EB病毒感染与鼻腔鼻窦非霍奇金淋巴瘤关系的研究
作者：李添应 邱前辉 李妮娜 林华欢 朱振宇
单位：510089 广州 中山医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科(李添应)；广东省人民医院(邱前辉、林华欢)；四川重庆钢铁厂职工医院(李妮娜)；中山医科大学生化教研室(朱振宇)
关键词：鼻肿瘤；淋巴瘤；非霍奇金氏；疱疹病毒4型；人；DNA；病毒
中华耳鼻咽喉科杂志980409 【摘要】 目的 探讨EB病毒与鼻腔鼻窦非霍奇金淋巴瘤的关系。方法 采用多聚酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测22例原发性鼻腔、鼻窦非霍奇金淋巴瘤(其中T细胞型13例，B细胞型9例)瘤组织及20例炎症性鼻腔鼻窦粘膜组织中EB病毒DNA酶基因。结果 发现实验组中14例EBV-DNA酶基因阳性，T细胞型13例中9例阳性，B细胞型9例中5例阳性，总阳性率为63.6%；对照组20例中4例EBV-DNA酶基因阳性，阳性率为20%，实验组与对照组比较阳性率差异有显著性(χ2检验，P<0.005)。结论 EBV感染不仅存在于B细胞型非霍奇金淋巴瘤，也存在于T细胞型的非霍奇金淋巴瘤中。
, 百拇医药
Studies on Epstein-Barr virus in patients with primary sinonasal non-Hodgkin's lymphoma Li Tianying*, Qiu Qianhui, Li Nina, et al. *First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089
【Abstract】 Objective To study the relationship between Epstein-Barr virus (EBV) infection and primary sinonasal non-Hodgkin's lymphoma. Methods Using polymerase chain reaction (PCR) method, 22 patients with primary sinonasal non-Hodgkin's lymphoma (NHL), including 13 tumours of T cell type and 9 of B cell type, and mucosa from twenty cases of nasonasosinusitis were tested for the presence of Epstein-Barr virus (EBV) DNA. Results The results showed that 14 of 22 non-Hodgkin's lymphoma (63.6%) and 4 of 20 nasonasosinusitis mucosa (20%) were EBV-DNAase gene positive (9 T cell type and 5 B cell type). The difference between non-Hodgkin's lymphoma and nasal mucosa was statistically significant (P<0.005). Conclusion These results suggest that EBV is not only present in B lymphocyte lymphomas but also in T lymphocyte lymphomas.
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【Key words】 Nose neoplasms Lymphoma,non-Hodgkin's Herpesvirus 4, human DNA, viral
EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)是一种具有嗜B淋巴细胞特性的人类疱疹病毒。近年研究发现，许多疾病与EBV感染有关，主要包括淋巴细胞增殖性疾病、非淋巴细胞恶性肿瘤以及自身免疫性疾病等三大类[1]。本研究通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)的方法检测原发性鼻腔鼻窦非霍奇金淋巴瘤组织中EBV-DNA酶基因，以观察原发性鼻腔鼻窦非霍奇金淋巴瘤中EBV感染存在的情况。
材料与方法
一、实验对象
实验组22例全部为1980～1995年石蜡存档标本，来自中山医科大学病理教研室、广东省人民医院及中山医科大学附属肿瘤医院病理科。本组病例结合临床特点(以鼻腔局部症状为首发，就诊时发病在5个月以上)并结合病理检查诊断为鼻腔、鼻窦非霍奇金淋巴瘤，其中鼻腔22例次，筛窦3例次，上颌窦2例次。根据细胞来源的特点，按文献报道的诊断方法[2]，采用链霉素亲生物蛋白过氧化酶免疫组化法(labelled streptavidin biotin method，LSAB法)诊断为T细胞型13例，B细胞型9例。T细胞型用CD45Ro抗体染色，B细胞型用CD20抗体染色(Dako公司,丹麦)。患者男14例，女8例；年龄14～79岁，平均40.2岁。
