听神经瘤患者离体前庭毛细胞的分离及胞内钙离子活动
作者：
陈雷 姜泗长 杨伟炎 友田幸一 山下敏夫
单位：100853 北京 解放军总医院耳鼻咽喉科(陈雷、姜泗长、杨伟炎)；日本关西医科大学了下鼻咽喉科(友田幸一、山下敏夫)
关键词：毛细胞；前庭；；细胞分离；；钙；；神经瘤；听
中华耳鼻咽喉科杂志980406 【摘要】 目的 进一步了解离体人前庭毛细胞的胞内钙离子(Ca2+)活动。方法 从3例经迷路听神经瘤切除术患者中采取半规管壶腹中的前庭毛细胞，用倒置显微镜观察分离出的离体前庭毛细胞形态，用Ca2+敏感的荧光染料Fura-2和数字影像显微镜监测细胞内Ca2+浓度的变化。结果 分离的前庭毛细胞主要为Ⅰ型毛细胞，可在体外存活2.5 h。用150 mmol/L K+液灌流单离的前庭毛细胞引起胞内Ca2+的显著升高，荧光比率从0.54 升至1.16；这种胞内Ca2+的升高在胞外液中Ca2+缺如的情况下消失。0.25 μmol/L Ionomycin可以引起前庭毛细胞内Ca2+的不可逆性升高，荧光比率保持在0.73。结论 人前庭毛细胞膜上存在电压敏感的Ca2+通道。
, http://www.100md.com
Isolation of and intracellular calcium mobilization in vestibular hair cells of the patients with acoustic neuroma Chen Lei,Jiang Sichang,Yang Weiyan,et al.PLA General Hospital,Beijing 100853
【Abstract】 Objective To further understand the biological features of the human vestibular organ. Methods Vestibular hair cells were isolated from patients with acoustic neuroma during the surgery and intracellular free calcium concentration of the cells was monitored with calcium-sensitive dye Fura-2 and digital imaging microscopy. Results Isolated vestibular hair cells were mainly of type I and could survive about 2.5 hours in vitro. Perfusion with 150 mmol/L KCl, induced a depolarization, resulting in a temporary increase of 340 nm/380 nm ratio from 0.52 to 1.16 within 1 min. In Ca2+ free environment, 150 mmol/L KCl failed to induce intracellular calcium increase. In the presence of 2.5 μmol/L ionomycin, there was an irreversible increase in 340 nm/380 nm ratio. Conclusion Human vestibular hair cell apparenly possess voltage sensitive calcium channels. The method and observation aid in elucidating human vestibular biological features.
, 百拇医药
【Key words】 Hair cell,vestibular Cell separation Calcium Neuroma,acoustis
前庭毛细胞是前庭系统的感受器，前庭半规管壶腹嵴毛细胞将体位变化时内淋巴的角加速运动刺激转变为电兴奋传入前庭中枢。众多实验结果表明钙离子(Ca2+)参与多种细胞生理过程，被称为第二信使。了解细胞内钙离子的活动特性，能进一步了解前庭细胞的电生理特性。已有许多文献报告了哺乳动物离体前庭毛细胞的生物学特性和胞内钙离子变化[1～4]。现报告听神经瘤患者离体前庭毛细胞的分离和胞内钙离子的活动。
材料和方法
临床资料：研究材料取自3例听神经瘤患者，其中男2例，女1例。例1 男，73岁，右耳鸣10余月，双耳感音神经性聋，右耳言语频率听阈70 dB，左耳40 dB，CT、磁共振(MRI)示右桥小脑角18 mm×10 mm占位性病变,双侧前庭功能消失。例2 女，53岁，左耳听力减退半年，左耳言语频率听阈54 dB，左侧前庭功能消失。例3 男，59岁，左耳听力减退9个月，左耳言语频率听阈70 dB，MRI示左桥小脑角直经2 cm占位性病变。
