异位子宫内膜细胞的凋亡与增殖的研究
作者：高颖 罗丽兰 何福仙
单位：高颖 同济医科大学附属协和医院妇产科 430022 武汉；罗丽兰，何福仙 同济医科大学附属同济医院妇产科
关键词：子宫内膜异位症；脱噬作用；基因；bcl-2；受体；表皮生长因子-尿抑胃素
中国妇产科杂志990906 【摘要】 目的 探讨异位子宫内膜细胞的凋亡特性及雌二醇(E2)、孕酮(P)、米非司酮对体外培养的人异位子宫内膜细胞表皮生长因子受体 (EGFR) 基因表达的影响。方法 对15例子宫内膜异位症(内异症)患者的异位内膜组织(异位内膜组)及11例非子宫内膜异位症患者的在位内膜组织(在位内膜组)进行体外细胞培养，采用流式细胞术检测两组细胞的细胞凋亡指数，同时应用原位杂交方法检测细胞中bcl-2的表达水平。应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术，分析12例内异症患者异位内膜细胞在单纯加入培养液(对照组)及在培养液中分别加入E2(10nmol/L)(E2组)、P(100 nmol/L)(P组)或P (100 nmol/L) + 米非司酮(1000 nmol/L)(P+米非司酮组)作用后，异位子宫内膜细胞中EGFR mRNA的表达水平。结果 异位内膜组的凋亡指数为(2.74±1.54)%，显著低于在位内膜组的(9.97±1.26)%(P<0.05)。异位内膜组中bcl-2表达阳性颗粒的积分吸光度值为7.26±0.42，明显高于在位内膜组的5.67±1.39(P<0.05)。与对照组EGFR基因表达的积分吸光度值(0.90±0.10)比较，E2组(1.10±0.19)及P组(1.28±0.24)均显著增高(P<0.01)，P+米非司酮组(0.63±0.11)的表达则明显降低(P<0.01)。结论 (1)异位子宫内膜细胞通过抗凋亡基因bcl-2的高表达而抑制细胞的凋亡过程，延长生命周期；(2)E2、P可促进异位内膜细胞的增生及分化，米非司酮则抑制这一过程。
, 百拇医药
Investigation of the Apoptosis and Proliferation in Endometriotic Cells
GAO Ying*, LUO Lilan, HE Fuxian.
*Union Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430032
【Abstract】 Objective To clarify whether apoptosis is involved in endometriosis and the effects of estradiol, progesterone and mifepristone on the expression of epidermal growth factor receptor(EGFR) in cultured human endometriotic cells. Methods Apoptosis index and bcl-2 gene expression were examined in cultured ectopic endometrial cells from women with endometriosis (n= 15 samples) and compared with eutopic endometrial cells from non-endometriosis cases(n = 11 samples).Apoptotic cells were detected by flowcytometry; bcl-2 gene expression demonstrated by in situ hybridization technique. The cultured endometriotic cells were stimulated by estradiol(E2,10 nmol/L), progesterone(P,100 nmol/L), and P + mifepristone(P 100 nmol/L + mifepristone 1000 nmol/L) respectively for 5 days, the expression of EGFR mRNA of endometriotic cells were determined by reverse transcript polymerase chain reaction (RT-PCR) method. Results The apoptosis index was significantly decreased in the ectopic endometrial cells [(2.74±1.54)%] as compared to eutopic endometrial cells [(9.97±1.26)%] (P<0.05). bcl-2 expression in endometriotic cells was significantly increased compared with the eutopic endometrial cells (P<0.05). The expression of EGFR mRNA in E2, P group was 1.10±0.19 and 1.28±0.24 respectively, which were significatly higher than that of control(0.90±0.10, P<0.01). In P+ mifepristone group it was 0.63±0.11, significantly lower than that of control(P<0.001). Conclusion The resistance of endometriotic cells to apoptosis may be fundamental in the aetiology and (or) pathophysiology of endometriosis. Estradiol and progesterone promote hyperplasia and differentiation of endometriotic cells while mifepristone inhibits.