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对照组20例新鲜标本全部为鼻腔鼻窦粘膜组织，在行鼻窦炎手术中取材于鼻腔鼻窦粘膜，病理学结果证实为慢性炎症，其中男15例，女5例，年龄16～51岁，平均33.5岁。
二、引物
EBV-DNA酶全基因引物一对，根据EMBL数据库，由中国军事科学院基础医学研究所转抄的B95-8细胞中EBV基因序列自行设计，上海细胞所合成。其序列为∶引物Ⅰ∶5'-GCAGTCGACTTCTTTGGTCC-3' 引物Ⅱ∶5'-TTGATTATTCCCCCGTCGAC-3'。扩增的DNA片段位于EBV基因组122、412～120、742 bp处，片段大小为1 460 bp。
三、实验方法
1.模板DNA的抽提：活检组织约10 μg，加裂解缓冲液100 μl，56 ℃水浴轻摇2 min，95 ℃水浴变性7 min，10 000 r/min离心5 min，取上清液1～2 μl作模板。石蜡包埋切片，约4 μm厚切片1～2块放入了 500 μl离心管中，400 μl二甲苯脱蜡2次，400 μl无水乙醇脱水，70%乙醇去除残留杂物，风干后加入缓冲液300 μl，56℃水浴轻摇8～10 h，10 000 r/min离心5 min，直接取1～2 μl上清液作模板。
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2.PCR扩增：检测用总体积为30 μl。取模板1～2 μl，引物Ⅰ、Ⅱ号各8 pmol，dNTPs 20 μmol，Taq lymerase 1 U，双蒸馏水 30 μl，液体石蜡 50 μl。稍加离心混匀后，即按下列温度和时间共循环25次：93℃ 30 s、50℃ 30 s、70℃ 60 s。最后在70℃延伸7 min。
3.琼脂糖凝胶电泳扩增产物：取15 μl PCR扩增产物在0.8%的琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭染色后，在紫外线分析仪下鉴定，分析扩增结果。
四、数据统计学处理
收集的数据输入计算机，经SPSS-PC软件包进行χ2检验及确切概率法检验。
结果
实验组22例标本中，14例EBV-DNA酶基因扩增阳性(63.6%，附图)。其中13例T细胞型中9例阳性(69.2%)，9例B细胞型中5例阳性(55.6%)。20例对照组中，4例阳性(20%)。实验组与对照组结果经χ2检验(χ2=8.145，P<0.005)两者差异有显著性。而T细胞型及B细胞型两组结果经确切概率法检验，二者差异无显著性，P值均大于0.05。
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讨论
EBV感染存在于多种良、恶性淋巴增生病变组织中，并构成了淋巴增生性疾病的一大特征[3,4]。
1：DNA标记物；pBR322/Bst N I：1857bp，1060 bp, 929 bp；383 bp；121 bp； 2，3，6：均出现1460 bp的特异性扩增产物，为PCR扩增阳性(为保证检测的高灵敏度，采用了较低的退火温度，故有少量非特异扩增带出现，但不影响结果判断)；4，5：为PCR扩增阳性；7，8：分别为阴性和阳性对照管PCR扩增结果
附图 EBV-DNA酶基因PCR扩增产物电泳图
EBV感染检出率各家报道在不同的疾病中结果不同，Mishima等[5]用PCR方法检测了32例中国及日本多形性网状细胞增多症患者的EBV-DNA，阳性率33%～100%, 认为EBV感染的阳性率因地理环境而异。本组非霍奇金淋巴瘤EBV感染阳性检出率为63.6%，与对照组结果比较差异有显著性，说明EBV感染可能与原发性鼻腔鼻窦非霍奇金淋巴瘤有关。
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EBV只感染有EBV受体的细胞，过去认为EBV受体仅存在于B淋巴细胞，近年研究发现，在腮腺管、咽部以及子宫颈外口的上皮细胞表面都有类似EBV受体的结构[6,7]。本组中，B细胞型、T细胞型的EBV感染结果经统计学处理，差异无显著性，提示在T细胞中也存在EBV受体，EBV感染也存在于T细胞的非霍奇金淋巴瘤中。
EBV感染后其肿瘤发生的可能机理是：潜在感染时，EBV-DNA存在于细胞核内，但平时不表达或只部分低水平表达，只有在一定条件下，如免疫功能低下，某种EBV变异株的再感染或多种化学诱导剂(如丁酸、巴豆油等)的诱导下，再次活跃地表达，大量EBV-DNA克隆片段整合至宿主DNA上，使宿主细胞转化而获得持续生长和增殖的能力，最终导致癌变。目前已证实，EBV感染不仅可使B淋巴细胞转化，也能使T淋巴细胞转化。虽然转化机制不清楚，但目前认为EB病毒的EBV核抗原2(Epstein-Barr nuclear antigen-2，EBNA-2)及潜在感染膜蛋白可能起了重要作用[1]。
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本课题为广东省自然科学基金资助项目(编号：950336)
参考文献
1杜平, 朱关福, 刘湘云,主编. 现代临床病毒学 北京:人民军医出版社, 1991. 615-623.