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细胞的分离：经迷路入路行听神经瘤切除术中，逐渐磨薄骨质，显露上、中、下3个半规管，取出膜性半规管及壶腹，取出的膜性半规管和壶腹置于标准生理盐液中。标准生理盐液主要成分：NaCl 150 mmol/L，KCl 5 mmol/L，Tris 0.01mol/L, K2HPO4 0.8 mmol/L，MgCl2 1 mmol/L，葡萄糖 5 mmol/L，CaCl2 1 mmol/L，pH值 7.4，渗透浓度300 Osmmol/L。于22～24℃室温下分离前庭毛细胞。在解剖显微镜下，将骨性半规管切除，保留壶腹，纵行剖开壶腹嵴对面的膜性半规管。将半规管壶腹嵴组织置于含有胶原酶0.1 g/ml，白蛋白0.02 g/ml的标准生理盐液中30 min，清洗后用显微剪刀剪成碎块，然后用毛细管轻柔吹打多次，用Fura-2/AM(Dojindo，日本)孵育30 min后观察。
将分离的前庭毛细胞置于涂有cell-Tak(1 g/L，Cosmo-Bio，日本)实验皿中，实验皿中盛有标准生理盐液300 μL，前庭毛细胞用2 μmol/L Fura-2/AM孵育30 min后观察。灌流实验是将人前庭单离毛细胞置于实验皿中，该皿容量300 μL，用头皮针分别置于实验皿两侧，一侧为入液管，一侧为出液管。用微量泵持续灌流标准生理盐液，速度300 μL/min。实验过程中各种药物均从入液管灌入。分别采用150 mmol/L K+液、无钙标准生理盐液、无钙的150 mmol/L K+液进行灌流实验。
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显微镜观察：将盛有Fura-2孵育后的前庭毛细胞实验皿置于倒置显微镜载物台上，显微镜连接高分辨微分干涉相差荧光分析系统。使用通过干涉和中性滤光片，半个滤波带宽为10 nm，激发光为波长340 nm和380 nm的75 W氙灯，然后激发光被半通透波长400 nm的二色性镜反射。从胞内发出的荧光亦透过该镜和20 nm带通，510 nm阻挡滤片。胞内钙离子浓度用波长340 nm与380 nm的荧光强度比率表示：340 nm激发光的荧光强度增加，同时380 nm激发光荧光强度减低，说明钙离子浓度升高。Fura-2/Am是一种酶化的Fura-2，它能穿过胞膜并被检测出，且对细胞无损伤。细胞内荧光被聚焦在微光摄像机上并输入胞内钙离子影像实时分析系统(Argus-100/CA，滨松光电研究所)。荧光比率系对两种激发光的影像减除背景经数学计算取得[3]。
结果
离体人前庭毛细胞分两型：Ⅰ型细胞呈烧瓶状，有细颈，颈部上方可见表皮板及其上的纤毛束，细胞颈下方为胞体，胞体内可见圆形或椭圆形的核(图1)；Ⅱ型细胞呈试管状，离体状态下在形态上难以与肿胀变性的Ⅰ型细胞相区别。
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因前庭毛细胞分离费时较多，本研究从每个壶腹中仅选1个活性良好的细胞观察胞内钙离子的变化。活性良好的细胞边缘可见双折光像，胞膜完整、光滑，纤毛存在无散乱。离体人前庭毛细胞可在体外培养液中保持活性2.5 h。
人前庭毛细胞在静息状态下，胞内钙离子的荧光比率(测4个细胞)为0.52±0.03 (
±s)。用150 mmol/L K+液灌流3个细胞,灌流开始后30 s荧光比例从0.54±0.03增至0.72±0.10；灌流开始后45 s时即达最高峰1.16±0.09；然后逐渐下降，60 s降至1.09±0.10；灌流后75 s降至1.03±0.13；灌流开始后90s时为0.97±0.13(图2)。用无钙标准生理盐液灌流前庭毛细胞，胞内钙离子迅速下降，5 min后胞内钙离子稳定于0.24。用无钙的150 mmol/L K+液灌流30 s，胞内Ca2+从0.24±0.01仅升至0.28±0.01(图3)。 
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图2 150 mmol/L KCl灌流诱发的人离体前庭毛细胞胞内Ca2+的变化
图3 细胞外液无Ca2+灌流150 mmol/L KCl后人离体前庭毛细胞胞内Ca2+的变化
用含有2.5 μmol/L Ionomycin的标准生理盐液灌流前庭1个毛细胞后，胞内Ca2+迅速升高，灌流30 s胞内Ca2+荧光比率从0.53升至0.65；灌流停止30 s升至0.73，此后胞内Ca2+保持一个持续性
