】 Objective To analysis the effect of superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) on different organs in intrauterine fetal distress. Methods The times of clamping uterine artery in A, B, C groups were 5, 10, 20 minites respectively. By clamping the matenal uterine vessels, we made the model of fetal rat distress. Slam group (13 pups) was used as control. After clamping 10 minutes, Group D (11 pups) was reperfused 5 minutes, and E (8 pups) 20 minutes. We measured the level of SOD and MDA in fetal brains and livers. Results The activity of cerebral SOD in group B and C decreased significantly than that of control (P<0.05, P<0.01). MDA in group C increased significantly than that of control (P<0.05). As for liver, only SOD in group C decreased significanlty (P<0.05). In that of reperfusion group, only in group E, cerebral SOD and MDA changed significantly (P<0.01, <0.05), livers SOD decreased significanlty (P<0.05).ConclusionAfter severe intrauterine fetal distress, changes of free radicals occurred in brains firstly, which provides the proof of early treatment for neonatal hypoxia ischemia brain damage.
, 百拇医药
【Key words】 Fetal distress Cerebral ischemia Cerebral anoxia Superoxides Malondialdehyde
新生儿缺血缺氧性脑病患者93.5%有直接或间接的窒息史[1]。窒息大多源于宫内窘迫，本研究以胎鼠为模型，对宫内窘迫后的重要脏器——脑、肝组织的自由基损伤情况进行研究，现将研究结果报告如下。
材料与方法
一、材料
1.动物模型的建立与分组：Wistar雌性大白鼠，平均体重260 g，以阴道涂片发现精子满视野为妊娠第1日，于妊娠第21日以5%戊巴比妥钠(0.1 ml/100 g)腹腔麻醉后，下腹正中切开腹部，暴露并分离双侧供应子宫的动、静脉血管。A组(胎鼠13只)钳夹子宫动、静脉造成完全缺血5分钟；B组(胎鼠10只)钳夹10分钟；C组(胎鼠11只)钳夹20分钟；对照组为假手术组(胎鼠13只)，方法同上，暴露分离血管后不钳夹；D组(胎鼠11只)钳夹10分钟后再灌注5分钟；E组(8只)钳夹10分钟后再灌注20分钟。并以B组为对照。
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2.试剂：测定超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)的药盒均购自南京建成生物制品研究所。
二、方法
各组模型均于上述操作完成后立即剖宫取出胎鼠，断头处死，取脑、肝组织称重后，-80℃冷冻保存。测定时将脑、肝组织于冰盒内超声粉碎匀浆，4℃低温离心制成10%、1%匀浆液，分别按照SOD及MDA测定试剂盒要求依次加入各种试剂至反应完成后，用721分光光度计比色，依据公式计算得出SOD、MDA含量。
三、统计分析
所有数值均用SAS统计软件分析，行t检验。
结果
一、不同缺血时间脑、肝组织SOD及MDA含量变化
, 百拇医药 随着缺血时间的延长，脑组织SOD含量逐渐下降，其中B、C两组脑组织SOD含量与对照组比较，差异均有显著性(P<0.05，P<0.01)；MDA含量逐渐升高，仅C组与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。而肝组织虽然表现出与脑组织同样的趋势，但仅C组的SOD含量与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。见表1。
表1 不同缺血时间胎鼠脑、肝组织SOD、MDA含量变化(
±s) 组别
例数
脑
肝
SOD(NU/ml)
MAD(nmol/ml)
, 百拇医药
SOD(NU/ml)
MDA(nmol/ml)
A组
13
50.687±3.693
1.048±0.432
73.568±3.918
4.153±1.201
B组
10
49.358±3.906
1.398±0.492
, http://www.100md.com
75.926±3.612
4.238±1.196
C组
11
37.415±3.967
1.517±0.476
76.297±3.986
4.397±1.203
对照组
13
52.396±3.531
1.031±0.398
, 百拇医药
72.966±3.986
3.983±1.187
二、再灌注不同时间后脑、肝脏组织SOD及MDA含量变化
与B组比较，D组、E组脑组织SOD含量均降低，MDA含量均增加，但仅E组的变化有显著性(P分别<0.01，<0.05)。与B组比较，E组肝脏SOD含量降低有显著性(P<0.05)，MDA虽然增加，但差异无显著性(P>0.05)。见表2。
表2 再灌注不同时间胎鼠脑、肝组织SOD、MDA含量变化(±s) 组别