2朱梅刚，周志韶,主编. 淋巴组织增生性疾病病理学. 广州：广东高等教育出版社, 1994.87-120.
3Ho FCS, Srivastava G, Ioke SL, et al. Presence of Epstein-Barr virus DNA in nasal lymphomas of “B”and “T”cell type. Hematol Oncol, 1990,8:271-281.
4Su IJ, Hsieh HC. Clinicopathological spectrum of Epstein-Barr virus-associated T cell malignancies. Leuk Lymphoma, 1992,7:47-53.
, http://www.100md.com
5Mishima K, Horiuchi K, Kojya S, et al. Epstein-Barr virus in patients with polymorphic reticulosis (lethal midline granuloma) from China and Japan. Cancer ,1994, 73:3041-3046.
6Young LS, Clark D, Sixbey JW, et al. Epstein-Barr virus receptors on human pharyngeal epithelia. Lancet, 1986,1:240-242.
7Sixbey JW, Davis DS, Young LS, et al. Human epithelial cell expression of an Epstein-Barr virus receptor. J Gen Virol, 1987 ,68:805-811.
(收稿：1997-07-30 修回：1997-11-20), 百拇医药
单位：510089 广州 中山医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科(李添应)；广东省人民医院(邱前辉、林华欢)；四川重庆钢铁厂职工医院(李妮娜)；中山医科大学生化教研室(朱振宇)
关键词：鼻肿瘤；淋巴瘤；非霍奇金氏；疱疹病毒4型；人；DNA；病毒
中华耳鼻咽喉科杂志980409 【摘要】 目的 探讨EB病毒与鼻腔鼻窦非霍奇金淋巴瘤的关系。方法 采用多聚酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术检测22例原发性鼻腔、鼻窦非霍奇金淋巴瘤(其中T细胞型13例，B细胞型9例)瘤组织及20例炎症性鼻腔鼻窦粘膜组织中EB病毒DNA酶基因。结果 发现实验组中14例EBV-DNA酶基因阳性，T细胞型13例中9例阳性，B细胞型9例中5例阳性，总阳性率为63.6%；对照组20例中4例EBV-DNA酶基因阳性，阳性率为20%，实验组与对照组比较阳性率差异有显著性(χ2检验，P<0.005)。结论 EBV感染不仅存在于B细胞型非霍奇金淋巴瘤，也存在于T细胞型的非霍奇金淋巴瘤中。
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Studies on Epstein-Barr virus in patients with primary sinonasal non-Hodgkin's lymphoma Li Tianying*, Qiu Qianhui, Li Nina, et al. *First Affiliated Hospital, Sun Yat-sen University of Medical Sciences, Guangzhou 510089
【Abstract】 Objective To study the relationship between Epstein-Barr virus (EBV) infection and primary sinonasal non-Hodgkin's lymphoma. Methods Using polymerase chain reaction (PCR) method, 22 patients with primary sinonasal non-Hodgkin's lymphoma (NHL), including 13 tumours of T cell type and 9 of B cell type, and mucosa from twenty cases of nasonasosinusitis were tested for the presence of Epstein-Barr virus (EBV) DNA. Results The results showed that 14 of 22 non-Hodgkin's lymphoma (63.6%) and 4 of 20 nasonasosinusitis mucosa (20%) were EBV-DNAase gene positive (9 T cell type and 5 B cell type). The difference between non-Hodgkin's lymphoma and nasal mucosa was statistically significant (P<0.005). Conclusion These results suggest that EBV is not only present in B lymphocyte lymphomas but also in T lymphocyte lymphomas.
