荧光原位杂交技术用于孕早期滋养细胞产前基因诊断的研究
作者：张爱臣 李守柔 宋杰 胡静 刘丽娟 黄冰玉 王永香
单位：张爱臣 白求恩医科大学第三临床学院 130031 长春；李守柔,宋杰,胡静,刘丽娟,黄冰玉 第二临床学院；王永香 第一临床学院
关键词：
中华妇产科杂志991016 性连锁遗传病的种类高达300多种，其危害严重。通过产前性别的诊断，可以减少该类疾病患儿的出生。孕中期羊膜腔穿刺、B型超声可以诊断胎儿的性别，但越晚期引产越增加孕妇的精神负担。故在孕早期进行产前基因诊断，极为重要。我们设计了用8号硅胶导管经宫颈冲洗宫腔收集滋养细胞，并用双色X/Y计数探针进行荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)以探讨孕早期产前诊断的新方法。
一、资料和方法
, http://www.100md.com 1.细胞来源：在我院门诊行人工流产术的孕妇110例，孕期为40～80天，身体健康无任何合并症。以我室常规宫腔冲洗方法收集细胞[1]，制成细胞悬液，滴片，待自然干燥24小时后杂交。同时将人工流产术后的绒毛进行染色体核型分析作为对照。
2.探针、杂交及杂交信号检测：双色X/Y染色体计数探针由美国Vysis公司惠赠，X探针用罗达明直接标记，呈桔红色。Y探针用荧光黄直接标记，呈绿色。杂交过程：待测标本的玻片放于(73±1)℃的变性液中5～8分钟，系列酒精(70%、85%、100%)中各脱水1分钟，然后玻片放于45～50℃加热器中2分钟。立刻把已变性的探针混合液加到玻片的靶区(从加入探针开始避光操作)，加盖盖玻片，把玻片放于事先预热到42℃的潮湿杂交盒中，放于培养箱内杂交1小时。用快速冲洗方法冲洗玻片，去掉盖玻片后立即浸入(73±1)℃的0.4×SSC液中冲洗玻片2分钟,然后在2×SSC/0.01% NP-40液中冲洗1分钟，取出玻片在黑暗空气中干燥，在靶区滴DAPI抗淬灭的复染剂，加盖盖玻片。荧光显微镜观察杂交结果，用三带通滤光片(同时看到桔红色、绿色、蓝色)检测X、Y杂交点，计数50个细胞核杂交结果。无信号或杂交信号重叠的细胞核则不予计数。
, 百拇医药
3.统计学方法：统计学处理采用χ2检验。
二、结果
1.不同取材方法的成功率：110例孕妇的宫腔冲洗液中，获含有滋养细胞的冲洗液97份，初期用橡胶导管取材28例，取材成功20例，成功率为71.4%。用硅胶导管取材82例，成功77例，成功率为93.9%，经统计学处理，差异有极显著性(P<0.01)。
2.荧光原位杂交技术用于胎儿细胞诊断的准确率:42例冲洗宫腔收集的细胞用双色X/Y计数探针杂交，在1个细胞内出现桔红色-绿色荧光信号为男性胚胎(图1)；出现两个桔红色荧光信号为女性胚胎(图2)。荧光原位杂交结果与绒毛核型分析性别鉴定进行对照。42例荧光原位杂交结果有27例为男性胚胎，15例女性胚胎；绒毛核型分析结果有29例为男性胚胎，13例为女性胚胎。用荧光原位杂交技术诊断胎儿性别的灵敏度为93.1%，假阴性率为6.8%，诊断符合率为95.2%。在男性胚胎的标本中出现桔红色-绿色荧光杂交信号的细胞比例为3%～100%。
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图1 X/Y计数探针荧光原位杂交技术检测男性
胚胎滋养细胞呈桔红色-绿色XY荧光信号。三带通滤光片×1000
图2 X/Y计数探针荧光原位杂交技术检测女性胚胎
滋养细胞呈两个桔红色XX荧光信号。三带通滤光片×1000
三、讨论
, 百拇医药
滋养细胞是否可以脱落进入宫腔及宫颈，一直存在着争议。随着现代分子生物学技术的发展，越来越多的学者都证实它的存在。利用这种细胞进行遗传病的产前诊断是遗传及优生工作者普遍关心的问题。