图4 2.5 μmol/L Ionomycin灌流诱发的人离体前庭毛细胞胞内Ca2+变化升高(图4)，约10min后细胞因钙超载而死亡。讨论
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分离豚鼠等动物的离体前庭毛细胞已有报道。前庭毛细胞较耳蜗毛细胞胞体小4～5倍，离体的前庭毛细胞可分为有颈烧瓶状的Ⅰ型细胞和试管状的Ⅱ型细胞[2]。人颞骨切片亦示人前庭毛细胞分为Ⅰ型和Ⅱ型[5]。从豚鼠等动物耳分离出的前庭毛细胞多为Ⅰ型，而鉴定Ⅱ型细胞较为困难[2]。本实验中所分离出的毛细胞也主要为Ⅰ型细胞，Ⅱ型细胞与水肿变形的Ⅰ型不易区别，故只报道Ⅰ型细胞。Zajic[6]和Schacht提出正常离体细胞的形态学标准：细胞无折皱，胞浆内无颗粒，核位于细胞底，胞浆内无布朗运动。本实验所分离出的细胞形态符合上述形态学标准，表皮板上纤毛束完整。细胞可被Fura-2染色，且胞内钙离子的浓度可随外环境的刺激而变化，表明所分离出的人离体毛细胞活性良好，符合生理学实验的要求。
Fura-2荧光比率影像分析系统已用来测定内耳单细胞内钙离子浓度的变化[2，3]。对豚鼠耳蜗毛细胞，鸡、豚鼠前庭毛细胞的观察已揭示了许多耳蜗、前庭功能的机制[2～4]。1991年Ohtani[2]报道离体豚鼠前庭毛细胞在150 mmol/L K+刺激后迅速出现胞内钙离子浓度的增加，钙离子载体Ionomycin亦可使胞内钙离子浓度迅速增加，并保持一个相对的高水平。本实验观察到从听神经瘤患者颞骨中取出的前庭毛细胞对150 mmol/L K+的去极化刺激可产生胞内钙离子的迅速升高，这种胞内Ca2+的升高主要依赖于胞膜上电压依赖性Ca2+通道，钙通道的开放使胞外钙离子流入。因为胞外无钙的状态下胞内钙离子对高K+刺激的反应几乎消失，亦表明K+引起的胞内Ca2+浓度升高主要是胞外Ca2+内流所至。Ca2+载体Ionomycin可引起胞内钙离子的持续性升高。本实验的结果与以往动物前庭毛细胞的结果相似[2]。尽管人前庭毛细胞取材于听神经瘤患者，术前前庭功能低下或消失，听神经瘤系前庭神经纤维病变，对前庭毛细胞本身无直接侵犯，但对毛细胞功能的间接影响尚需进一步研究。本研究所分离人体的前庭毛细胞形态正常，离体条件可保持活性约2.5 h。人前庭毛细胞的分离和实验技术可推广应用于电生理、药理研究，以分析活的生命现象和细胞及器官功能。
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图1 离体人前庭毛细胞(I型)。×1500
参考文献
1Valat J, Devau G, Dulon D, et al. Vestibular hair cells isolated from guinea pig labyrinth. Hear Res, 1989, 40: 255-260.
2Ohtani M, Yamashita T, Amano H, et al. Isolation of and calcium mobilization in vestibular hair cells of the guinea pig. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec, 1991, 53: 82-85.
3Yamashita T, Ohnishi S, Ohtani M, et al. Effects of efferent neurotransmitters on intracellular Ca2+ concentration in vestibular hair cells of the guinea pig. Acta Otolaryngol, 1993, Suppl 500: 26-30.
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4Ohtani M, Yamashita T, Amano H, et al. Thermal Influence on Intracellular calcium cencentration in vestibular hair cells isolated from the guinea pig. Acta Otolaryngol, 1993, Suppl 500: 46-49.
5Schuknecht HF. Pathology of the ear. 2ed. Philadelphia: Lea & Febiger, 1993. 57-69.
6Zajic G, Schact J. Comparison of isolated outer hair cells from five mammalian species. Hear Res,1987,26:249-256.