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【Key words】 Nose neoplasms Lymphoma,non-Hodgkin's Herpesvirus 4, human DNA, viral
EB病毒(Epstein-Barr virus, EBV)是一种具有嗜B淋巴细胞特性的人类疱疹病毒。近年研究发现，许多疾病与EBV感染有关，主要包括淋巴细胞增殖性疾病、非淋巴细胞恶性肿瘤以及自身免疫性疾病等三大类[1]。本研究通过聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)的方法检测原发性鼻腔鼻窦非霍奇金淋巴瘤组织中EBV-DNA酶基因，以观察原发性鼻腔鼻窦非霍奇金淋巴瘤中EBV感染存在的情况。
材料与方法
一、实验对象
实验组22例全部为1980～1995年石蜡存档标本，来自中山医科大学病理教研室、广东省人民医院及中山医科大学附属肿瘤医院病理科。本组病例结合临床特点(以鼻腔局部症状为首发，就诊时发病在5个月以上)并结合病理检查诊断为鼻腔、鼻窦非霍奇金淋巴瘤，其中鼻腔22例次，筛窦3例次，上颌窦2例次。根据细胞来源的特点，按文献报道的诊断方法[2]，采用链霉素亲生物蛋白过氧化酶免疫组化法(labelled streptavidin biotin method，LSAB法)诊断为T细胞型13例，B细胞型9例。T细胞型用CD45Ro抗体染色，B细胞型用CD20抗体染色(Dako公司,丹麦)。患者男14例，女8例；年龄14～79岁，平均40.2岁。
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对照组20例新鲜标本全部为鼻腔鼻窦粘膜组织，在行鼻窦炎手术中取材于鼻腔鼻窦粘膜，病理学结果证实为慢性炎症，其中男15例，女5例，年龄16～51岁，平均33.5岁。
二、引物
EBV-DNA酶全基因引物一对，根据EMBL数据库，由中国军事科学院基础医学研究所转抄的B95-8细胞中EBV基因序列自行设计，上海细胞所合成。其序列为∶引物Ⅰ∶5'-GCAGTCGACTTCTTTGGTCC-3' 引物Ⅱ∶5'-TTGATTATTCCCCCGTCGAC-3'。扩增的DNA片段位于EBV基因组122、412～120、742 bp处，片段大小为1 460 bp。
三、实验方法
1.模板DNA的抽提：活检组织约10 μg，加裂解缓冲液100 μl，56 ℃水浴轻摇2 min，95 ℃水浴变性7 min，10 000 r/min离心5 min，取上清液1～2 μl作模板。石蜡包埋切片，约4 μm厚切片1～2块放入了 500 μl离心管中，400 μl二甲苯脱蜡2次，400 μl无水乙醇脱水，70%乙醇去除残留杂物，风干后加入缓冲液300 μl，56℃水浴轻摇8～10 h，10 000 r/min离心5 min，直接取1～2 μl上清液作模板。
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2.PCR扩增：检测用总体积为30 μl。取模板1～2 μl，引物Ⅰ、Ⅱ号各8 pmol，dNTPs 20 μmol，Taq lymerase 1 U，双蒸馏水 30 μl，液体石蜡 50 μl。稍加离心混匀后，即按下列温度和时间共循环25次：93℃ 30 s、50℃ 30 s、70℃ 60 s。最后在70℃延伸7 min。
3.琼脂糖凝胶电泳扩增产物：取15 μl PCR扩增产物在0.8%的琼脂糖凝胶中电泳，溴化乙锭染色后，在紫外线分析仪下鉴定，分析扩增结果。
四、数据统计学处理
收集的数据输入计算机，经SPSS-PC软件包进行χ2检验及确切概率法检验。
结果
实验组22例标本中，14例EBV-DNA酶基因扩增阳性(63.6%，附图)。其中13例T细胞型中9例阳性(69.2%)，9例B细胞型中5例阳性(55.6%)。20例对照组中，4例阳性(20%)。实验组与对照组结果经χ2检验(χ2=8.145，P<0.005)两者差异有显著性。而T细胞型及B细胞型两组结果经确切概率法检验，二者差异无显著性，P值均大于0.05。
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讨论