, 百拇医药
【Key words】 Endometriosis Apoptosis Genes, bcl-2 Receptors, epidermal growth factor-urogastrone
近年来,人们已逐渐认识细胞凋亡对维持细胞平衡生长的重要作用[1]，子宫内膜异位症(内异症)异位内膜细胞的生长特性可能与细胞凋亡的改变有关。许多研究表明，表皮生长因子是卵巢甾体激素作用于其靶组织的重要介质[2]。为探讨细胞凋亡与内异症的关系，我们对离体培养的异位内膜细胞的细胞凋亡指数及其抗凋亡基因bcl-2的表达水平进行了检测。同时通过测定雌二醇(E2)、孕酮(P)及P受体拮抗剂米非司酮对体外培养的异位内膜细胞表皮生长因子受体(EGFR)基因表达的影响，了解异位内膜组织生长调节的机理。
资料与方法
一、研究对象
, http://www.100md.com
选自1997年4月至11月在同济医科大学附属同济医院行手术治疗的内异症患者15例，平均年龄29岁(26～34岁)，术前3个月内无激素用药史。手术均在增殖期及分泌早期进行，术中取典型的异位病灶组织(盆腔腹膜、腹壁及卵巢异位灶)(异位内膜组)，立即置入冰冷、无菌、含青霉素及链霉素的平衡溶液(Hank溶液)中送入实验室。所取组织均经病理学诊断证实。同时取11例同时期非内异症患者的在位子宫内膜组织(在位内膜组)，处理方法相同。
二、方法
1.组织处理及细胞培养：异位及在位内膜细胞的培养方法参照Ryan等[3]报道的方法，将组织尽量剪碎(直径小于1 mm×1 mm)，加入0.1%胶原酶溶液混匀后于37℃、5%二氧化碳培养箱中放置120～150分钟。将消化后的细胞悬液(含有内膜腺细胞及间质细胞)种植在25 ml的培养瓶或含有细胞小玻片的小瓶中，加入培养液置入37℃、5%二氧化碳培养箱中培养，在MEM培养基(美国Gibco公司产品)中加入10%小牛血清、2%谷氨酰胺、20 mmol缓冲液、100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素。24小时后倒去未贴壁细胞继续培养，间隔2～3天换液。对原代细胞于光镜下(×200倍)观察形态及生长情况。
, http://www.100md.com
2.细胞凋亡指数检测：采用流式细胞术检测。细胞培养5～7天(细胞全部或大部分融合)，用0.25%胰酶消化、Hank溶液洗涤后，加入预冷的70%乙醇固定，调整样品中细胞数为1×105个/ml，存放于4℃冰箱待检(时间不超过1个月)。检测时将备检的细胞悬液离心、洗涤后，加入碘化丙锭染色液(20 ng/ml)，同时加入RNA酶(50 U/ml)，于室温不透光处孵育30分钟后，检测每份样本，计数为1×104个细胞。检测结果通过计算机处理分析各参数，得出以百分数表示的细胞凋亡指数。
3.bcl-2表达的检测：采用原位杂交方法。将培养的细胞用4%聚合甲醛(pH 7.4)室温下固定20分钟，经梯度乙醇脱水后置-70℃保存备用。bcl-2杂交探针由同济医科大学免疫室提供，用地高辛标记及检测试剂盒(德国Boehringer Mannheim公司产品)进行检测。在光镜下(×200倍),异位内膜与在位内膜组选取20个细胞，用TJTY-300型全自动图像发现仪测定细胞内杂交颗粒的平均吸光度值。
, http://www.100md.com
4. 异位内膜细胞EGFR表达的测定：原代细胞全部或大部分融合后，用0.1%胰蛋白酶消化传代，2～3天细胞融合后分为4组：①对照组：单纯MEM培养液培养；②E2组：在培养液中加入终浓度为10 nmol/L的E2；③P组：在培养液中加入终浓度为100 nmol/L的孕激素；④P+米非司酮组：在培养液中加入终浓度为100 nmol/L的P及终浓度为1000 nmol/L的米非司酮。继续培养5天。(1)各组总EGFR RNA的提取、鉴定：用一步法RNA提取试剂盒(美国Gibco公司产品)提取细胞总RNA。各组RNA经甲醛变性凝胶电泳后，在紫外观测仪上均可见清晰的28、18及5亚单位3个条带。波长为260～280nm处的吸光度比值均保持在1.9以上，根据吸光度值计算出总RNA浓度。(2)EGFR引物设计及建立内参照：设计EGFR基因引物cDNA序列[4]，上游引物为：5′AGCTCACGCAGTTGGGCACT3′，下游引物为5′TCTCATGGGCAGCTCCTTCA3′，扩增片段长304 bp。β2微球蛋白(β2MG)在所有细胞膜上均能高表达，表达相对恒定，很少受其他因素的影响。因此，选用β2MG作为内参照，矫正加样误差。