耐药相关基因在卵巢癌组织中的表达及其临床意义
作者：程国钧 祝华 孙丽亚 李亚里 李春海 杨秀玉
单位：程国钧(100853 北京，解放军总医院妇产科)；祝华(100853 北京，解放军总医院妇产科)；李亚里(100853 北京，解放军总医院妇产科)；孙丽亚(军事医学科学院)；李春海(军事医学科学院)；杨秀玉(中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院妇产科)
关键词：卵巢肿瘤；基因；MDR；多药耐药相关蛋白；谷胱甘肽转移酶
中华妇产科杂志000207 摘 要：目的 通过测定多药耐药基因(MDR1)、多药耐药相关蛋白(MRP)、肺耐药相关蛋白(LRP)和谷胱甘肽S-转移酶(GST-π)在卵巢癌组织中的表达，了解其在卵巢癌化学治疗耐药中的作用。方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定了41例卵巢癌、25例良性卵巢肿瘤和12例正常卵巢组织中MDR1、MRP、 LRP和GST-π的表达，并分析其与临床、病理特征的关系。结果 (1)在正常卵巢、良性卵巢肿瘤和卵巢癌组织中，MDR1的阳性表达率分别为0.0%、0.0%和29.3%；MRP阳性表达率分别为16.7%、12.0%和53.7%；LRP阳性表达率分别为25.0%、52.0% 和87.8%；GST-π阳性表达率分别为8.3%、12.0%和51.2%。上述4项指标在卵巢癌组织中的表达均明显高于正常卵巢和良性卵巢肿瘤组织(P<0.05)。 (2) 耐药基因在卵巢癌组织中的共同表达现象明显多于良性卵巢肿瘤和正常卵巢(P<0.05)。(3) 临床Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌组织中，MDR1和MRP的阳性表达率分别为33.3%和60.6%，高于临床Ⅰ～Ⅱ期(Ⅰ期8例中1例，Ⅱ期8例中2例)，但差异无显著性(P>0.05)。不同期别的卵巢癌组织中LRP和GST-π的阳性表达率相近(P>0.05)。 (4)MDR1、MRP、LRP和GST-π的表达与肿瘤病理类型无关(P>0.05)。 (5) 低分化卵巢癌组织中MDR1和MRP的阳性表达率分别为50.0%和72.7%，明显高于中、高分化卵巢癌的5.3%和31.6%(P<0.01)，而LRP和GST-π在低分化卵巢癌组织中的阳性表达率分别为90.9%和59.1%，与中、高分化卵巢癌的84.2%和42.1%比较，差异无显著性(P>0.05)。 (6) 化疗疗效不佳者的耐药基因共同表达现象普遍，MDR1和MRP的阳性表达率在化疗无效者中分别为50.0%和83.3%，明显高于化疗有效者的7.1%和28.6%(P<0.05)。结论 耐药相关基因在卵巢癌组织中的表达高于良性卵巢肿瘤和正常卵巢组织，共同表达现象普遍，化疗耐药与MDR1和MRP阳性表达的关系较大。
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The Expression of Multiple Drug Resistance Associated Genes in Ovarian Cancer
CHENG Guojun ZHU Hua SUN Liya et al
(Department of Obstetrics and Gynecology，Chinese People′s Liberation Army General Hospital, Beijing 100853, China)
Abstract：Objective The aim of the investigation was to find out the relationship between the expression of multidrug resistance gene (MDR1), multidrug resistance protein (MRP), lung resistance protein (LRP) and glutathione S-transferase pi(GST-π) with the clinical pathological characteristics and the prognosis in the ovarian cancer patients who never received chemotherapy before operation. Methods The expression of MDR1, MRP, LRP and GST-π in 41 cases of ovarian cancer, 25 cases of benign ovarian tumor and 12 normal ovary tissue were investigated by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR). Results In normal ovary, benign tumor and ovarian cancer, the positive expression of MDR1 was 0.0%, 0.0% and 29.3%, the positive of MRP was 16.7%、12.0% and 53.7%, the positive of LRP was 25.0%、52.0% and 87.8%, the positive of GST-π was 8.3%、12.0% and 51.2% respectively. The ratios of co-expression of multiple genes in ovarian cancer were much higher than that in benign ovarian tumor. All tested genes showed no significant relationship to the clinical stage, histological type and the differentiation of the tumor except that the expression of MDR1 and MRP was closely related to the differentiation (P<0.05). The non-responders to platinum or taxol based combination chemotherapy exhibited higher ratios of MDR1 and MRP expression than the responders (P<0.05). Furthermore, the co-expression phenomenon was more common in non-responders. Conclusions Multiple gene expression is involved in drug resistance in ovarian cancer. The co-expression of MDR1, MRP, LRP and GST-πis higher in ovarian cancer than that in benign ovarian tumor and normal ovary tissue. The expression of MDR1 and MRP is closely related to the tumor differentiation and the response to chemotherapy.