EBV感染存在于多种良、恶性淋巴增生病变组织中，并构成了淋巴增生性疾病的一大特征[3,4]。
1：DNA标记物；pBR322/Bst N I：1857bp，1060 bp, 929 bp；383 bp；121 bp； 2，3，6：均出现1460 bp的特异性扩增产物，为PCR扩增阳性(为保证检测的高灵敏度，采用了较低的退火温度，故有少量非特异扩增带出现，但不影响结果判断)；4，5：为PCR扩增阳性；7，8：分别为阴性和阳性对照管PCR扩增结果
附图 EBV-DNA酶基因PCR扩增产物电泳图
EBV感染检出率各家报道在不同的疾病中结果不同，Mishima等[5]用PCR方法检测了32例中国及日本多形性网状细胞增多症患者的EBV-DNA，阳性率33%～100%, 认为EBV感染的阳性率因地理环境而异。本组非霍奇金淋巴瘤EBV感染阳性检出率为63.6%，与对照组结果比较差异有显著性，说明EBV感染可能与原发性鼻腔鼻窦非霍奇金淋巴瘤有关。
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EBV只感染有EBV受体的细胞，过去认为EBV受体仅存在于B淋巴细胞，近年研究发现，在腮腺管、咽部以及子宫颈外口的上皮细胞表面都有类似EBV受体的结构[6,7]。本组中，B细胞型、T细胞型的EBV感染结果经统计学处理，差异无显著性，提示在T细胞中也存在EBV受体，EBV感染也存在于T细胞的非霍奇金淋巴瘤中。
EBV感染后其肿瘤发生的可能机理是：潜在感染时，EBV-DNA存在于细胞核内，但平时不表达或只部分低水平表达，只有在一定条件下，如免疫功能低下，某种EBV变异株的再感染或多种化学诱导剂(如丁酸、巴豆油等)的诱导下，再次活跃地表达，大量EBV-DNA克隆片段整合至宿主DNA上，使宿主细胞转化而获得持续生长和增殖的能力，最终导致癌变。目前已证实，EBV感染不仅可使B淋巴细胞转化，也能使T淋巴细胞转化。虽然转化机制不清楚，但目前认为EB病毒的EBV核抗原2(Epstein-Barr nuclear antigen-2，EBNA-2)及潜在感染膜蛋白可能起了重要作用[1]。
, 百拇医药
本课题为广东省自然科学基金资助项目(编号：950336)
参考文献
1杜平, 朱关福, 刘湘云,主编. 现代临床病毒学 北京:人民军医出版社, 1991. 615-623.
2朱梅刚，周志韶,主编. 淋巴组织增生性疾病病理学. 广州：广东高等教育出版社, 1994.87-120.
3Ho FCS, Srivastava G, Ioke SL, et al. Presence of Epstein-Barr virus DNA in nasal lymphomas of “B”and “T”cell type. Hematol Oncol, 1990,8:271-281.
4Su IJ, Hsieh HC. Clinicopathological spectrum of Epstein-Barr virus-associated T cell malignancies. Leuk Lymphoma, 1992,7:47-53.
, http://www.100md.com
5Mishima K, Horiuchi K, Kojya S, et al. Epstein-Barr virus in patients with polymorphic reticulosis (lethal midline granuloma) from China and Japan. Cancer ,1994, 73:3041-3046.
6Young LS, Clark D, Sixbey JW, et al. Epstein-Barr virus receptors on human pharyngeal epithelia. Lancet, 1986,1:240-242.
7Sixbey JW, Davis DS, Young LS, et al. Human epithelial cell expression of an Epstein-Barr virus receptor. J Gen Virol, 1987 ,68:805-811.
(收稿：1997-07-30 修回：1997-11-20), 百拇医药