β2MG引物序列为5′CCACTGAAAAAGATGAGT-AT-3′，5′CTTC- AACCTCCAGATGCTG3′，扩增片段长120 bp。(3)逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)条件及产物测定：试剂盒购自美国Promaga公司。对定量模板RNA在同一体系中完成mRNA转录成cDNA及cDNA的PCR扩增，用EGFR及β2MG的下游引物作为逆转录的引物。反应的模板量均为10 ng，反应程序：42℃、48分钟(逆转录)，94℃、2分钟(cDNA变性)；PCR条件：变性为94℃、30秒，退火为60℃、60秒，延伸为68℃、120秒，循环30次，最后延伸为68℃、7分钟。PCR反应结束取10 μl产物在2%琼脂糖凝胶中电泳(50V)1小时，溴化乙锭染色，全自动图象分析仪测定紫外线下各电泳条带的灰度值，计算出β2MG/EGFR的灰度比值，即为异位细胞EGFR mRNA的表达水平。
, 百拇医药
三、统计方法
实验结果均以
±s表示，用方差分析及t检验进行统计处理。
结果
一、体外培养的异位及在位子宫内膜细胞的形态学
观察原代培养的异位和在位子宫内膜细胞的腺细胞与间质细胞比例没有显著性差异。腺上皮细胞呈插入性生长，细胞为星形、多角形，细胞多呈旋窝状、成团生长；间质细胞则呈伸展、挺直状，中间稍宽，两头尖，呈成纤维细胞样梭形生长。
二、细胞凋亡指数测定结果
异位内膜组的凋亡指数为(2.74±1.54)%，显著低于在位内膜组的(9.97±1.26)%(P<0.05)。
, 百拇医药
三、bcl-2表达的检测结果
异位及在位内膜细胞中的腺细胞及间质细胞均有bcl-2的表达，bcl-2 mRNA表达的阳性颗粒呈紫蓝色，细沙状，大小一致，均匀分布于细胞内。异位内膜组细胞内的阳性表达颗粒明显增多，密集分布于整个胞体内，呈深紫蓝色(图1)；在位内膜组中阳性颗粒较少，染色较浅(图2)。异位内膜组阳性颗粒的平均积分吸光度值为7.26±0.42，明显高于在位内膜组的5.67±1.39(P<0.05)。
图1 异位内膜细胞内的bcl-2mRNA 阳性表达颗粒明显增多，密集颁于整个胞体内，呈深紫蓝色。原位杂交×400
, http://www.100md.com
图2 在位内膜细胞中bcl-2mRNA表达的阳性颗粒较少，显色较浅。原位杂交×400
四、异位内膜细胞各组EGFR mRNA的表达水平
各组反应产物均有相应的扩增带：β2MG 120bp，EGFR 304bp。但显示表达水平的灰度比值各组不一，E2组的灰度比值为1.10±0.19，P组为1.28±0.24，两组比值均显著性大于对照组的0.90±0.10(P<0.01)；而P+米非司酮组的灰度比值为0.63±0.11，小于P组及对照组(P<0.01)。
讨论
一、细胞凋亡与内异症发病的关系
1.异位内膜细胞凋亡指数降低的意义：细胞凋亡是真核生物有核细胞死亡的一种方式，是受高度调节的生理性死亡过程[5]。细胞以凋亡方式自杀，对机体的自身稳定起积极作用，若此环节发生异常，则会出现细胞堆积而引起疾病甚至导致肿瘤的发生。McLaren等[6]推测，异位内膜细胞在盆腔内得以继续存活及种植，很可能与其对凋亡的抵抗力增强有关。本研究发现，异位内膜细胞的凋亡指数显著低于在位内膜细胞。由此可以认为，由于异位内膜细胞的抗凋亡性较强，使其在盆腔内的生存时间延长，加之异位细胞又具有粘附性强及侵蚀性生长的特点[7]，促成其在盆腔内种植及存活，并具有肿瘤样增殖特性，使内异症得以发生及发展。
, 百拇医药
2.异位内膜细胞bcl-2基因高表达的意义：细胞凋亡过程是受基因的精确调控而实现的，根据相关基因的作用不同可分为两类：一类是诱导细胞凋亡的基因，一类是抑制细胞凋亡的基因。bcl-2为一种重要的凋亡抑制基因，当细胞中bcl-2蛋白表达升高时，细胞的凋亡过程即受到抑制，细胞生存时间延长[8]。本研究发现，在异位内膜细胞中bcl-2 mRNA的表达显著高于在位内膜细胞，而前者的细胞凋亡指数明显低于后者，此结果与国外学者研究的bcl-2在在位内膜组织中的作用相同，即bcl-2在在位内膜组织中的表达与细胞凋亡的发生呈负相关。因此我们认为，异位内膜细胞可通过bcl-2基因的高表达而增强自身的抗凋亡能力，得以在宫腔外存活及种植，形成异位病灶。
二、 EGFR与内异症的关系
EGFR是相对分子质量为17 000的糖蛋白，是表皮生长因子(EGF)及转化生长因子的共同受体，被激活后促进各种上皮细胞的增生及分化。已证实，异位内膜组织中有EGFR的表达，EGFR在有激素效应的组织细胞中，对细胞分化起重要作用。
, 百拇医药