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Key words：Ovarian neoplasms； Genes, MDR； Multidrug resistance associated protein； Glutathione transferases▲
对化学治疗(化疗)耐药是卵巢癌治疗失败的主要原因之一。国内外研究表明，肿瘤耐药涉及细胞内药物浓度降低、药物靶分子改变、代谢解毒、DNA损伤修复功能增强等多种机理，与多种耐药相关基因有关[1]。本研究采用定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，同时测定了多药耐药基因(MDR1)、多药耐药相关蛋白(MRP)、肺耐药相关蛋白(LRP)和谷胱甘肽S-转移酶(GST-π)等多个耐药相关基因在卵巢肿瘤组织中的表达, 以了解其意义。
资料与方法
一、研究对象
选自1995年1月至1997年12月间，在解放军总医院妇产科住院进行手术治疗的患者共78例，其标本均经病理检查证实。其中卵巢良性肿瘤25例；卵巢癌41例；另取正常卵巢12例(因妇科良性疾病手术切除)作为对照。卵巢良性肿瘤包括浆液性上皮瘤10例，粘液性上皮瘤7例，成熟畸胎瘤6例，良性Berner瘤1例，卵巢冠囊肿1例。卵巢癌包括浆液性乳头状囊腺癌(浆液癌)20例，粘液性乳头状囊腺癌(粘液癌)5例，透明细胞癌7例，子宫内膜样癌2例，未分化腺癌6例，内胚窦瘤1例。其中，临床Ⅰ期3例，Ⅱ期5例，Ⅲ期30例，Ⅳ期3例，36例在术后1周内开始化疗，共接受了6～13个疗程的化疗，方案以PAC(顺铂，阿霉素，环磷酰胺)或泰素加PC(顺铂，环磷酰胺)方案为主。
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二、方法
1.标本收集：手术切除后1 h内，将标本置于液氮保存。所有病例在手术前均未接受化疗。
2.引物设计：根据从Genbank中查到的各基因序列设计聚合酶链反应(PCR)引物，分别为MDR1：5′GTACCCATCATTGCAATAGC3′，5′CAAACTTCTGCT- CCTGAGTC3′；GST-π：5′CAGGAGGGCTCACTCAAA- G3′，5′GATCAGCAGCAAGTCCAGCAG3′； MRP：5′ATGGACTACACAAGGGTGATCG3′，5′TCCGCATCTCT- GTCTCTCC3′；LRP：5′GAGCAGTTCACAGTGTTGT- CC3′，5′AAAGCCAAAGACAGCAGTGCG； 内参基因肌动蛋白(β-actin)：5′ACACTGTGCCCATCTACGAGG3′，5′AGGGGCCGGACTCGTCATACT3′。 MDR1、GST-π、MRP、LRP和β-actin的扩增片段的长度分别为167bp、350bp、337bp、342bp和240bp。
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3.RNA提取：参照TRIzol试剂盒(美国GIBCO BRL公司产品)说明书进行。
4.逆转录(RT)合成cDNA：将RNA稀释为1 μg/μl。取5 μl RNA加5×RT buffer 4 μl， dNTP(2 mmol/L) 1 μl, Oligo(dT) (100 μg/μl) 2 μl, 三蒸水 3 μl, 65℃水浴变性5 min，加RNasin(20 U/μl)0.5 μl, AMV(10 U/μl)1 μl (均为美国Promega公司产品)。 42℃水浴60 min。95℃ 5 min灭活AMV。
5.PCR扩增及电泳：(1)扩增体系：10×buffer 1 μl, dNTP (2 mmol/L) 1 μl, 引物(5 μmol/L)各1 μl, 甲酰胺5 μl ，cDNA100 ng, Tag DNA聚合酶(4 μg/μl) 0.3 μl，加三蒸水补充体积至10 μl。94℃变性5 min后进入循环，94℃变性30 s，55℃ 退火30 s, 72℃延伸1 min, 30个循环后72℃10 min。PCR对照：每次PCR均设立阴性对照(加1 μl H2O代替cDNA)和阳性对照(分别加1 μl含MDR1、MRP、GST-π、LRP或β-actin靶片段的重组质粒)。在80V电压下，2%琼脂糖凝胶电泳1 h，紫外光下检查有无特异条带。
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6.PCR产物定量分析：PCR产物经KODAK数字成像系统照相，采用ID软件分析条带吸光度值。
7. 耐药判断标准：手术后1周内，开始接受正规化疗，至少6个疗程。每个疗程开始前，均行妇科检查和B超、X线胸片、血清CA125等检查。在手术后1年内，如出现肿瘤复发、肿瘤体积增大25%或CA125逐渐上升，则视为耐药。
三、统计学处理
以SPSS软件进行χ2检验。
结果
一、耐药基因的表达
在正常卵巢、良性卵巢肿瘤和卵巢癌组织中，MDR1的阳性表达分别为0.0%、0.0%和29.3%；GST-π阳性表达率分别为8.3%、12.0%和51.2%；MRP阳性表达率分别为16.7%、12.0%和53.7%；LRP阳性表达率分别为25.0%、52.0% 和87.8%。卵巢癌组织中上述4项指标均明显高于正常卵巢和良性卵巢肿瘤(P<0.05)，而正常卵巢和良性卵巢肿瘤比较，差异无显著性(P>0.05)。
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二、耐药基因表达与临床病理特征
1. 耐药基因表达与临床分期：41例卵巢癌中，临床Ⅰ期3例，Ⅱ期5例，Ⅲ期30例，Ⅳ期3例。Ⅲ～Ⅳ期的GST-π和LRP阳性表达率分别为48.5%和87.9%, 与临床Ⅰ～Ⅱ期很相近(P>0.05)。Ⅲ～Ⅳ期的MDR1和MRP的阳性率分别为33.3%和60.6%，明显高于Ⅰ～Ⅱ期(Ⅰ期8例中1例，Ⅱ期8例中2例)，但由于Ⅰ～Ⅱ期的例数较少，两者比较，差异无显著性(P>0.05)。