(收稿：1998-02-25 修回：1998-05-20), 百拇医药
陈雷 姜泗长 杨伟炎 友田幸一 山下敏夫
单位：100853 北京 解放军总医院耳鼻咽喉科(陈雷、姜泗长、杨伟炎)；日本关西医科大学了下鼻咽喉科(友田幸一、山下敏夫)
关键词：毛细胞；前庭；；细胞分离；；钙；；神经瘤；听
中华耳鼻咽喉科杂志980406 【摘要】 目的 进一步了解离体人前庭毛细胞的胞内钙离子(Ca2+)活动。方法 从3例经迷路听神经瘤切除术患者中采取半规管壶腹中的前庭毛细胞，用倒置显微镜观察分离出的离体前庭毛细胞形态，用Ca2+敏感的荧光染料Fura-2和数字影像显微镜监测细胞内Ca2+浓度的变化。结果 分离的前庭毛细胞主要为Ⅰ型毛细胞，可在体外存活2.5 h。用150 mmol/L K+液灌流单离的前庭毛细胞引起胞内Ca2+的显著升高，荧光比率从0.54 升至1.16；这种胞内Ca2+的升高在胞外液中Ca2+缺如的情况下消失。0.25 μmol/L Ionomycin可以引起前庭毛细胞内Ca2+的不可逆性升高，荧光比率保持在0.73。结论 人前庭毛细胞膜上存在电压敏感的Ca2+通道。
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Isolation of and intracellular calcium mobilization in vestibular hair cells of the patients with acoustic neuroma Chen Lei,Jiang Sichang,Yang Weiyan,et al.PLA General Hospital,Beijing 100853
【Abstract】 Objective To further understand the biological features of the human vestibular organ. Methods Vestibular hair cells were isolated from patients with acoustic neuroma during the surgery and intracellular free calcium concentration of the cells was monitored with calcium-sensitive dye Fura-2 and digital imaging microscopy. Results Isolated vestibular hair cells were mainly of type I and could survive about 2.5 hours in vitro. Perfusion with 150 mmol/L KCl, induced a depolarization, resulting in a temporary increase of 340 nm/380 nm ratio from 0.52 to 1.16 within 1 min. In Ca2+ free environment, 150 mmol/L KCl failed to induce intracellular calcium increase. In the presence of 2.5 μmol/L ionomycin, there was an irreversible increase in 340 nm/380 nm ratio. Conclusion Human vestibular hair cell apparenly possess voltage sensitive calcium channels. The method and observation aid in elucidating human vestibular biological features.
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【Key words】 Hair cell,vestibular Cell separation Calcium Neuroma,acoustis
前庭毛细胞是前庭系统的感受器，前庭半规管壶腹嵴毛细胞将体位变化时内淋巴的角加速运动刺激转变为电兴奋传入前庭中枢。众多实验结果表明钙离子(Ca2+)参与多种细胞生理过程，被称为第二信使。了解细胞内钙离子的活动特性，能进一步了解前庭细胞的电生理特性。已有许多文献报告了哺乳动物离体前庭毛细胞的生物学特性和胞内钙离子变化[1～4]。现报告听神经瘤患者离体前庭毛细胞的分离和胞内钙离子的活动。
材料和方法