1.E2、P与异位内膜细胞中EGFR基因表达的关系：腹腔液为异位病灶生长的特殊微环境[9]，甾体激素水平较高，而且异位组织能表达甾体激素受体，但甾体激素对异位细胞发挥作用的途径目前尚无定论。本研究结果发现，E2、P均能诱导异位内膜细胞中EGFR基因的高表达，证实E2、P对异位内膜细胞的增殖有调控作用，部分是通过EGF家族作为中介物质而实现的。此结果与国外学者报道的相同。在分子水平上进一步证实了内异症的性激素依赖性。而P诱导EGFR基因表达的作用强于E2，推测P与内异症的发展关系更密切。一般认为P不引起内膜细胞的增殖，因此P在内异症病理生理过程中所起的作用，有待于进一步探讨。
2.米非司酮对异位内膜细胞EGFR基因表达的抑制作用：米非司酮是受体水平的P拮抗剂，有报道说明其治疗内异症的有效性[10]。本研究说明，米非司酮可能是通过拮抗P的作用，或通过直接降低异位细胞EGFR的自(旁)分泌而抑制异位内膜的增殖，达到临床上的治疗目的。
, 百拇医药
参考文献
1 Suganuma N, Harada M, Furuhashi M, et al. Apoptosis in human endometrial and endometriotic tissues.Hormone Research, 1997,48:42-47.
2 Taketani Y ,Mizuno M. Evidence for direct regulation of epidermal growth factor receptors by steroid hormones in humen endometrial cells. Hum Reprod,1991,6: 1365-1369.
3 Ryan IP, Schriock E, Taylor RN. Isolation, characterization and comparison of human endometrial and endometriosis cells in vitro. J Clin Endocrinol Metab，1994, 78: 642-649.
, http://www.100md.com
4 Yeh J, Rein M, Nowak R, et al. Presence of messenger ribonucleic acid for epidermal growth factor(EGF) and receptor demonstrable in monolayer cell cultures of myometria and leiomyomata. Fertil Steril,1991,56: 997-1000.
5 Vaux DL, Strasser A. The molecular biology of apoptosis. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93:2239-2244.
6 McLaren J, Prentice A, Charnock-Jones DS, et al. Immunolocalization of the apoptosis regulating protein Bcl-2 and Bax in human endometrium and isolated peritoneal fluid macrophages in endometriosis. Human Reprod, 1997, 12:146-152.
, http://www.100md.com
7 Gaetje R, Kotzian S, Herrmann G, et al. Invasiveness of endometriotic cells in vitro. Lancet, 1995, 346:1643-1644.
8 Reed JC. Bcl-2 and the regulation of programmed cell death. J Cell Biol, 1994, 124:1-6.
9 Koninckx PR, Kennedy SH, Barlow DH. Endometriotic disease: the role of peritoneal fluid. Hum Reprod Update，1998，4：741-751.
10 Kettel LM, Murphy AA, Morales AJ, et al. Treatment of endometriosis with the antiprogesterone mifepristone (RU486). Fertil Steril, 1996, 65: 23-28.