2.耐药基因表达与病理：耐药基因表达与病理类型和病理分化程度的关系见表1。卵巢浆液癌的MDR1阳性表达率低于其他类型卵巢癌，但仅与透明细胞癌比较，差异有显著性(P<0.05)，其他各型卵巢癌的各耐药基因的阳性表达率比较，差异均无显著性(P>0.05)。低分化卵巢癌的MDR1和MRP的阳性表达率分别为50.0%和72.7%，明显高于中、高分化卵巢癌的5.3%和31.6%(P<0.01)，而低分化与中、高分化卵巢癌的GST-π和LRP的阳性表达率比较，差异均无显著性(P>0.05)。
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表1 不同病理特征卵巢癌耐药基因阳性表达情况 类别
总
例数
MDR1
GST-π
MRP
LRP
例
数
百分率
(%)
例
数
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百分率
(%)
例
数
百分率
(%)
例
数
百分率
(%)
病理类型
浆液癌
20
3
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15.0
9
45.0
10
50.0
16
80.0
粘液癌
5
2
2/5*
4
4/5*
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3
3/5*
5
5/5*
透明细胞癌
7
4
4/7*
6
6/7*
3
3/7*
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7
7/7*
病理分化程度
低分化
22
11
50.0
13
59.1
16
72.7
20
90.9
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中、高分化
19
1
5.3
8
42.1
6
31.6
16
84.2
*例数少于10，不计百分率 三、耐药基因表达、共同表达与化疗耐药
1.耐药基因的表达与共同表达：22例表达MRP患者中，共同表达LRP、GST-π和MDR1者分别为95.5%、59.1%和36.4%；21例表达GST-π患者中，共同表达MDR1、MRP和LRP者分别为85.7%、61.9%和57.1%；35例表达LRP患者中，共同表达MRP、GST-π和MDR1者分别为60.0%、34.3%和31.4%；12例表达MDR1患者中，共同表达MRP、LRP和GST-π者分别为91.6%、91.6%和66.7%。
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2.耐药基因表达与化疗耐药：36例接受化疗者中，术后1年，20例无肿瘤复发，16例有肿瘤复发或CA125回升。其中临床Ⅲ期接受化疗者26例，14例化疗有效，12例化疗耐药，两者的年龄、病理类型、病理分化程度、手术切除程度、化疗方案以及疗程数比较均无明显差异。14例化疗有效者的MDR1、GST-π、MRP 和LRP的阳性表达率分别为7.1%、35.7%、28.6%和78.6%，12例化疗无效者的阳性表达率分别为50.0%、58.3%、83.3%和100.0%，化疗有效者和化疗无效者的耐药基因的阳性表达率比较，仅MDR1和MRP的差异有显著性(P<0.05)。
3.耐药基因共同表达与化疗耐药：正常卵巢和良性卵巢肿瘤组织中LRP和MRP共同表达分别为2.7%和8.1%, 无其他耐药基因共同表达，而卵巢癌组织中耐药基因的共同表达明显增加，见表2。卵巢癌组织中各类耐药基因共同表达均明显高于良性卵巢肿瘤和正常卵巢组织(P<0.05)。36例化疗患者的耐药基因共同表达情况与化疗疗效的关系，见表3。16例化疗无效者的耐药基因共同表达率明显高于20例化疗有效者，特别是有MRP和LRP共同表达者疗效较差。
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表2 MDR1、GST-π、MRP和LRP
在卵巢癌组织中的共同表达情况 共同表达类型
卵巢癌(41例)
例数
百分率(%)
MDR1与GST-π
8
19.5
MDR1与MRP
11
26.8
MDR1与LRP
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11
26.8
GST-π与MRP
13
31.7
GST-π与LRP
12
29.3
MRP与LRP
21
51.2
MDR1、GST-π与MRP
7
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17.1
MDR1、GST-π与LRP
8
19.5
MDR1、MRP与LRP
10
24.4
GST-π、MRP与LRP
13
31.7
MDR1、GST-π、MRP与LRP
7
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17.1
表3 MDR1、GST-π、MRP和LRP共同表达与化疗疗效的关系 共同表达类型
化疗有效(20例)
化疗无效(16例)
例数
百分率
(%)
例数
百分率(%)
MDR1与GST-π
2
10.0
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4
25.0
MDR1与MRP
1
5.0
6
37.0*
MDR1与LRP
2
10.0
6
37.0*
GST-π与MRP
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2
10.0
8
50.0**
GST-π与LRP
9
45.0
8
50.0
MRP与LRP
5
25.0
12
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75.0**
MDR1、GST-π与MRP
1
5.0
4
25.0
MDR1、GST-π与LRP
2
10.0
4
25.0
MDR1、MRP与LRP
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1
5.0
6
37.0**
GST-π、MRP与LRP
2
10.0
8
50.0**
MDR1、GST-π、MRP与LRP