例数
脑
, 百拇医药
肝
SOD(NU/ml)
MAD(nmol/ml)
SOD(NU/ml)
MDA(nmol/ml)
D组
11
48.698±3.912
1.478±0.497
77.460±3.962
4.938±1.212
E组
, 百拇医药
8
34.453±3.009
1.892±0.408
79.986±3.988
5.274±1.178
B组
10
49.358±3.906
1.398±0.492
75.926±3.612
4.238±1.196
讨论
, 百拇医药
一、SOD、MDA与组织缺血再灌注损伤
近年来，氧自由基及其介导的脂质过氧化反应在组织缺血再灌注损伤的发生、发展中的作用始终受到关注[2]。氧自由基的生成使SOD活性下降，导致膜脂质发生过氧化损伤，生成大量MDA，使细胞进一步遭到损害。因此，组织SOD活性下降和MDA含量增高可作为评定氧自由基生成及对膜脂质双层结构破坏的指标。尤其是MDA，其含量变化可反映氧自由基造成组织损伤的严重程度[3]。
二、宫内窘迫后脑、肝组织的自由基变化
本研究以大白鼠为动物模型，模拟宫内窘迫后发现，轻度缺血(5分钟)未出现脑、肝组织的自由基变化；脑组织在缺血10分钟后虽然有SOD活性的改变，但并没有MDA含量的显著变化；而缺血20分钟后，出现SOD活性明显降低，MDA含量显著升高，说明随着缺血时间的延长，氧自由基造成组织损伤逐渐明显，一定程度的单纯缺血也可以引起脑细胞的严重损伤；而肝脏的变化则相对滞后，仅缺血20分钟才出现SOD活性的改变，但因为MDA含量没有发生显著变化，所以无肝细胞严重损伤的证据；对各种组织的缺血再灌注研究已经证实：再灌注过程中SOD、MDA的变化往往是缺血过程中损伤的延续或加重[4]。本研究发现，缺血10分钟后再灌注5分钟与单纯缺血相比，脑、肝组织均未发生显著变化，而随着再灌注时间延长至20分钟，脑组织SOD活性及MDA含量均发生显著变化，说明此时脑细胞已发生了严重的损伤；以MDA含量变化为组织损伤严重程度的标志，可以看到：肝脏在缺血10分钟后即使再灌注20分钟，仍然无明显的细胞损伤。
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从上述结果可以看出，在宫内窘迫后，脑组织是最先受损的部位之一，即使在一定程度的缺血缺氧并未引起其他脏器损害的时候，脑组织已首先发生了变化，而自由基所介导的一系列反应在新生儿缺血缺氧性脑损伤中起一定的作用。新近的研究表明，Bcl-2基因家族对神经细胞凋亡的作用也与自由基相关[5]。SOD与MDA在宫内窘迫后的变化使我们认识到：源于宫内窘迫后的新生儿缺氧缺血性脑损伤是否在宫内已经开始发生?有待通过形态学等研究进一步证实。这些研究提示我们，对发生过严重宫内窘迫的新生儿，要在生后立即进行防治，甚至在宫内就应该行脑保护性治疗，这对降低新生儿缺血缺氧性脑病的发生，改善预后都具有重大意义。
参考文献
1 张莉莉，林久治，蔡玲玲.围产儿缺血缺氧性脑病124例的临床及病理学研究.中华妇产科杂志，1996，31：100-102.
2 Delivoria PM, Mishra OP. Mechainsms of cerebral injury in perinatal asphyxia and strategies for prevention. J Pediatr, 1998,132：30-34.
, http://www.100md.com
3 王万铁，徐正介，李东，等.心肌缺血再灌注损伤时MAP与MDA的相关分析.温州医学院学报，1997，27：76-78.
4 Liu PK, Hsu CY, Dizdaroglu M, et al. Damage repair and mutagenesis in nuclear genes after mouse forebrain ischemin reperfusion, J Neruosci, 1996,16：6795-6806.
5 Urabe T, Hattori N, Yoshikawa M, et al. Colocalization of Bcl-2 and 4-hydroxynonenal modified proteins in microglial cells and neurons of rat brain following transient focal ischemia. Neurosci Lett, 1998,247：159-162.
(收稿：1999-03-03 修回：1999-05-27), 百拇医药
单位：中国医科大学第二临床学院妇产科 110003 沈阳
关键词：胎儿窘迫；脑缺血；脑缺氧；超氧化物歧化酶；丙二醛
中华妇产科杂志990808 【摘要】 目的 探讨宫内窘迫胎鼠自由基损伤情况及对不同脏器的影响。方法 通过钳夹双侧子宫动、静脉造成宫内胎鼠完全缺血缺氧，其中A组钳夹5分钟(胎鼠13只)；B组钳夹10分钟(胎鼠10只)；C组钳夹20分钟(胎鼠11只)；对照组为假手术组(胎鼠13只)。另一部分钳夹后再灌注，其中D组钳夹10分钟后再灌注5分钟(胎鼠11只)，E组钳夹10分钟后再灌注20分钟(胎鼠8只)；以B组为对照。以比色法测定脑、肝组织匀浆后的超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)含量。结果 与对照组比较，B组、C组脑组织SOD含量降低(P<0.05，<0.01)，C组MDA含量升高(P<0.05)。而肝脏仅C组SOD含量降低(P<0.05)。与B组比较，D组脑组织SOD、MDA含量均未发生显著变化；肝组织仅SOD发生显著变化(P<0.05)；E组脑组织SOD及MDA含量变化显著(P分别<0.01，<0.05)；肝组织均未发生显著变化。结论 宫内窘迫时，脑组织首先出现自由基变化，为新生儿缺血缺氧性脑损伤的早期防治提供了理论依据。
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Changes of Free Radicals in Fetal Rats Brain and Liver Following Intrauterine Fetal Distress
SONG Weiwei, HAN Yukun, SHANG Tao.