(收稿：1998-09-08 修回：1999-06-01), http://www.100md.com
单位：高颖 同济医科大学附属协和医院妇产科 430022 武汉；罗丽兰，何福仙 同济医科大学附属同济医院妇产科
关键词：子宫内膜异位症；脱噬作用；基因；bcl-2；受体；表皮生长因子-尿抑胃素
中国妇产科杂志990906 【摘要】 目的 探讨异位子宫内膜细胞的凋亡特性及雌二醇(E2)、孕酮(P)、米非司酮对体外培养的人异位子宫内膜细胞表皮生长因子受体 (EGFR) 基因表达的影响。方法 对15例子宫内膜异位症(内异症)患者的异位内膜组织(异位内膜组)及11例非子宫内膜异位症患者的在位内膜组织(在位内膜组)进行体外细胞培养，采用流式细胞术检测两组细胞的细胞凋亡指数，同时应用原位杂交方法检测细胞中bcl-2的表达水平。应用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术，分析12例内异症患者异位内膜细胞在单纯加入培养液(对照组)及在培养液中分别加入E2(10nmol/L)(E2组)、P(100 nmol/L)(P组)或P (100 nmol/L) + 米非司酮(1000 nmol/L)(P+米非司酮组)作用后，异位子宫内膜细胞中EGFR mRNA的表达水平。结果 异位内膜组的凋亡指数为(2.74±1.54)%，显著低于在位内膜组的(9.97±1.26)%(P<0.05)。异位内膜组中bcl-2表达阳性颗粒的积分吸光度值为7.26±0.42，明显高于在位内膜组的5.67±1.39(P<0.05)。与对照组EGFR基因表达的积分吸光度值(0.90±0.10)比较，E2组(1.10±0.19)及P组(1.28±0.24)均显著增高(P<0.01)，P+米非司酮组(0.63±0.11)的表达则明显降低(P<0.01)。结论 (1)异位子宫内膜细胞通过抗凋亡基因bcl-2的高表达而抑制细胞的凋亡过程，延长生命周期；(2)E2、P可促进异位内膜细胞的增生及分化，米非司酮则抑制这一过程。
, 百拇医药
Investigation of the Apoptosis and Proliferation in Endometriotic Cells
GAO Ying*, LUO Lilan, HE Fuxian.
*Union Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430032
【Abstract】 Objective To clarify whether apoptosis is involved in endometriosis and the effects of estradiol, progesterone and mifepristone on the expression of epidermal growth factor receptor(EGFR) in cultured human endometriotic cells. Methods Apoptosis index and bcl-2 gene expression were examined in cultured ectopic endometrial cells from women with endometriosis (n= 15 samples) and compared with eutopic endometrial cells from non-endometriosis cases(n = 11 samples).Apoptotic cells were detected by flowcytometry; bcl-2 gene expression demonstrated by in situ hybridization technique. The cultured endometriotic cells were stimulated by estradiol(E2,10 nmol/L), progesterone(P,100 nmol/L), and P + mifepristone(P 100 nmol/L + mifepristone 1000 nmol/L) respectively for 5 days, the expression of EGFR mRNA of endometriotic cells were determined by reverse transcript polymerase chain reaction (RT-PCR) method. Results The apoptosis index was significantly decreased in the ectopic endometrial cells [(2.74±1.54)%] as compared to eutopic endometrial cells [(9.97±1.26)%] (P<0.05). bcl-2 expression in endometriotic cells was significantly increased compared with the eutopic endometrial cells (P<0.05). The expression of EGFR mRNA in E2, P group was 1.10±0.19 and 1.28±0.24 respectively, which were significatly higher than that of control(0.90±0.10, P<0.01). In P+ mifepristone group it was 0.63±0.11, significantly lower than that of control(P<0.001). Conclusion The resistance of endometriotic cells to apoptosis may be fundamental in the aetiology and (or) pathophysiology of endometriosis. Estradiol and progesterone promote hyperplasia and differentiation of endometriotic cells while mifepristone inhibits.