1
5.0
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4
25.0
注：与化疗有效者比较，* P<0.05 ** P<0.01
讨论
肿瘤耐药是多基因参与的结果，了解耐药基因的表达，对于选择合适的治疗方案、判断预后和寻找有效的逆转肿瘤耐药的方法都是有益的[1]。
一、化疗耐药与MDR1表达的关系
MDR1是第1个确定的多药耐药相关基因，基因编码了相对分子质量为170 000的P-糖蛋白(P-gp)。以往的研究表明，P-gp在卵巢癌组织中的阳性表达率为15%～40%，接受化疗者或复发者的阳性表达率增加。但P-gp表达与肿瘤的病理类型和预后的关系尚存有争议[2，3]。本研究中，41例卵巢癌的MDR1阳性率为29.3%，而12例正常卵巢和25例良性卵巢肿瘤均无MDR1表达。低分化肿瘤的MDR1阳性率为50.0%，显著高于中、高分化肿瘤的5.3%(P<0.01)。提示低分化肿瘤存在原发耐药倾向,MDR1阳性患者的化疗疗效较差。MDR1阳性表达与临床期别、病理类型和化疗疗效也有关，但由于例数较少，差异无显著性(P>0.05)。
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二、化疗耐药与MRP和LRP表达的关系
MRP和LRP则是近年发现的与药物转运有关的耐药相关蛋白。MRP和P-gp同属ATP依赖性跨膜转运蛋白，LRP则是通过对核孔的调节来改变细胞核和细胞浆间的物质转运[5]。Kavallaris等[4]采用RT-PCR测定了53例初治卵巢癌的MDR1和MRP表达，结果36.0%表达MDR1，但表达量较低，而所有患者均表达MRP，其中92.0%卵巢癌患者的MRP表达量高于正常卵巢组织，但未证实MRP表达与预后有关。Izquierdo等[5]采用免疫组化法测定了57例临床Ⅲ～Ⅳ期的卵巢癌组织，患者在细胞减灭术后均接受了以铂类和烷化剂为主的化疗，结果发现，P-gp、MRP和LRP的阳性表达率分别为16.0%、68.0%和77.0%，P-gp和MRP阳性表达率与化疗疗效和生存期无关，而LRP阳性表达者的化疗疗效差、复发快、生存期短(P<0.05)。本研究中，MRP和LRP在正常卵巢组织中的阳性表达率分别为16.7%和25.0%，在良性卵巢肿瘤组织中分别为12.0%和52.0%，明显低于卵巢癌组织中的53.7%和87.8%(P<0.05)。MRP的表达与临床期别、病理分化程度和化疗疗效均有关，而LRP和临床期别、病理类型、病理分化程度和化疗疗效均无关。
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三、化疗耐药与GST-π表达的关系
谷胱甘肽S-转移酶(GST-s)是一组具有多种生理功能的蛋白质超基因家族，与肿瘤多药耐药关系最密切的是GST-π。但不同学者对GST-π 与卵巢癌耐药关系的研究结果存在较大分歧[6]。卞丽红等[7] 采用免疫组化法研究发现，在正常卵巢、良性卵巢肿瘤和卵巢癌组织中，GST-π的阳性表达率分别为0.0%、 4.0%和78.0%。GST-π表达与临床分期有关，而与肿瘤分化程度无关。本研究中，GST-π在正常卵巢、良性卵巢肿瘤和卵巢癌组织中的阳性表达率分别为8.3%、12.0%和51.2%，卵巢癌组织的表达水平明显上升。
四、耐药基因共同表达与化疗耐药的关系
由于肿瘤耐药涉及多个基因，因此，同时检测多个基因的表达能更好地判断预后。本研究中，卵巢癌组织中耐药基因共同表达现象较多，而正常卵巢和良性卵巢肿瘤组织中耐药基因共同表达现象很少。分析耐药基因表达与化疗的关系，如果以单个基因比较，仅MDR1和MRP的表达与化疗疗效有关；而如果以多基因共同表达比较，则可见化疗无效者有多种耐药基因的共同表达。因此，同时检测多个耐药基因要比仅检测单个基因的意义更大。对于耐药基因共同表达的调节机理尚需进一步研究。
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参考文献：
[1]Sood AK, Buller RE. Drug resistance in ovarian cancer: from the laboratory to the clinic. Obstet Gynecol，1998，92:312-319.
[2]Khalifa MA, Abdoh AA, Mannel RS, et al. P-glycoprotein as a prognostic indictor in prechemotherapy and postchemotherapy ovarian adenocarcinoma. Int J Gynecol Pathol，1997，16:69-75.
[3]朱玲，郎景和，沈铿，等. MDR1基因表达与卵巢癌耐药关系的研 究.中华妇产科杂志, 1997, 32：462-466.
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[4]Kavallaris M, Leary JA, Barrett JA, et al. MDR1 and MRP gene expression in epithelial ovarian tumors.Cancer Letter, 1996,102:7-16.
[5]Izquierdo MA, Van Zee AG. Drug resistance-associated marker LRP for prediction of response to chemotherapy and prognoses in advanced ovarian carcinoma. J Natel Cancer Inst, 1995, 87: 1230-1237.
[6]李春海. 谷胱甘肽S-转移酶超基因家族在癌变中的作用. 见:李春海, 郭亚军,主编. 肿瘤分子生物学研究进展. 北京: 军事医学科学出版社, 1996.103-116.
[7]卞丽红, 李春海, 傅才英, 等. GSTs同工酶在卵巢癌组织中表达和分布的研究. 见:李春海，陆士新,主编. 肿瘤生物学研究进展. 北京:军事医学科学出版社, 1997.115-119.
