喉鳞癌组织中RB1.20座位杂合性丢失和p110RB1蛋白表达的检测
作者：白素娟 费声重 张学 王筠 孙开来
单位：110003 沈阳 中国医科大学第二临床学院耳鼻咽喉科(白素娟);第一临床学院耳鼻咽喉科(费声重);基础医学院分子遗传室(张学、王筠、孙开来)
关键词：喉肿瘤；基因；抑制；肿瘤；杂合子检测；聚合酶链反应
中华耳鼻咽喉科杂志980214 【摘要】 目的 探讨喉鳞状细胞癌组织中RB1基因在喉癌发生发展中的意义,为发现和定位新的抑癌基因提供线索和依据。方法 应用聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR),选择13号染色体上RB1.20座位的微卫星多态标记,对58例喉鳞状细胞癌组织进行杂合性丢失(loss of heterozygosity , LOH)分析和p110RB1蛋白表达的检测。结果 3例原位癌中均无RB1.20座位杂合性丢失，55例浸润癌中45例可提供信息,杂合性丢失的频率为40% (18/45), 41例中仅有8例RB蛋白表达缺失,其中6例伴有RB1.20座位的杂合性丢失。结论RB1基因在部分喉癌中发生失活;在RB1.20座位附近可能还存在与喉癌发生发展密切相关的抑癌基因。
, 百拇医药
Loss of heterozygosity on chromosome RB1.20 locus and p110RB1 protein
state in squmous cell carcinomas of larynx
Bai Sujuan, Fei Shengzhong, Zhang Xue, et al.*Second Clinical College,China Medical University, Shenyang 110003
【Abstract】 Objective To study the RB1 gene in squamous cell carcinoma of larynx(LSCC) and to find clue for discovering and locating new suppressor gene. Methods Loss of heterozygosity (LOH) of microsatellite polymorphic sequence on chromosomes 13 at RB1.20 locus of 58 LSCC patients were analyzed. The p110RB1 protein state was detected by immunohistochemical staining using the polyclonal antibody to the RB1 products. Results It showed that 3 cases in the preinvasive stage (i.e. carcinoma in situ) had no any LOH on chromosome 13. Forty pereent of the 55 invasive LSCC showed LOH at RB1.20 locus.By immunohistochemical staining p110RB1 protein negative reaction was observed in 8 LSCCs in which 6 cases associated with LOH at RB1.20 locus. Conclusions RB1 gene was inactivated in some LSCCs. It is putative that there is another tumor suppressor gene on chromesome 13 near by RB1.20 locas.The inactivation of the genes at the chromosome 13q region including RB1 involved genesis and development of invasive LSCC.
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【Key words】 Laryngeal neoplasms Gene, suppressor, tumor Heterozygote detection Polymerase chain reaction
肿瘤的发生是多阶段、多因素改变的复杂过程,主要包括癌基因的激活和抑癌基因的失活。抑癌基因需要两个等位基因全部丢失或失活后才能引起细胞癌变。抑癌基因等位基因的丢失往往伴随该基因附近区域DNA片段的丢失,若该DNA片段具有多态标记,即可通过分析该多态标记的杂合性丢失(loss of heterozygosity,LOH), 确定抑癌基因等位基因丢失位置,进而发现新的抑癌基因。微卫星多态标记(microsatellite polymorphism marker)是近年来发现的一类高信息含量的DNA多态标记[1]。分子遗传学研究表明,RB1基因在许多肿瘤中都发生失活,但在喉癌中是否也发生失活尚不清楚,为此,我们做了如下研究。
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材料与方法
一、 标本来源
来自中国医科大学第一临床学院耳鼻咽喉科的喉癌手术切除标本。取癌组织及距癌组织1 cm以上的癌旁组织各0.1～0.5 cm3,立即冻存于-70℃保存备用。原位癌3例,浸润癌55例,其中声门上型喉癌30例,声门型22例,声门下型3例;按UICC1997标准分期Ⅰ期5例、Ⅱ期16例、Ⅲ期16例、Ⅳ期14例,分期不明者4例。上述病例均经病理证实。