临床资料：研究材料取自3例听神经瘤患者，其中男2例，女1例。例1 男，73岁，右耳鸣10余月，双耳感音神经性聋，右耳言语频率听阈70 dB，左耳40 dB，CT、磁共振(MRI)示右桥小脑角18 mm×10 mm占位性病变,双侧前庭功能消失。例2 女，53岁，左耳听力减退半年，左耳言语频率听阈54 dB，左侧前庭功能消失。例3 男，59岁，左耳听力减退9个月，左耳言语频率听阈70 dB，MRI示左桥小脑角直经2 cm占位性病变。
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细胞的分离：经迷路入路行听神经瘤切除术中，逐渐磨薄骨质，显露上、中、下3个半规管，取出膜性半规管及壶腹，取出的膜性半规管和壶腹置于标准生理盐液中。标准生理盐液主要成分：NaCl 150 mmol/L，KCl 5 mmol/L，Tris 0.01mol/L, K2HPO4 0.8 mmol/L，MgCl2 1 mmol/L，葡萄糖 5 mmol/L，CaCl2 1 mmol/L，pH值 7.4，渗透浓度300 Osmmol/L。于22～24℃室温下分离前庭毛细胞。在解剖显微镜下，将骨性半规管切除，保留壶腹，纵行剖开壶腹嵴对面的膜性半规管。将半规管壶腹嵴组织置于含有胶原酶0.1 g/ml，白蛋白0.02 g/ml的标准生理盐液中30 min，清洗后用显微剪刀剪成碎块，然后用毛细管轻柔吹打多次，用Fura-2/AM(Dojindo，日本)孵育30 min后观察。
将分离的前庭毛细胞置于涂有cell-Tak(1 g/L，Cosmo-Bio，日本)实验皿中，实验皿中盛有标准生理盐液300 μL，前庭毛细胞用2 μmol/L Fura-2/AM孵育30 min后观察。灌流实验是将人前庭单离毛细胞置于实验皿中，该皿容量300 μL，用头皮针分别置于实验皿两侧，一侧为入液管，一侧为出液管。用微量泵持续灌流标准生理盐液，速度300 μL/min。实验过程中各种药物均从入液管灌入。分别采用150 mmol/L K+液、无钙标准生理盐液、无钙的150 mmol/L K+液进行灌流实验。
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显微镜观察：将盛有Fura-2孵育后的前庭毛细胞实验皿置于倒置显微镜载物台上，显微镜连接高分辨微分干涉相差荧光分析系统。使用通过干涉和中性滤光片，半个滤波带宽为10 nm，激发光为波长340 nm和380 nm的75 W氙灯，然后激发光被半通透波长400 nm的二色性镜反射。从胞内发出的荧光亦透过该镜和20 nm带通，510 nm阻挡滤片。胞内钙离子浓度用波长340 nm与380 nm的荧光强度比率表示：340 nm激发光的荧光强度增加，同时380 nm激发光荧光强度减低，说明钙离子浓度升高。Fura-2/Am是一种酶化的Fura-2，它能穿过胞膜并被检测出，且对细胞无损伤。细胞内荧光被聚焦在微光摄像机上并输入胞内钙离子影像实时分析系统(Argus-100/CA，滨松光电研究所)。荧光比率系对两种激发光的影像减除背景经数学计算取得[3]。
结果
离体人前庭毛细胞分两型：Ⅰ型细胞呈烧瓶状，有细颈，颈部上方可见表皮板及其上的纤毛束，细胞颈下方为胞体，胞体内可见圆形或椭圆形的核(图1)；Ⅱ型细胞呈试管状，离体状态下在形态上难以与肿胀变性的Ⅰ型细胞相区别。
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因前庭毛细胞分离费时较多，本研究从每个壶腹中仅选1个活性良好的细胞观察胞内钙离子的变化。活性良好的细胞边缘可见双折光像，胞膜完整、光滑，纤毛存在无散乱。离体人前庭毛细胞可在体外培养液中保持活性2.5 h。
人前庭毛细胞在静息状态下，胞内钙离子的荧光比率(测4个细胞)为0.52±0.03 (
±s)。用150 mmol/L K+液灌流3个细胞,灌流开始后30 s荧光比例从0.54±0.03增至0.72±0.10；灌流开始后45 s时即达最高峰1.16±0.09；然后逐渐下降，60 s降至1.09±0.10；灌流后75 s降至1.03±0.13；灌流开始后90s时为0.97±0.13(图2)。用无钙标准生理盐液灌流前庭毛细胞，胞内钙离子迅速下降，5 min后胞内钙离子稳定于0.24。用无钙的150 mmol/L K+液灌流30 s，胞内Ca2+从0.24±0.01仅升至0.28±0.01(图3)。 , 百拇医药
图2 150 mmol/L KCl灌流诱发的人离体前庭毛细胞胞内Ca2+的变化
图3 细胞外液无Ca2+灌流150 mmol/L KCl后人离体前庭毛细胞胞内Ca2+的变化
用含有2.5 μmol/L Ionomycin的标准生理盐液灌流前庭1个毛细胞后，胞内Ca2+迅速升高，灌流30 s胞内Ca2+荧光比率从0.53升至0.65；灌流停止30 s升至0.73，此后胞内Ca2+保持一个持续性