收稿日期：1999-07-14, http://www.100md.com
单位：程国钧(100853 北京，解放军总医院妇产科)；祝华(100853 北京，解放军总医院妇产科)；李亚里(100853 北京，解放军总医院妇产科)；孙丽亚(军事医学科学院)；李春海(军事医学科学院)；杨秀玉(中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院妇产科)
关键词：卵巢肿瘤；基因；MDR；多药耐药相关蛋白；谷胱甘肽转移酶
中华妇产科杂志000207 摘 要：目的 通过测定多药耐药基因(MDR1)、多药耐药相关蛋白(MRP)、肺耐药相关蛋白(LRP)和谷胱甘肽S-转移酶(GST-π)在卵巢癌组织中的表达，了解其在卵巢癌化学治疗耐药中的作用。方法 采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)测定了41例卵巢癌、25例良性卵巢肿瘤和12例正常卵巢组织中MDR1、MRP、 LRP和GST-π的表达，并分析其与临床、病理特征的关系。结果 (1)在正常卵巢、良性卵巢肿瘤和卵巢癌组织中，MDR1的阳性表达率分别为0.0%、0.0%和29.3%；MRP阳性表达率分别为16.7%、12.0%和53.7%；LRP阳性表达率分别为25.0%、52.0% 和87.8%；GST-π阳性表达率分别为8.3%、12.0%和51.2%。上述4项指标在卵巢癌组织中的表达均明显高于正常卵巢和良性卵巢肿瘤组织(P<0.05)。 (2) 耐药基因在卵巢癌组织中的共同表达现象明显多于良性卵巢肿瘤和正常卵巢(P<0.05)。(3) 临床Ⅲ～Ⅳ期卵巢癌组织中，MDR1和MRP的阳性表达率分别为33.3%和60.6%，高于临床Ⅰ～Ⅱ期(Ⅰ期8例中1例，Ⅱ期8例中2例)，但差异无显著性(P>0.05)。不同期别的卵巢癌组织中LRP和GST-π的阳性表达率相近(P>0.05)。 (4)MDR1、MRP、LRP和GST-π的表达与肿瘤病理类型无关(P>0.05)。 (5) 低分化卵巢癌组织中MDR1和MRP的阳性表达率分别为50.0%和72.7%，明显高于中、高分化卵巢癌的5.3%和31.6%(P<0.01)，而LRP和GST-π在低分化卵巢癌组织中的阳性表达率分别为90.9%和59.1%，与中、高分化卵巢癌的84.2%和42.1%比较，差异无显著性(P>0.05)。 (6) 化疗疗效不佳者的耐药基因共同表达现象普遍，MDR1和MRP的阳性表达率在化疗无效者中分别为50.0%和83.3%，明显高于化疗有效者的7.1%和28.6%(P<0.05)。结论 耐药相关基因在卵巢癌组织中的表达高于良性卵巢肿瘤和正常卵巢组织，共同表达现象普遍，化疗耐药与MDR1和MRP阳性表达的关系较大。
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The Expression of Multiple Drug Resistance Associated Genes in Ovarian Cancer
CHENG Guojun ZHU Hua SUN Liya et al
(Department of Obstetrics and Gynecology，Chinese People′s Liberation Army General Hospital, Beijing 100853, China)
Abstract：Objective The aim of the investigation was to find out the relationship between the expression of multidrug resistance gene (MDR1), multidrug resistance protein (MRP), lung resistance protein (LRP) and glutathione S-transferase pi(GST-π) with the clinical pathological characteristics and the prognosis in the ovarian cancer patients who never received chemotherapy before operation. Methods The expression of MDR1, MRP, LRP and GST-π in 41 cases of ovarian cancer, 25 cases of benign ovarian tumor and 12 normal ovary tissue were investigated by reverse transcription-polymerase chain reaction(RT-PCR). Results In normal ovary, benign tumor and ovarian cancer, the positive expression of MDR1 was 0.0%, 0.0% and 29.3%, the positive of MRP was 16.7%、12.0% and 53.7%, the positive of LRP was 25.0%、52.0% and 87.8%, the positive of GST-π was 8.3%、12.0% and 51.2% respectively. The ratios of co-expression of multiple genes in ovarian cancer were much higher than that in benign ovarian tumor. All tested genes showed no significant relationship to the clinical stage, histological type and the differentiation of the tumor except that the expression of MDR1 and MRP was closely related to the differentiation (P<0.05). The non-responders to platinum or taxol based combination chemotherapy exhibited higher ratios of MDR1 and MRP expression than the responders (P<0.05). Furthermore, the co-expression phenomenon was more common in non-responders. Conclusions Multiple gene expression is involved in drug resistance in ovarian cancer. The co-expression of MDR1, MRP, LRP and GST-πis higher in ovarian cancer than that in benign ovarian tumor and normal ovary tissue. The expression of MDR1 and MRP is closely related to the tumor differentiation and the response to chemotherapy.