, 百拇医药
【Key words】 Endometriosis Apoptosis Genes, bcl-2 Receptors, epidermal growth factor-urogastrone
近年来,人们已逐渐认识细胞凋亡对维持细胞平衡生长的重要作用[1]，子宫内膜异位症(内异症)异位内膜细胞的生长特性可能与细胞凋亡的改变有关。许多研究表明，表皮生长因子是卵巢甾体激素作用于其靶组织的重要介质[2]。为探讨细胞凋亡与内异症的关系，我们对离体培养的异位内膜细胞的细胞凋亡指数及其抗凋亡基因bcl-2的表达水平进行了检测。同时通过测定雌二醇(E2)、孕酮(P)及P受体拮抗剂米非司酮对体外培养的异位内膜细胞表皮生长因子受体(EGFR)基因表达的影响，了解异位内膜组织生长调节的机理。
资料与方法
一、研究对象
, http://www.100md.com
选自1997年4月至11月在同济医科大学附属同济医院行手术治疗的内异症患者15例，平均年龄29岁(26～34岁)，术前3个月内无激素用药史。手术均在增殖期及分泌早期进行，术中取典型的异位病灶组织(盆腔腹膜、腹壁及卵巢异位灶)(异位内膜组)，立即置入冰冷、无菌、含青霉素及链霉素的平衡溶液(Hank溶液)中送入实验室。所取组织均经病理学诊断证实。同时取11例同时期非内异症患者的在位子宫内膜组织(在位内膜组)，处理方法相同。
二、方法
1.组织处理及细胞培养：异位及在位内膜细胞的培养方法参照Ryan等[3]报道的方法，将组织尽量剪碎(直径小于1 mm×1 mm)，加入0.1%胶原酶溶液混匀后于37℃、5%二氧化碳培养箱中放置120～150分钟。将消化后的细胞悬液(含有内膜腺细胞及间质细胞)种植在25 ml的培养瓶或含有细胞小玻片的小瓶中，加入培养液置入37℃、5%二氧化碳培养箱中培养，在MEM培养基(美国Gibco公司产品)中加入10%小牛血清、2%谷氨酰胺、20 mmol缓冲液、100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素。24小时后倒去未贴壁细胞继续培养，间隔2～3天换液。对原代细胞于光镜下(×200倍)观察形态及生长情况。
, http://www.100md.com
2.细胞凋亡指数检测：采用流式细胞术检测。细胞培养5～7天(细胞全部或大部分融合)，用0.25%胰酶消化、Hank溶液洗涤后，加入预冷的70%乙醇固定，调整样品中细胞数为1×105个/ml，存放于4℃冰箱待检(时间不超过1个月)。检测时将备检的细胞悬液离心、洗涤后，加入碘化丙锭染色液(20 ng/ml)，同时加入RNA酶(50 U/ml)，于室温不透光处孵育30分钟后，检测每份样本，计数为1×104个细胞。检测结果通过计算机处理分析各参数，得出以百分数表示的细胞凋亡指数。
3.bcl-2表达的检测：采用原位杂交方法。将培养的细胞用4%聚合甲醛(pH 7.4)室温下固定20分钟，经梯度乙醇脱水后置-70℃保存备用。bcl-2杂交探针由同济医科大学免疫室提供，用地高辛标记及检测试剂盒(德国Boehringer Mannheim公司产品)进行检测。在光镜下(×200倍),异位内膜与在位内膜组选取20个细胞，用TJTY-300型全自动图像发现仪测定细胞内杂交颗粒的平均吸光度值。
, http://www.100md.com
4. 异位内膜细胞EGFR表达的测定：原代细胞全部或大部分融合后，用0.1%胰蛋白酶消化传代，2～3天细胞融合后分为4组：①对照组：单纯MEM培养液培养；②E2组：在培养液中加入终浓度为10 nmol/L的E2；③P组：在培养液中加入终浓度为100 nmol/L的孕激素；④P+米非司酮组：在培养液中加入终浓度为100 nmol/L的P及终浓度为1000 nmol/L的米非司酮。继续培养5天。(1)各组总EGFR RNA的提取、鉴定：用一步法RNA提取试剂盒(美国Gibco公司产品)提取细胞总RNA。各组RNA经甲醛变性凝胶电泳后，在紫外观测仪上均可见清晰的28、18及5亚单位3个条带。波长为260～280nm处的吸光度比值均保持在1.9以上，根据吸光度值计算出总RNA浓度。(2)EGFR引物设计及建立内参照：设计EGFR基因引物cDNA序列[4]，上游引物为：5′AGCTCACGCAGTTGGGCACT3′，下游引物为5′TCTCATGGGCAGCTCCTTCA3′，扩增片段长304 bp。β2微球蛋白(β2MG)在所有细胞膜上均能高表达，表达相对恒定，很少受其他因素的影响。因此，选用β2MG作为内参照，矫正加样误差。β2MG引物序列为5′CCACTGAAAAAGATGAGT-AT-3′，5′CTTC- AACCTCCAGATGCTG3′，扩增片段长120 bp。