二、LOH分析
1. DNA提取： 常规酚氯仿抽提法提取癌组织和癌旁组织基因组DNA,稀释成100ng/μ,4℃保存。
2. DNA标记和引物： 根据文献[2]选择RB1.20座位RB1基因第20内含子的微卫星多态顺序[为cttt(t)n 四核苷酸串联重复序列]进行LOH分析,产物片段长度为120～190 bp,引物顺序:
, http://www.100md.com
5'-tctcctccctacttacttgt-3'
5'-acagagtgagactctatctc-3'
3. PCR(聚合酶链反应 )扩增和凝胶电泳： 在含100 ng基因组DNA的10μl 反应体系中加入α-32p-dCTP标记引物进行PCR扩增。循环条件为:94℃ 3 min,经92℃ 0.5 min, 55℃1 min, 72℃ 1 min,30个循环后72℃延伸5 min。PCR产物用甲酰胺变性示踪液稀释2倍95℃5 min变性,取1～2 μl 点样,经含7 mol/L尿素的5%聚丙烯酰胺凝胶55℃、80 W电泳2小时分离,真空干胶,加增感屏与X光片暴光48小时(-70℃),放射自显影。
4.LOH判定： 正常组织(癌旁组织)基因组DNA为某一标记的杂合子时即出现两个片段,能提供信息用于LOH分析。如果出现一个片段即不能提供信息用于LOH分析。与癌旁组织对比,癌组织基因组DNA PCR扩增产物带消失一条或其中一条带信号明显减弱50%时则为LOH。
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三、p110RB1蛋白表达的检测
取上述病例41例的癌和癌旁交界处的组织0.2 cm3,经石蜡包埋,切片,用抗兔多克隆抗体Rb(c-15)作为第一抗体,SP试剂盒常规染色,细胞核呈现棕黄色颗粒为阳性。
结果
3例原位癌中无1例发生LOH。在55例浸润癌中,45例可提供信息,杂合度为81.8%(45/55)，LOH的频率为40.0%(18/45)(图1)。41例喉癌标本中,33例出现p110RB1蛋白表达阳性(图2)；8例RB蛋白表达缺失,其中6例伴有RB1.20座位的LOH(癌旁组织为对照,皆为阳性,图3)。
图1 1 为纯合子,不提供信息；2,4,6 未发生LOH；3,5发生LOH。N为癌旁组织；T为肿瘤组织
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图2 癌组织p110RB1 蛋白表达阳性.SP染色×40 图3 癌旁组织p110RB1蛋白表达阳性.SP染色×20
讨论
RB1基因是第一个被发现和研究的抑癌基因,最近Yoo等[3]在头颈部肿瘤的LOH和p110RB1蛋白表达的研究中发现有52%的病例在RB1座位附近发生LOH,仅有19%的病例出现p110RB1蛋白表达缺失,13%同时伴有RB1座位等位基因的丢失。因此认为,部分头颈部肿瘤RB1基因确以某种形式发生失活,但13q上52%的LOH和13%的RB1基因缺失的不平衡说明大部分头颈部肿瘤的发生发展是由于13q上其它抑癌基因的失活所致,而这个抑癌基因很可能在D13S133(13q14.3)座位附近。抑癌基因的失活模式常常是一个等位基因首先突变,而后另一等位基因丢失导致细胞恶性转变[4]。在喉癌中如果发生RB1基因失活,那么就应该在查到RB1基因丢失的同时检出RB1基因的突变。RB1基因含有27个外显子,26个内含子,基因组DNA长200 kb,筛查RB1基因的突变的步骤和费用非常繁琐、昂贵,而有时突变在启动子或内含子区域时,靠一般的PCR-SSCP(单链构象多态性)方法也是很难查到的。RB1基因多为移码突变,造成不能产生有功能的蛋白,所以用免疫组化方法检测不到RB蛋白的表达,在肝癌[2]和头颈部肿瘤[3]中已经证明用免疫组化方法检测RB蛋白的缺失敏感可靠。因此我们做了喉癌RB1.20座位的LOH和p110RB1蛋白表达的检测。在我们的研究中发现41例中33例出现p110RB1蛋白表达阳性,仅有8例出现RB蛋白表达阴性,其中6例同时伴有RB1.20座位的LOH,说明这6例中确是发生了RB基因的失活。而更多的病例仅发生RB1.20座位的LOH,但无RB1基因的失活,提示在RB1.20座位以外还存在另一个与该肿瘤发生发展紧密相关的抑癌基因。
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另外我们的研究中3例原位癌在RB1.20座位上均没有发生LOH，可能说明在RB1.20座位基因的失活发生在喉癌的浸润期，由于例数尚少还有待于进一步研究。
本课题由国家自然科学基金资助(编号:3947038)
参考文献
1 李万波,吴.限制性片段长度多态性和杂合性丢失与肿瘤研究.中华医学遗传学杂志, 1993,10:287-289.
2 Zhang X,Xu HJ,Murakami Y,et al. Deletions of chromosome 13q mutations in RB1 and Rb protein state in human hepatocellular carcinoma. Cancer Res, 1994,54:4177-4182.
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3 Yoo GH,Xu HJ,Brenan JA,et al. Infrequent inactivation of the retionblastoma gene despite frequent loss of chromosome 13q in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Res, 1994,54:4603-4606.