Second Hospital, China Medical University, Shenyang 110003
【Abstract】 Objective To analysis the effect of superoxide dismutase (SOD) and malondialdehyde (MDA) on different organs in intrauterine fetal distress. Methods The times of clamping uterine artery in A, B, C groups were 5, 10, 20 minites respectively. By clamping the matenal uterine vessels, we made the model of fetal rat distress. Slam group (13 pups) was used as control. After clamping 10 minutes, Group D (11 pups) was reperfused 5 minutes, and E (8 pups) 20 minutes. We measured the level of SOD and MDA in fetal brains and livers. Results The activity of cerebral SOD in group B and C decreased significantly than that of control (P<0.05, P<0.01). MDA in group C increased significantly than that of control (P<0.05). As for liver, only SOD in group C decreased significanlty (P<0.05). In that of reperfusion group, only in group E, cerebral SOD and MDA changed significantly (P<0.01, <0.05), livers SOD decreased significanlty (P<0.05).ConclusionAfter severe intrauterine fetal distress, changes of free radicals occurred in brains firstly, which provides the proof of early treatment for neonatal hypoxia ischemia brain damage.
, 百拇医药
【Key words】 Fetal distress Cerebral ischemia Cerebral anoxia Superoxides Malondialdehyde
新生儿缺血缺氧性脑病患者93.5%有直接或间接的窒息史[1]。窒息大多源于宫内窘迫，本研究以胎鼠为模型，对宫内窘迫后的重要脏器——脑、肝组织的自由基损伤情况进行研究，现将研究结果报告如下。
材料与方法
一、材料
1.动物模型的建立与分组：Wistar雌性大白鼠，平均体重260 g，以阴道涂片发现精子满视野为妊娠第1日，于妊娠第21日以5%戊巴比妥钠(0.1 ml/100 g)腹腔麻醉后，下腹正中切开腹部，暴露并分离双侧供应子宫的动、静脉血管。A组(胎鼠13只)钳夹子宫动、静脉造成完全缺血5分钟；B组(胎鼠10只)钳夹10分钟；C组(胎鼠11只)钳夹20分钟；对照组为假手术组(胎鼠13只)，方法同上，暴露分离血管后不钳夹；D组(胎鼠11只)钳夹10分钟后再灌注5分钟；E组(8只)钳夹10分钟后再灌注20分钟。并以B组为对照。
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2.试剂：测定超氧化物歧化酶(SOD)及丙二醛(MDA)的药盒均购自南京建成生物制品研究所。
二、方法
各组模型均于上述操作完成后立即剖宫取出胎鼠，断头处死，取脑、肝组织称重后，-80℃冷冻保存。测定时将脑、肝组织于冰盒内超声粉碎匀浆，4℃低温离心制成10%、1%匀浆液，分别按照SOD及MDA测定试剂盒要求依次加入各种试剂至反应完成后，用721分光光度计比色，依据公式计算得出SOD、MDA含量。
三、统计分析
所有数值均用SAS统计软件分析，行t检验。
结果
一、不同缺血时间脑、肝组织SOD及MDA含量变化
, 百拇医药 随着缺血时间的延长，脑组织SOD含量逐渐下降，其中B、C两组脑组织SOD含量与对照组比较，差异均有显著性(P<0.05，P<0.01)；MDA含量逐渐升高，仅C组与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。而肝组织虽然表现出与脑组织同样的趋势，但仅C组的SOD含量与对照组比较差异有显著性(P<0.05)。见表1。
表1 不同缺血时间胎鼠脑、肝组织SOD、MDA含量变化(
±s) 组别例数
脑
肝
SOD(NU/ml)
MAD(nmol/ml)
, 百拇医药
SOD(NU/ml)
MDA(nmol/ml)
A组
13
50.687±3.693
1.048±0.432
73.568±3.918
4.153±1.201
B组
10
49.358±3.906
1.398±0.492
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75.926±3.612