本研究用宫腔冲洗液收集滋养细胞的方法，共取材110例，回收到含有滋养细胞的冲洗液97份，后期取材成功率为93.3%。后期所用8号硅胶导管较细，直径为3 mm左右，其顶端是盲端，在其两侧的不同高度分别有两个小孔，当缓慢注入液体后，松开注射器，将导管的注射器端低于宫腔的高度，依靠虹吸原理或用注射器轻轻回吸，冲洗液就可以缓慢流入注射器内。
经宫颈冲洗宫腔收集滋养细胞后对胚胎及孕妇是否有影响，目前还没有此方面的研究，我们曾对1例妊娠50天的孕妇行宫腔冲洗，2周后才进行人工流产，在这2周期间未出现阴道流血、发热及流产现象。
1986年Gremer等[2]证实了荧光原位杂交技术应用于间期细胞核检测染色体非整倍体异常的可行性。我们用双色X/Y计数探针对42例冲洗宫腔收集的胎儿细胞进行荧光原位杂交，诊断胚胎的性别，诊断胚胎性别符合率为95.2%，29例男性胚胎中出现两例假阴性，分析其原因可能在处理标本过程中，造成为数不多的滋养细胞的丢失。用双色X/Y计数探针进行荧光原位杂交的优点是：(1)可以进行胚胎性别的诊断。(2)可以诊断X、Y染色体的非整倍体的异常，如47，XXY、45，XO等。(3)可以估计母体细胞污染情况。目前，各种方法收集的胎儿细胞或多或少都含有母体细胞，用双色X/Y计数探针的荧光原位杂交技术，母体细胞呈XX荧光信号，对于男性胚胎的细胞呈XY荧光信号，这样就可以估计母体细胞的污染情况。(4)不必担心精子细胞的污染，因精子细胞染色体是单倍体。冲洗宫腔收集的滋养细胞在所有收集细胞占多大比例，目前没有一致意见，这与宫腔冲洗方法、操作熟练程度、处理细胞的方法以及检测方法、荧光原位杂交探针的选择不同而有所不同。Ishai等[3]用X/Y染色体探针荧光原位杂交技术检测16例宫腔冲洗液中收集的滋养细胞，滋养细胞占收集细胞的92.0%～96.0%。Drayri等[4]在宫腔冲洗液中收集的细胞，出现XY荧光信号的比例为3.6%～47.8%。我们收集的标本中，男性胚胎出现XY荧光信号占3.0%～100.0%。
, 百拇医药
随着各种探针的不断涌现和经宫颈收集细胞的技术不断提高，荧光原位杂交技术和经宫颈收集滋养细胞的联合检测，为孕早期性连锁疾病的性别和性染色体非整倍体异常的产前基因诊断，开拓了一条新途径。
参考文献
1 赵林淑，胡静，黄冰玉. 应用宫腔冲洗滋养细胞行产前诊断. 中华妇产科杂志，1997，32：55-56.
2 Gremer T，Lundegen J，Bruckner A，et al.Detection of chromosome aberration in the human interfuase nucleus by visualization of specific target DNAs with radioactive and nonradioactive in situ hybridization techniques:diagnosis of trisomy18 with probe L184. Hum Genet, 1986,74:346-352.
, 百拇医药
3 Ishai D, Amiel A, Diukman R, et al. Uterine cavity lavage: Adding FISH to conventional cytogentics for embryonic sexing and diagnosing common chromosomal aberrations. Prenatal Diagnosis. 1995,15:961-965.
4 Drayri YP, Penna LK, Patton MA, et al.Detection of cells of fetal origin from transcervical irrigations. Prenatal Diagnosis, 1997, 17: 243-248.