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Key words：Ovarian neoplasms； Genes, MDR； Multidrug resistance associated protein； Glutathione transferases▲
对化学治疗(化疗)耐药是卵巢癌治疗失败的主要原因之一。国内外研究表明，肿瘤耐药涉及细胞内药物浓度降低、药物靶分子改变、代谢解毒、DNA损伤修复功能增强等多种机理，与多种耐药相关基因有关[1]。本研究采用定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)，同时测定了多药耐药基因(MDR1)、多药耐药相关蛋白(MRP)、肺耐药相关蛋白(LRP)和谷胱甘肽S-转移酶(GST-π)等多个耐药相关基因在卵巢肿瘤组织中的表达, 以了解其意义。
资料与方法
一、研究对象
选自1995年1月至1997年12月间，在解放军总医院妇产科住院进行手术治疗的患者共78例，其标本均经病理检查证实。其中卵巢良性肿瘤25例；卵巢癌41例；另取正常卵巢12例(因妇科良性疾病手术切除)作为对照。卵巢良性肿瘤包括浆液性上皮瘤10例，粘液性上皮瘤7例，成熟畸胎瘤6例，良性Berner瘤1例，卵巢冠囊肿1例。卵巢癌包括浆液性乳头状囊腺癌(浆液癌)20例，粘液性乳头状囊腺癌(粘液癌)5例，透明细胞癌7例，子宫内膜样癌2例，未分化腺癌6例，内胚窦瘤1例。其中，临床Ⅰ期3例，Ⅱ期5例，Ⅲ期30例，Ⅳ期3例，36例在术后1周内开始化疗，共接受了6～13个疗程的化疗，方案以PAC(顺铂，阿霉素，环磷酰胺)或泰素加PC(顺铂，环磷酰胺)方案为主。
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二、方法
1.标本收集：手术切除后1 h内，将标本置于液氮保存。所有病例在手术前均未接受化疗。
2.引物设计：根据从Genbank中查到的各基因序列设计聚合酶链反应(PCR)引物，分别为MDR1：5′GTACCCATCATTGCAATAGC3′，5′CAAACTTCTGCT- CCTGAGTC3′；GST-π：5′CAGGAGGGCTCACTCAAA- G3′，5′GATCAGCAGCAAGTCCAGCAG3′； MRP：5′ATGGACTACACAAGGGTGATCG3′，5′TCCGCATCTCT- GTCTCTCC3′；LRP：5′GAGCAGTTCACAGTGTTGT- CC3′，5′AAAGCCAAAGACAGCAGTGCG； 内参基因肌动蛋白(β-actin)：5′ACACTGTGCCCATCTACGAGG3′，5′AGGGGCCGGACTCGTCATACT3′。 MDR1、GST-π、MRP、LRP和β-actin的扩增片段的长度分别为167bp、350bp、337bp、342bp和240bp。
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3.RNA提取：参照TRIzol试剂盒(美国GIBCO BRL公司产品)说明书进行。
4.逆转录(RT)合成cDNA：将RNA稀释为1 μg/μl。取5 μl RNA加5×RT buffer 4 μl， dNTP(2 mmol/L) 1 μl, Oligo(dT) (100 μg/μl) 2 μl, 三蒸水 3 μl, 65℃水浴变性5 min，加RNasin(20 U/μl)0.5 μl, AMV(10 U/μl)1 μl (均为美国Promega公司产品)。 42℃水浴60 min。95℃ 5 min灭活AMV。
5.PCR扩增及电泳：(1)扩增体系：10×buffer 1 μl, dNTP (2 mmol/L) 1 μl, 引物(5 μmol/L)各1 μl, 甲酰胺5 μl ，cDNA100 ng, Tag DNA聚合酶(4 μg/μl) 0.3 μl，加三蒸水补充体积至10 μl。94℃变性5 min后进入循环，94℃变性30 s，55℃ 退火30 s, 72℃延伸1 min, 30个循环后72℃10 min。PCR对照：每次PCR均设立阴性对照(加1 μl H2O代替cDNA)和阳性对照(分别加1 μl含MDR1、MRP、GST-π、LRP或β-actin靶片段的重组质粒)。在80V电压下，2%琼脂糖凝胶电泳1 h，紫外光下检查有无特异条带。
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6.PCR产物定量分析：PCR产物经KODAK数字成像系统照相，采用ID软件分析条带吸光度值。
7. 耐药判断标准：手术后1周内，开始接受正规化疗，至少6个疗程。每个疗程开始前，均行妇科检查和B超、X线胸片、血清CA125等检查。在手术后1年内，如出现肿瘤复发、肿瘤体积增大25%或CA125逐渐上升，则视为耐药。
三、统计学处理
以SPSS软件进行χ2检验。
结果
一、耐药基因的表达
在正常卵巢、良性卵巢肿瘤和卵巢癌组织中，MDR1的阳性表达分别为0.0%、0.0%和29.3%；GST-π阳性表达率分别为8.3%、12.0%和51.2%；MRP阳性表达率分别为16.7%、12.0%和53.7%；LRP阳性表达率分别为25.0%、52.0% 和87.8%。卵巢癌组织中上述4项指标均明显高于正常卵巢和良性卵巢肿瘤(P<0.05)，而正常卵巢和良性卵巢肿瘤比较，差异无显著性(P>0.05)。
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二、耐药基因表达与临床病理特征
1. 耐药基因表达与临床分期：41例卵巢癌中，临床Ⅰ期3例，Ⅱ期5例，Ⅲ期30例，Ⅳ期3例。Ⅲ～Ⅳ期的GST-π和LRP阳性表达率分别为48.5%和87.9%, 与临床Ⅰ～Ⅱ期很相近(P>0.05)。Ⅲ～Ⅳ期的MDR1和MRP的阳性率分别为33.3%和60.6%，明显高于Ⅰ～Ⅱ期(Ⅰ期8例中1例，Ⅱ期8例中2例)，但由于Ⅰ～Ⅱ期的例数较少，两者比较，差异无显著性(P>0.05)。