4 Knudson AG. Antioncogene and human cancer. Proc Ncad Sci USA, 1993,90:10914-10916.
(收稿：1997-05-29 修回：1998-01-15), http://www.100md.com
单位：110003 沈阳 中国医科大学第二临床学院耳鼻咽喉科(白素娟);第一临床学院耳鼻咽喉科(费声重);基础医学院分子遗传室(张学、王筠、孙开来)
关键词：喉肿瘤；基因；抑制；肿瘤；杂合子检测；聚合酶链反应
中华耳鼻咽喉科杂志980214 【摘要】 目的 探讨喉鳞状细胞癌组织中RB1基因在喉癌发生发展中的意义,为发现和定位新的抑癌基因提供线索和依据。方法 应用聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR),选择13号染色体上RB1.20座位的微卫星多态标记,对58例喉鳞状细胞癌组织进行杂合性丢失(loss of heterozygosity , LOH)分析和p110RB1蛋白表达的检测。结果 3例原位癌中均无RB1.20座位杂合性丢失，55例浸润癌中45例可提供信息,杂合性丢失的频率为40% (18/45), 41例中仅有8例RB蛋白表达缺失,其中6例伴有RB1.20座位的杂合性丢失。结论RB1基因在部分喉癌中发生失活;在RB1.20座位附近可能还存在与喉癌发生发展密切相关的抑癌基因。
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Loss of heterozygosity on chromosome RB1.20 locus and p110RB1 protein
state in squmous cell carcinomas of larynx
Bai Sujuan, Fei Shengzhong, Zhang Xue, et al.*Second Clinical College,China Medical University, Shenyang 110003
【Abstract】 Objective To study the RB1 gene in squamous cell carcinoma of larynx(LSCC) and to find clue for discovering and locating new suppressor gene. Methods Loss of heterozygosity (LOH) of microsatellite polymorphic sequence on chromosomes 13 at RB1.20 locus of 58 LSCC patients were analyzed. The p110RB1 protein state was detected by immunohistochemical staining using the polyclonal antibody to the RB1 products. Results It showed that 3 cases in the preinvasive stage (i.e. carcinoma in situ) had no any LOH on chromosome 13. Forty pereent of the 55 invasive LSCC showed LOH at RB1.20 locus.By immunohistochemical staining p110RB1 protein negative reaction was observed in 8 LSCCs in which 6 cases associated with LOH at RB1.20 locus. Conclusions RB1 gene was inactivated in some LSCCs. It is putative that there is another tumor suppressor gene on chromesome 13 near by RB1.20 locas.The inactivation of the genes at the chromosome 13q region including RB1 involved genesis and development of invasive LSCC.
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【Key words】 Laryngeal neoplasms Gene, suppressor, tumor Heterozygote detection Polymerase chain reaction
肿瘤的发生是多阶段、多因素改变的复杂过程,主要包括癌基因的激活和抑癌基因的失活。抑癌基因需要两个等位基因全部丢失或失活后才能引起细胞癌变。抑癌基因等位基因的丢失往往伴随该基因附近区域DNA片段的丢失,若该DNA片段具有多态标记,即可通过分析该多态标记的杂合性丢失(loss of heterozygosity,LOH), 确定抑癌基因等位基因丢失位置,进而发现新的抑癌基因。微卫星多态标记(microsatellite polymorphism marker)是近年来发现的一类高信息含量的DNA多态标记[1]。分子遗传学研究表明,RB1基因在许多肿瘤中都发生失活,但在喉癌中是否也发生失活尚不清楚,为此,我们做了如下研究。
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材料与方法
一、 标本来源
来自中国医科大学第一临床学院耳鼻咽喉科的喉癌手术切除标本。取癌组织及距癌组织1 cm以上的癌旁组织各0.1～0.5 cm3,立即冻存于-70℃保存备用。原位癌3例,浸润癌55例,其中声门上型喉癌30例,声门型22例,声门下型3例;按UICC1997标准分期Ⅰ期5例、Ⅱ期16例、Ⅲ期16例、Ⅳ期14例,分期不明者4例。上述病例均经病理证实。