(收稿：1998-08-19 修回：1999-06-11), 百拇医药
单位：张爱臣 白求恩医科大学第三临床学院 130031 长春；李守柔,宋杰,胡静,刘丽娟,黄冰玉 第二临床学院；王永香 第一临床学院
关键词：
中华妇产科杂志991016 性连锁遗传病的种类高达300多种，其危害严重。通过产前性别的诊断，可以减少该类疾病患儿的出生。孕中期羊膜腔穿刺、B型超声可以诊断胎儿的性别，但越晚期引产越增加孕妇的精神负担。故在孕早期进行产前基因诊断，极为重要。我们设计了用8号硅胶导管经宫颈冲洗宫腔收集滋养细胞，并用双色X/Y计数探针进行荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization，FISH)以探讨孕早期产前诊断的新方法。
一、资料和方法
, http://www.100md.com 1.细胞来源：在我院门诊行人工流产术的孕妇110例，孕期为40～80天，身体健康无任何合并症。以我室常规宫腔冲洗方法收集细胞[1]，制成细胞悬液，滴片，待自然干燥24小时后杂交。同时将人工流产术后的绒毛进行染色体核型分析作为对照。
2.探针、杂交及杂交信号检测：双色X/Y染色体计数探针由美国Vysis公司惠赠，X探针用罗达明直接标记，呈桔红色。Y探针用荧光黄直接标记，呈绿色。杂交过程：待测标本的玻片放于(73±1)℃的变性液中5～8分钟，系列酒精(70%、85%、100%)中各脱水1分钟，然后玻片放于45～50℃加热器中2分钟。立刻把已变性的探针混合液加到玻片的靶区(从加入探针开始避光操作)，加盖盖玻片，把玻片放于事先预热到42℃的潮湿杂交盒中，放于培养箱内杂交1小时。用快速冲洗方法冲洗玻片，去掉盖玻片后立即浸入(73±1)℃的0.4×SSC液中冲洗玻片2分钟,然后在2×SSC/0.01% NP-40液中冲洗1分钟，取出玻片在黑暗空气中干燥，在靶区滴DAPI抗淬灭的复染剂，加盖盖玻片。荧光显微镜观察杂交结果，用三带通滤光片(同时看到桔红色、绿色、蓝色)检测X、Y杂交点，计数50个细胞核杂交结果。无信号或杂交信号重叠的细胞核则不予计数。
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3.统计学方法：统计学处理采用χ2检验。
二、结果
1.不同取材方法的成功率：110例孕妇的宫腔冲洗液中，获含有滋养细胞的冲洗液97份，初期用橡胶导管取材28例，取材成功20例，成功率为71.4%。用硅胶导管取材82例，成功77例，成功率为93.9%，经统计学处理，差异有极显著性(P<0.01)。
2.荧光原位杂交技术用于胎儿细胞诊断的准确率:42例冲洗宫腔收集的细胞用双色X/Y计数探针杂交，在1个细胞内出现桔红色-绿色荧光信号为男性胚胎(图1)；出现两个桔红色荧光信号为女性胚胎(图2)。荧光原位杂交结果与绒毛核型分析性别鉴定进行对照。42例荧光原位杂交结果有27例为男性胚胎，15例女性胚胎；绒毛核型分析结果有29例为男性胚胎，13例为女性胚胎。用荧光原位杂交技术诊断胎儿性别的灵敏度为93.1%，假阴性率为6.8%，诊断符合率为95.2%。在男性胚胎的标本中出现桔红色-绿色荧光杂交信号的细胞比例为3%～100%。
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图1 X/Y计数探针荧光原位杂交技术检测男性
胚胎滋养细胞呈桔红色-绿色XY荧光信号。三带通滤光片×1000
图2 X/Y计数探针荧光原位杂交技术检测女性胚胎
滋养细胞呈两个桔红色XX荧光信号。三带通滤光片×1000
三、讨论
, 百拇医药
滋养细胞是否可以脱落进入宫腔及宫颈，一直存在着争议。随着现代分子生物学技术的发展，越来越多的学者都证实它的存在。利用这种细胞进行遗传病的产前诊断是遗传及优生工作者普遍关心的问题。