2.耐药基因表达与病理：耐药基因表达与病理类型和病理分化程度的关系见表1。卵巢浆液癌的MDR1阳性表达率低于其他类型卵巢癌，但仅与透明细胞癌比较，差异有显著性(P<0.05)，其他各型卵巢癌的各耐药基因的阳性表达率比较，差异均无显著性(P>0.05)。低分化卵巢癌的MDR1和MRP的阳性表达率分别为50.0%和72.7%，明显高于中、高分化卵巢癌的5.3%和31.6%(P<0.01)，而低分化与中、高分化卵巢癌的GST-π和LRP的阳性表达率比较，差异均无显著性(P>0.05)。
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表1 不同病理特征卵巢癌耐药基因阳性表达情况 类别
总
例数
MDR1
GST-π
MRP
LRP
例
数
百分率
(%)
例
数
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百分率
(%)
例
数
百分率
(%)
例
数
百分率
(%)
病理类型
浆液癌
20
3
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15.0
9
45.0
10
50.0
16
80.0
粘液癌
5
2
2/5*
4
4/5*
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3
3/5*
5
5/5*
透明细胞癌
7
4
4/7*
6
6/7*
3
3/7*
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7
7/7*
病理分化程度
低分化
22
11
50.0
13
59.1
16
72.7
20
90.9
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中、高分化
19
1
5.3
8
42.1
6
31.6
16
84.2
*例数少于10，不计百分率 三、耐药基因表达、共同表达与化疗耐药
1.耐药基因的表达与共同表达：22例表达MRP患者中，共同表达LRP、GST-π和MDR1者分别为95.5%、59.1%和36.4%；21例表达GST-π患者中，共同表达MDR1、MRP和LRP者分别为85.7%、61.9%和57.1%；35例表达LRP患者中，共同表达MRP、GST-π和MDR1者分别为60.0%、34.3%和31.4%；12例表达MDR1患者中，共同表达MRP、LRP和GST-π者分别为91.6%、91.6%和66.7%。
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2.耐药基因表达与化疗耐药：36例接受化疗者中，术后1年，20例无肿瘤复发，16例有肿瘤复发或CA125回升。其中临床Ⅲ期接受化疗者26例，14例化疗有效，12例化疗耐药，两者的年龄、病理类型、病理分化程度、手术切除程度、化疗方案以及疗程数比较均无明显差异。14例化疗有效者的MDR1、GST-π、MRP 和LRP的阳性表达率分别为7.1%、35.7%、28.6%和78.6%，12例化疗无效者的阳性表达率分别为50.0%、58.3%、83.3%和100.0%，化疗有效者和化疗无效者的耐药基因的阳性表达率比较，仅MDR1和MRP的差异有显著性(P<0.05)。
3.耐药基因共同表达与化疗耐药：正常卵巢和良性卵巢肿瘤组织中LRP和MRP共同表达分别为2.7%和8.1%, 无其他耐药基因共同表达，而卵巢癌组织中耐药基因的共同表达明显增加，见表2。卵巢癌组织中各类耐药基因共同表达均明显高于良性卵巢肿瘤和正常卵巢组织(P<0.05)。36例化疗患者的耐药基因共同表达情况与化疗疗效的关系，见表3。16例化疗无效者的耐药基因共同表达率明显高于20例化疗有效者，特别是有MRP和LRP共同表达者疗效较差。
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表2 MDR1、GST-π、MRP和LRP
在卵巢癌组织中的共同表达情况 共同表达类型
卵巢癌(41例)
例数
百分率(%)
MDR1与GST-π
8
19.5
MDR1与MRP
11
26.8
MDR1与LRP
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11
26.8
GST-π与MRP
13
31.7
GST-π与LRP
12
29.3
MRP与LRP
21
51.2
MDR1、GST-π与MRP
7
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17.1
MDR1、GST-π与LRP
8
19.5
MDR1、MRP与LRP
10
24.4
GST-π、MRP与LRP
13
31.7
MDR1、GST-π、MRP与LRP
7
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17.1
表3 MDR1、GST-π、MRP和LRP共同表达与化疗疗效的关系 共同表达类型
化疗有效(20例)
化疗无效(16例)
例数
百分率
(%)
例数
百分率(%)
MDR1与GST-π
2
10.0
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4
25.0
MDR1与MRP
1
5.0
6
37.0*
MDR1与LRP
2
10.0
6
37.0*
GST-π与MRP
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2
10.0
8
50.0**
GST-π与LRP
9
45.0
8
50.0
MRP与LRP
5
25.0
12
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75.0**
MDR1、GST-π与MRP
1
5.0
4
25.0
MDR1、GST-π与LRP
2
10.0
4
25.0
MDR1、MRP与LRP
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1
5.0
6
37.0**
GST-π、MRP与LRP
2
10.0
8
50.0**
MDR1、GST-π、MRP与LRP
1
5.0