(3)逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)条件及产物测定：试剂盒购自美国Promaga公司。对定量模板RNA在同一体系中完成mRNA转录成cDNA及cDNA的PCR扩增，用EGFR及β2MG的下游引物作为逆转录的引物。反应的模板量均为10 ng，反应程序：42℃、48分钟(逆转录)，94℃、2分钟(cDNA变性)；PCR条件：变性为94℃、30秒，退火为60℃、60秒，延伸为68℃、120秒，循环30次，最后延伸为68℃、7分钟。PCR反应结束取10 μl产物在2%琼脂糖凝胶中电泳(50V)1小时，溴化乙锭染色，全自动图象分析仪测定紫外线下各电泳条带的灰度值，计算出β2MG/EGFR的灰度比值，即为异位细胞EGFR mRNA的表达水平。
, 百拇医药
三、统计方法
实验结果均以
±s表示，用方差分析及t检验进行统计处理。结果
一、体外培养的异位及在位子宫内膜细胞的形态学
观察原代培养的异位和在位子宫内膜细胞的腺细胞与间质细胞比例没有显著性差异。腺上皮细胞呈插入性生长，细胞为星形、多角形，细胞多呈旋窝状、成团生长；间质细胞则呈伸展、挺直状，中间稍宽，两头尖，呈成纤维细胞样梭形生长。
二、细胞凋亡指数测定结果
异位内膜组的凋亡指数为(2.74±1.54)%，显著低于在位内膜组的(9.97±1.26)%(P<0.05)。
, 百拇医药
三、bcl-2表达的检测结果
异位及在位内膜细胞中的腺细胞及间质细胞均有bcl-2的表达，bcl-2 mRNA表达的阳性颗粒呈紫蓝色，细沙状，大小一致，均匀分布于细胞内。异位内膜组细胞内的阳性表达颗粒明显增多，密集分布于整个胞体内，呈深紫蓝色(图1)；在位内膜组中阳性颗粒较少，染色较浅(图2)。异位内膜组阳性颗粒的平均积分吸光度值为7.26±0.42，明显高于在位内膜组的5.67±1.39(P<0.05)。
图1 异位内膜细胞内的bcl-2mRNA 阳性表达颗粒明显增多，密集颁于整个胞体内，呈深紫蓝色。原位杂交×400
, http://www.100md.com
图2 在位内膜细胞中bcl-2mRNA表达的阳性颗粒较少，显色较浅。原位杂交×400
四、异位内膜细胞各组EGFR mRNA的表达水平
各组反应产物均有相应的扩增带：β2MG 120bp，EGFR 304bp。但显示表达水平的灰度比值各组不一，E2组的灰度比值为1.10±0.19，P组为1.28±0.24，两组比值均显著性大于对照组的0.90±0.10(P<0.01)；而P+米非司酮组的灰度比值为0.63±0.11，小于P组及对照组(P<0.01)。
讨论
一、细胞凋亡与内异症发病的关系
1.异位内膜细胞凋亡指数降低的意义：细胞凋亡是真核生物有核细胞死亡的一种方式，是受高度调节的生理性死亡过程[5]。细胞以凋亡方式自杀，对机体的自身稳定起积极作用，若此环节发生异常，则会出现细胞堆积而引起疾病甚至导致肿瘤的发生。McLaren等[6]推测，异位内膜细胞在盆腔内得以继续存活及种植，很可能与其对凋亡的抵抗力增强有关。本研究发现，异位内膜细胞的凋亡指数显著低于在位内膜细胞。由此可以认为，由于异位内膜细胞的抗凋亡性较强，使其在盆腔内的生存时间延长，加之异位细胞又具有粘附性强及侵蚀性生长的特点[7]，促成其在盆腔内种植及存活，并具有肿瘤样增殖特性，使内异症得以发生及发展。
, 百拇医药
2.异位内膜细胞bcl-2基因高表达的意义：细胞凋亡过程是受基因的精确调控而实现的，根据相关基因的作用不同可分为两类：一类是诱导细胞凋亡的基因，一类是抑制细胞凋亡的基因。bcl-2为一种重要的凋亡抑制基因，当细胞中bcl-2蛋白表达升高时，细胞的凋亡过程即受到抑制，细胞生存时间延长[8]。本研究发现，在异位内膜细胞中bcl-2 mRNA的表达显著高于在位内膜细胞，而前者的细胞凋亡指数明显低于后者，此结果与国外学者研究的bcl-2在在位内膜组织中的作用相同，即bcl-2在在位内膜组织中的表达与细胞凋亡的发生呈负相关。因此我们认为，异位内膜细胞可通过bcl-2基因的高表达而增强自身的抗凋亡能力，得以在宫腔外存活及种植，形成异位病灶。
二、 EGFR与内异症的关系
EGFR是相对分子质量为17 000的糖蛋白，是表皮生长因子(EGF)及转化生长因子的共同受体，被激活后促进各种上皮细胞的增生及分化。已证实，异位内膜组织中有EGFR的表达，EGFR在有激素效应的组织细胞中，对细胞分化起重要作用。
, 百拇医药