图4 2.5 μmol/L Ionomycin灌流诱发的人离体前庭毛细胞胞内Ca2+变化升高(图4)，约10min后细胞因钙超载而死亡。讨论
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分离豚鼠等动物的离体前庭毛细胞已有报道。前庭毛细胞较耳蜗毛细胞胞体小4～5倍，离体的前庭毛细胞可分为有颈烧瓶状的Ⅰ型细胞和试管状的Ⅱ型细胞[2]。人颞骨切片亦示人前庭毛细胞分为Ⅰ型和Ⅱ型[5]。从豚鼠等动物耳分离出的前庭毛细胞多为Ⅰ型，而鉴定Ⅱ型细胞较为困难[2]。本实验中所分离出的毛细胞也主要为Ⅰ型细胞，Ⅱ型细胞与水肿变形的Ⅰ型不易区别，故只报道Ⅰ型细胞。Zajic[6]和Schacht提出正常离体细胞的形态学标准：细胞无折皱，胞浆内无颗粒，核位于细胞底，胞浆内无布朗运动。本实验所分离出的细胞形态符合上述形态学标准，表皮板上纤毛束完整。细胞可被Fura-2染色，且胞内钙离子的浓度可随外环境的刺激而变化，表明所分离出的人离体毛细胞活性良好，符合生理学实验的要求。
Fura-2荧光比率影像分析系统已用来测定内耳单细胞内钙离子浓度的变化[2，3]。对豚鼠耳蜗毛细胞，鸡、豚鼠前庭毛细胞的观察已揭示了许多耳蜗、前庭功能的机制[2～4]。1991年Ohtani[2]报道离体豚鼠前庭毛细胞在150 mmol/L K+刺激后迅速出现胞内钙离子浓度的增加，钙离子载体Ionomycin亦可使胞内钙离子浓度迅速增加，并保持一个相对的高水平。本实验观察到从听神经瘤患者颞骨中取出的前庭毛细胞对150 mmol/L K+的去极化刺激可产生胞内钙离子的迅速升高，这种胞内Ca2+的升高主要依赖于胞膜上电压依赖性Ca2+通道，钙通道的开放使胞外钙离子流入。因为胞外无钙的状态下胞内钙离子对高K+刺激的反应几乎消失，亦表明K+引起的胞内Ca2+浓度升高主要是胞外Ca2+内流所至。Ca2+载体Ionomycin可引起胞内钙离子的持续性升高。本实验的结果与以往动物前庭毛细胞的结果相似[2]。尽管人前庭毛细胞取材于听神经瘤患者，术前前庭功能低下或消失，听神经瘤系前庭神经纤维病变，对前庭毛细胞本身无直接侵犯，但对毛细胞功能的间接影响尚需进一步研究。本研究所分离人体的前庭毛细胞形态正常，离体条件可保持活性约2.5 h。人前庭毛细胞的分离和实验技术可推广应用于电生理、药理研究，以分析活的生命现象和细胞及器官功能。
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图1 离体人前庭毛细胞(I型)。×1500
参考文献
1Valat J, Devau G, Dulon D, et al. Vestibular hair cells isolated from guinea pig labyrinth. Hear Res, 1989, 40: 255-260.
2Ohtani M, Yamashita T, Amano H, et al. Isolation of and calcium mobilization in vestibular hair cells of the guinea pig. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec, 1991, 53: 82-85.
3Yamashita T, Ohnishi S, Ohtani M, et al. Effects of efferent neurotransmitters on intracellular Ca2+ concentration in vestibular hair cells of the guinea pig. Acta Otolaryngol, 1993, Suppl 500: 26-30.
, http://www.100md.com
4Ohtani M, Yamashita T, Amano H, et al. Thermal Influence on Intracellular calcium cencentration in vestibular hair cells isolated from the guinea pig. Acta Otolaryngol, 1993, Suppl 500: 46-49.
5Schuknecht HF. Pathology of the ear. 2ed. Philadelphia: Lea & Febiger, 1993. 57-69.
6Zajic G, Schact J. Comparison of isolated outer hair cells from five mammalian species. Hear Res,1987,26:249-256.
(收稿：1998-02-25 修回：1998-05-20), 百拇医药