本研究用宫腔冲洗液收集滋养细胞的方法，共取材110例，回收到含有滋养细胞的冲洗液97份，后期取材成功率为93.3%。后期所用8号硅胶导管较细，直径为3 mm左右，其顶端是盲端，在其两侧的不同高度分别有两个小孔，当缓慢注入液体后，松开注射器，将导管的注射器端低于宫腔的高度，依靠虹吸原理或用注射器轻轻回吸，冲洗液就可以缓慢流入注射器内。
经宫颈冲洗宫腔收集滋养细胞后对胚胎及孕妇是否有影响，目前还没有此方面的研究，我们曾对1例妊娠50天的孕妇行宫腔冲洗，2周后才进行人工流产，在这2周期间未出现阴道流血、发热及流产现象。
1986年Gremer等[2]证实了荧光原位杂交技术应用于间期细胞核检测染色体非整倍体异常的可行性。我们用双色X/Y计数探针对42例冲洗宫腔收集的胎儿细胞进行荧光原位杂交，诊断胚胎的性别，诊断胚胎性别符合率为95.2%，29例男性胚胎中出现两例假阴性，分析其原因可能在处理标本过程中，造成为数不多的滋养细胞的丢失。用双色X/Y计数探针进行荧光原位杂交的优点是：(1)可以进行胚胎性别的诊断。(2)可以诊断X、Y染色体的非整倍体的异常，如47，XXY、45，XO等。(3)可以估计母体细胞污染情况。目前，各种方法收集的胎儿细胞或多或少都含有母体细胞，用双色X/Y计数探针的荧光原位杂交技术，母体细胞呈XX荧光信号，对于男性胚胎的细胞呈XY荧光信号，这样就可以估计母体细胞的污染情况。(4)不必担心精子细胞的污染，因精子细胞染色体是单倍体。冲洗宫腔收集的滋养细胞在所有收集细胞占多大比例，目前没有一致意见，这与宫腔冲洗方法、操作熟练程度、处理细胞的方法以及检测方法、荧光原位杂交探针的选择不同而有所不同。Ishai等[3]用X/Y染色体探针荧光原位杂交技术检测16例宫腔冲洗液中收集的滋养细胞，滋养细胞占收集细胞的92.0%～96.0%。Drayri等[4]在宫腔冲洗液中收集的细胞，出现XY荧光信号的比例为3.6%～47.8%。我们收集的标本中，男性胚胎出现XY荧光信号占3.0%～100.0%。
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随着各种探针的不断涌现和经宫颈收集细胞的技术不断提高，荧光原位杂交技术和经宫颈收集滋养细胞的联合检测，为孕早期性连锁疾病的性别和性染色体非整倍体异常的产前基因诊断，开拓了一条新途径。
参考文献
1 赵林淑，胡静，黄冰玉. 应用宫腔冲洗滋养细胞行产前诊断. 中华妇产科杂志，1997，32：55-56.
2 Gremer T，Lundegen J，Bruckner A，et al.Detection of chromosome aberration in the human interfuase nucleus by visualization of specific target DNAs with radioactive and nonradioactive in situ hybridization techniques:diagnosis of trisomy18 with probe L184. Hum Genet, 1986,74:346-352.
, 百拇医药
3 Ishai D, Amiel A, Diukman R, et al. Uterine cavity lavage: Adding FISH to conventional cytogentics for embryonic sexing and diagnosing common chromosomal aberrations. Prenatal Diagnosis. 1995,15:961-965.
4 Drayri YP, Penna LK, Patton MA, et al.Detection of cells of fetal origin from transcervical irrigations. Prenatal Diagnosis, 1997, 17: 243-248.
(收稿：1998-08-19 修回：1999-06-11), 百拇医药