二、LOH分析
1. DNA提取： 常规酚氯仿抽提法提取癌组织和癌旁组织基因组DNA,稀释成100ng/μ,4℃保存。
2. DNA标记和引物： 根据文献[2]选择RB1.20座位RB1基因第20内含子的微卫星多态顺序[为cttt(t)n 四核苷酸串联重复序列]进行LOH分析,产物片段长度为120～190 bp,引物顺序:
, http://www.100md.com
5'-tctcctccctacttacttgt-3'
5'-acagagtgagactctatctc-3'
3. PCR(聚合酶链反应 )扩增和凝胶电泳： 在含100 ng基因组DNA的10μl 反应体系中加入α-32p-dCTP标记引物进行PCR扩增。循环条件为:94℃ 3 min,经92℃ 0.5 min, 55℃1 min, 72℃ 1 min,30个循环后72℃延伸5 min。PCR产物用甲酰胺变性示踪液稀释2倍95℃5 min变性,取1～2 μl 点样,经含7 mol/L尿素的5%聚丙烯酰胺凝胶55℃、80 W电泳2小时分离,真空干胶,加增感屏与X光片暴光48小时(-70℃),放射自显影。
4.LOH判定： 正常组织(癌旁组织)基因组DNA为某一标记的杂合子时即出现两个片段,能提供信息用于LOH分析。如果出现一个片段即不能提供信息用于LOH分析。与癌旁组织对比,癌组织基因组DNA PCR扩增产物带消失一条或其中一条带信号明显减弱50%时则为LOH。
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三、p110RB1蛋白表达的检测
取上述病例41例的癌和癌旁交界处的组织0.2 cm3,经石蜡包埋,切片,用抗兔多克隆抗体Rb(c-15)作为第一抗体,SP试剂盒常规染色,细胞核呈现棕黄色颗粒为阳性。
结果
3例原位癌中无1例发生LOH。在55例浸润癌中,45例可提供信息,杂合度为81.8%(45/55)，LOH的频率为40.0%(18/45)(图1)。41例喉癌标本中,33例出现p110RB1蛋白表达阳性(图2)；8例RB蛋白表达缺失,其中6例伴有RB1.20座位的LOH(癌旁组织为对照,皆为阳性,图3)。
图1 1 为纯合子,不提供信息；2,4,6 未发生LOH；3,5发生LOH。N为癌旁组织；T为肿瘤组织
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图2 癌组织p110RB1 蛋白表达阳性.SP染色×40 图3 癌旁组织p110RB1蛋白表达阳性.SP染色×20
讨论
RB1基因是第一个被发现和研究的抑癌基因,最近Yoo等[3]在头颈部肿瘤的LOH和p110RB1蛋白表达的研究中发现有52%的病例在RB1座位附近发生LOH,仅有19%的病例出现p110RB1蛋白表达缺失,13%同时伴有RB1座位等位基因的丢失。因此认为,部分头颈部肿瘤RB1基因确以某种形式发生失活,但13q上52%的LOH和13%的RB1基因缺失的不平衡说明大部分头颈部肿瘤的发生发展是由于13q上其它抑癌基因的失活所致,而这个抑癌基因很可能在D13S133(13q14.3)座位附近。抑癌基因的失活模式常常是一个等位基因首先突变,而后另一等位基因丢失导致细胞恶性转变[4]。在喉癌中如果发生RB1基因失活,那么就应该在查到RB1基因丢失的同时检出RB1基因的突变。RB1基因含有27个外显子,26个内含子,基因组DNA长200 kb,筛查RB1基因的突变的步骤和费用非常繁琐、昂贵,而有时突变在启动子或内含子区域时,靠一般的PCR-SSCP(单链构象多态性)方法也是很难查到的。RB1基因多为移码突变,造成不能产生有功能的蛋白,所以用免疫组化方法检测不到RB蛋白的表达,在肝癌[2]和头颈部肿瘤[3]中已经证明用免疫组化方法检测RB蛋白的缺失敏感可靠。因此我们做了喉癌RB1.20座位的LOH和p110RB1蛋白表达的检测。在我们的研究中发现41例中33例出现p110RB1蛋白表达阳性,仅有8例出现RB蛋白表达阴性,其中6例同时伴有RB1.20座位的LOH,说明这6例中确是发生了RB基因的失活。而更多的病例仅发生RB1.20座位的LOH,但无RB1基因的失活,提示在RB1.20座位以外还存在另一个与该肿瘤发生发展紧密相关的抑癌基因。
, 百拇医药
另外我们的研究中3例原位癌在RB1.20座位上均没有发生LOH，可能说明在RB1.20座位基因的失活发生在喉癌的浸润期，由于例数尚少还有待于进一步研究。
本课题由国家自然科学基金资助(编号:3947038)
参考文献
1 李万波,吴.限制性片段长度多态性和杂合性丢失与肿瘤研究.中华医学遗传学杂志, 1993,10:287-289.
2 Zhang X,Xu HJ,Murakami Y,et al. Deletions of chromosome 13q mutations in RB1 and Rb protein state in human hepatocellular carcinoma. Cancer Res, 1994,54:4177-4182.
, 百拇医药
3 Yoo GH,Xu HJ,Brenan JA,et al. Infrequent inactivation of the retionblastoma gene despite frequent loss of chromosome 13q in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Res, 1994,54:4603-4606.
4 Knudson AG. Antioncogene and human cancer. Proc Ncad Sci USA, 1993,90:10914-10916.
(收稿：1997-05-29 修回：1998-01-15), http://www.100md.com