4.238±1.196
C组
11
37.415±3.967
1.517±0.476
76.297±3.986
4.397±1.203
对照组
13
52.396±3.531
1.031±0.398
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72.966±3.986
3.983±1.187
二、再灌注不同时间后脑、肝脏组织SOD及MDA含量变化
与B组比较，D组、E组脑组织SOD含量均降低，MDA含量均增加，但仅E组的变化有显著性(P分别<0.01，<0.05)。与B组比较，E组肝脏SOD含量降低有显著性(P<0.05)，MDA虽然增加，但差异无显著性(P>0.05)。见表2。
表2 再灌注不同时间胎鼠脑、肝组织SOD、MDA含量变化(
±s) 组别例数
脑
, 百拇医药
肝
SOD(NU/ml)
MAD(nmol/ml)
SOD(NU/ml)
MDA(nmol/ml)
D组
11
48.698±3.912
1.478±0.497
77.460±3.962
4.938±1.212
E组
, 百拇医药
8
34.453±3.009
1.892±0.408
79.986±3.988
5.274±1.178
B组
10
49.358±3.906
1.398±0.492
75.926±3.612
4.238±1.196
讨论
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一、SOD、MDA与组织缺血再灌注损伤
近年来，氧自由基及其介导的脂质过氧化反应在组织缺血再灌注损伤的发生、发展中的作用始终受到关注[2]。氧自由基的生成使SOD活性下降，导致膜脂质发生过氧化损伤，生成大量MDA，使细胞进一步遭到损害。因此，组织SOD活性下降和MDA含量增高可作为评定氧自由基生成及对膜脂质双层结构破坏的指标。尤其是MDA，其含量变化可反映氧自由基造成组织损伤的严重程度[3]。
二、宫内窘迫后脑、肝组织的自由基变化
本研究以大白鼠为动物模型，模拟宫内窘迫后发现，轻度缺血(5分钟)未出现脑、肝组织的自由基变化；脑组织在缺血10分钟后虽然有SOD活性的改变，但并没有MDA含量的显著变化；而缺血20分钟后，出现SOD活性明显降低，MDA含量显著升高，说明随着缺血时间的延长，氧自由基造成组织损伤逐渐明显，一定程度的单纯缺血也可以引起脑细胞的严重损伤；而肝脏的变化则相对滞后，仅缺血20分钟才出现SOD活性的改变，但因为MDA含量没有发生显著变化，所以无肝细胞严重损伤的证据；对各种组织的缺血再灌注研究已经证实：再灌注过程中SOD、MDA的变化往往是缺血过程中损伤的延续或加重[4]。本研究发现，缺血10分钟后再灌注5分钟与单纯缺血相比，脑、肝组织均未发生显著变化，而随着再灌注时间延长至20分钟，脑组织SOD活性及MDA含量均发生显著变化，说明此时脑细胞已发生了严重的损伤；以MDA含量变化为组织损伤严重程度的标志，可以看到：肝脏在缺血10分钟后即使再灌注20分钟，仍然无明显的细胞损伤。
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从上述结果可以看出，在宫内窘迫后，脑组织是最先受损的部位之一，即使在一定程度的缺血缺氧并未引起其他脏器损害的时候，脑组织已首先发生了变化，而自由基所介导的一系列反应在新生儿缺血缺氧性脑损伤中起一定的作用。新近的研究表明，Bcl-2基因家族对神经细胞凋亡的作用也与自由基相关[5]。SOD与MDA在宫内窘迫后的变化使我们认识到：源于宫内窘迫后的新生儿缺氧缺血性脑损伤是否在宫内已经开始发生?有待通过形态学等研究进一步证实。这些研究提示我们，对发生过严重宫内窘迫的新生儿，要在生后立即进行防治，甚至在宫内就应该行脑保护性治疗，这对降低新生儿缺血缺氧性脑病的发生，改善预后都具有重大意义。
参考文献
1 张莉莉，林久治，蔡玲玲.围产儿缺血缺氧性脑病124例的临床及病理学研究.中华妇产科杂志，1996，31：100-102.
2 Delivoria PM, Mishra OP. Mechainsms of cerebral injury in perinatal asphyxia and strategies for prevention. J Pediatr, 1998,132：30-34.
, http://www.100md.com
3 王万铁，徐正介，李东，等.心肌缺血再灌注损伤时MAP与MDA的相关分析.温州医学院学报，1997，27：76-78.
4 Liu PK, Hsu CY, Dizdaroglu M, et al. Damage repair and mutagenesis in nuclear genes after mouse forebrain ischemin reperfusion, J Neruosci, 1996,16：6795-6806.
5 Urabe T, Hattori N, Yoshikawa M, et al. Colocalization of Bcl-2 and 4-hydroxynonenal modified proteins in microglial cells and neurons of rat brain following transient focal ischemia. Neurosci Lett, 1998,247：159-162.
(收稿：1999-03-03 修回：1999-05-27), 百拇医药