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4
25.0
注：与化疗有效者比较，* P<0.05 ** P<0.01
讨论
肿瘤耐药是多基因参与的结果，了解耐药基因的表达，对于选择合适的治疗方案、判断预后和寻找有效的逆转肿瘤耐药的方法都是有益的[1]。
一、化疗耐药与MDR1表达的关系
MDR1是第1个确定的多药耐药相关基因，基因编码了相对分子质量为170 000的P-糖蛋白(P-gp)。以往的研究表明，P-gp在卵巢癌组织中的阳性表达率为15%～40%，接受化疗者或复发者的阳性表达率增加。但P-gp表达与肿瘤的病理类型和预后的关系尚存有争议[2，3]。本研究中，41例卵巢癌的MDR1阳性率为29.3%，而12例正常卵巢和25例良性卵巢肿瘤均无MDR1表达。低分化肿瘤的MDR1阳性率为50.0%，显著高于中、高分化肿瘤的5.3%(P<0.01)。提示低分化肿瘤存在原发耐药倾向,MDR1阳性患者的化疗疗效较差。MDR1阳性表达与临床期别、病理类型和化疗疗效也有关，但由于例数较少，差异无显著性(P>0.05)。
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二、化疗耐药与MRP和LRP表达的关系
MRP和LRP则是近年发现的与药物转运有关的耐药相关蛋白。MRP和P-gp同属ATP依赖性跨膜转运蛋白，LRP则是通过对核孔的调节来改变细胞核和细胞浆间的物质转运[5]。Kavallaris等[4]采用RT-PCR测定了53例初治卵巢癌的MDR1和MRP表达，结果36.0%表达MDR1，但表达量较低，而所有患者均表达MRP，其中92.0%卵巢癌患者的MRP表达量高于正常卵巢组织，但未证实MRP表达与预后有关。Izquierdo等[5]采用免疫组化法测定了57例临床Ⅲ～Ⅳ期的卵巢癌组织，患者在细胞减灭术后均接受了以铂类和烷化剂为主的化疗，结果发现，P-gp、MRP和LRP的阳性表达率分别为16.0%、68.0%和77.0%，P-gp和MRP阳性表达率与化疗疗效和生存期无关，而LRP阳性表达者的化疗疗效差、复发快、生存期短(P<0.05)。本研究中，MRP和LRP在正常卵巢组织中的阳性表达率分别为16.7%和25.0%，在良性卵巢肿瘤组织中分别为12.0%和52.0%，明显低于卵巢癌组织中的53.7%和87.8%(P<0.05)。MRP的表达与临床期别、病理分化程度和化疗疗效均有关，而LRP和临床期别、病理类型、病理分化程度和化疗疗效均无关。
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三、化疗耐药与GST-π表达的关系
谷胱甘肽S-转移酶(GST-s)是一组具有多种生理功能的蛋白质超基因家族，与肿瘤多药耐药关系最密切的是GST-π。但不同学者对GST-π 与卵巢癌耐药关系的研究结果存在较大分歧[6]。卞丽红等[7] 采用免疫组化法研究发现，在正常卵巢、良性卵巢肿瘤和卵巢癌组织中，GST-π的阳性表达率分别为0.0%、 4.0%和78.0%。GST-π表达与临床分期有关，而与肿瘤分化程度无关。本研究中，GST-π在正常卵巢、良性卵巢肿瘤和卵巢癌组织中的阳性表达率分别为8.3%、12.0%和51.2%，卵巢癌组织的表达水平明显上升。
四、耐药基因共同表达与化疗耐药的关系
由于肿瘤耐药涉及多个基因，因此，同时检测多个基因的表达能更好地判断预后。本研究中，卵巢癌组织中耐药基因共同表达现象较多，而正常卵巢和良性卵巢肿瘤组织中耐药基因共同表达现象很少。分析耐药基因表达与化疗的关系，如果以单个基因比较，仅MDR1和MRP的表达与化疗疗效有关；而如果以多基因共同表达比较，则可见化疗无效者有多种耐药基因的共同表达。因此，同时检测多个耐药基因要比仅检测单个基因的意义更大。对于耐药基因共同表达的调节机理尚需进一步研究。
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参考文献：
[1]Sood AK, Buller RE. Drug resistance in ovarian cancer: from the laboratory to the clinic. Obstet Gynecol，1998，92:312-319.
[2]Khalifa MA, Abdoh AA, Mannel RS, et al. P-glycoprotein as a prognostic indictor in prechemotherapy and postchemotherapy ovarian adenocarcinoma. Int J Gynecol Pathol，1997，16:69-75.
[3]朱玲，郎景和，沈铿，等. MDR1基因表达与卵巢癌耐药关系的研 究.中华妇产科杂志, 1997, 32：462-466.
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[4]Kavallaris M, Leary JA, Barrett JA, et al. MDR1 and MRP gene expression in epithelial ovarian tumors.Cancer Letter, 1996,102:7-16.
[5]Izquierdo MA, Van Zee AG. Drug resistance-associated marker LRP for prediction of response to chemotherapy and prognoses in advanced ovarian carcinoma. J Natel Cancer Inst, 1995, 87: 1230-1237.
[6]李春海. 谷胱甘肽S-转移酶超基因家族在癌变中的作用. 见:李春海, 郭亚军,主编. 肿瘤分子生物学研究进展. 北京: 军事医学科学出版社, 1996.103-116.
[7]卞丽红, 李春海, 傅才英, 等. GSTs同工酶在卵巢癌组织中表达和分布的研究. 见:李春海，陆士新,主编. 肿瘤生物学研究进展. 北京:军事医学科学出版社, 1997.115-119.
收稿日期：1999-07-14, http://www.100md.com