1.E2、P与异位内膜细胞中EGFR基因表达的关系：腹腔液为异位病灶生长的特殊微环境[9]，甾体激素水平较高，而且异位组织能表达甾体激素受体，但甾体激素对异位细胞发挥作用的途径目前尚无定论。本研究结果发现，E2、P均能诱导异位内膜细胞中EGFR基因的高表达，证实E2、P对异位内膜细胞的增殖有调控作用，部分是通过EGF家族作为中介物质而实现的。此结果与国外学者报道的相同。在分子水平上进一步证实了内异症的性激素依赖性。而P诱导EGFR基因表达的作用强于E2，推测P与内异症的发展关系更密切。一般认为P不引起内膜细胞的增殖，因此P在内异症病理生理过程中所起的作用，有待于进一步探讨。
2.米非司酮对异位内膜细胞EGFR基因表达的抑制作用：米非司酮是受体水平的P拮抗剂，有报道说明其治疗内异症的有效性[10]。本研究说明，米非司酮可能是通过拮抗P的作用，或通过直接降低异位细胞EGFR的自(旁)分泌而抑制异位内膜的增殖，达到临床上的治疗目的。
, 百拇医药
参考文献
1 Suganuma N, Harada M, Furuhashi M, et al. Apoptosis in human endometrial and endometriotic tissues.Hormone Research, 1997,48:42-47.
2 Taketani Y ,Mizuno M. Evidence for direct regulation of epidermal growth factor receptors by steroid hormones in humen endometrial cells. Hum Reprod,1991,6: 1365-1369.
3 Ryan IP, Schriock E, Taylor RN. Isolation, characterization and comparison of human endometrial and endometriosis cells in vitro. J Clin Endocrinol Metab，1994, 78: 642-649.
, http://www.100md.com
4 Yeh J, Rein M, Nowak R, et al. Presence of messenger ribonucleic acid for epidermal growth factor(EGF) and receptor demonstrable in monolayer cell cultures of myometria and leiomyomata. Fertil Steril,1991,56: 997-1000.
5 Vaux DL, Strasser A. The molecular biology of apoptosis. Proc Natl Acad Sci USA, 1996, 93:2239-2244.
6 McLaren J, Prentice A, Charnock-Jones DS, et al. Immunolocalization of the apoptosis regulating protein Bcl-2 and Bax in human endometrium and isolated peritoneal fluid macrophages in endometriosis. Human Reprod, 1997, 12:146-152.
, http://www.100md.com
7 Gaetje R, Kotzian S, Herrmann G, et al. Invasiveness of endometriotic cells in vitro. Lancet, 1995, 346:1643-1644.
8 Reed JC. Bcl-2 and the regulation of programmed cell death. J Cell Biol, 1994, 124:1-6.
9 Koninckx PR, Kennedy SH, Barlow DH. Endometriotic disease: the role of peritoneal fluid. Hum Reprod Update，1998，4：741-751.
10 Kettel LM, Murphy AA, Morales AJ, et al. Treatment of endometriosis with the antiprogesterone mifepristone (RU486). Fertil Steril, 1996, 65: 23-28.
(收稿：1998-09-08 修回：1999-06-01), http://www.100md.com