螺旋神经节神经元原代培养及其免疫细胞化学鉴定
作者：孙建军 刘钅延
单位：100037 北京海军总医院耳鼻咽喉科(孙建军)；北京市耳鼻咽喉科研究所(刘钅延)
关键词：螺旋神经节；神经元；细胞；培养的；免疫组织化学
中华耳鼻咽喉科杂志980401 【摘要】 目的 建立成体哺乳动物耳蜗螺旋神经节神经元 (spiral ganglion neuron, SGN)体外培养的细胞模型。方法 对出生后7d的Wistar大鼠的螺旋神经节细胞进行解离与分散培养。用荧光显微镜与倒置相差显微镜观察原代培养SGN细胞的活力以及生长与分化过程。应用链霉卵白素过氧化物酶(SP)方法和抗神经丝蛋白单克隆抗体(NFP-McAb)对 SGN进行免疫细胞化学染色鉴定。结果 幼龄Wistar大鼠的SGN在体外条件下，可良好存活并有正常的表型分化，表现出稳定的神经元可塑性。其细胞数量与形态以及存活周期可满足体外实验的基本要求。结论 此方法扩大了内耳组织培养的材料来源，有助于外周听觉系统离体研究的开展。
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Primary culture and immunocytochemical identification of spiral ganglion neurons in postnatal Wistar rats Sun Jianjun*, Liu Chan.*PLA Navy General Hospital,Beijing 100037
【Abstract】 Objective To create a cytological model of spiral ganglion neurons in postnatal mammals in vitro. Methods The primary culture of spiral ganglion neurons (SGN) was carried out with seven-day postnatal Wistar rats. The process of cellular growth and differentiation of SGN were observed by fluorescent microscope and inverted/phase contrast microscopy. Immunocytochemical identification was performed on the cultured SGN of Wistar rats by methods of S-P and the monoclonal antibody of neurofilament protein ( NFP-McAb ). Results The present work showed that the dissociated SGN of Wistar rat could survive well and had a normal phenotypic differentiation in vitro. The cell amount and surviving period of SGN were able to meet the requirements of cytological experiments. The stable neuronal plasticity of SGN existed in the postnatal mammal under the present experimental conditions. Conclusion This method extends the material sources of inner ear tissue culture and provides a useful approach to the neurobiologic studies on the peripheral auditory system in vitro.
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【Key words】 Spiral ganglion Neurous Cells,cultured Immunohistochemistry
耳蜗螺旋神经节神经元(spiral ganglion neuron，SGN)培养是建立体外实验条件下观察和分析单个神经元形态与功能状态的重要手段之一。对分散培养的SGN模拟某种病理环境，可建立细胞水平的损伤模型以供体外研究。文献报告多以两栖类或鸟纲动物为对象，哺乳动物则多系胚胎材料[1，2]。鉴于生后哺乳动物的听觉神经系统的形态发育业已完成，感觉神经元的体外培养尤为困难。我们在对鸟纲动物听神经元培养的基础上[3]，选用出生后7d的大鼠进行SGN的原代培养和细胞学鉴定，报告如下。
材料与方法
1.实验动物：出生后7d发育正常的Wistar大鼠50只 (军事医学科学院动物中心提供)，分5批培养，每批10只(20耳)，取双侧螺旋神经节合并处理，以提高接种细胞密度。
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2.培养液制备：选用适于神经组织培养的DMEM(Gibco，美国)合成培养基，加入10%灭活胎牛血清(Sigma，美国)，青霉素100 000 IU/L，用5.6%NaHCO3调节pH至7.2，经0.22 μm微孔滤膜除菌。
3.螺旋神经节的解离与细胞悬液制备：体视显微镜下开放听泡，将耳蜗组织完整取出，置入预冷D-Hank液中。高倍镜下分离并除去耳蜗外侧壁组织与骨性蜗轴，同样方法分离对侧。操作过程在无菌条件下进行。将分离后的螺旋神经节组织依次加入胶原酶与胰蛋白酶(Sigma，美国)，37℃水浴消化，吹打分散、离心后加入含有血清的培养液充分混合。倒置显微镜下细胞计数， 将接种的密度控制在(8～10)×107/L范围。
4.细胞活力判定：倒置显微镜下观察细胞活力，每批取100 μL细胞悬液加入乙酰乙酸荧光素 (Sigma，美国) 和碘化丙锭(Sigma，美国)室温下滴染，荧光显微镜( Reichert，美国)观察。
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5.SGN原代培养：巴士德吸管取细胞悬液接种于多聚赖氨酸处理的15 mm培养板 (Costar，美国) 内，在37℃，5%CO2全自动恒温箱中静置培养，贴壁后加入DMEM胎牛血清(FCS)，培养周期5～7d。
6. 免疫细胞化学染色：培养终止后，用抗神经丝蛋白 (neurofilament protein，NFP)单克隆抗体(Zymed，美国)，按SP(链霉卵白素过氧化物酶，Zymed，美国)程序对SGN进行了免疫细胞化学反应，经DAB显色后光镜观察。阴性对照样品用磷酸缓冲液(pH 7.4)代替一抗反应，其余步骤相同(试剂由北京中山公司提供)。
结果
5批大鼠SGN的单离培养均成功。
1.细胞活力观察：在倒置相差显微镜下用改良Neubauer计数板观察计数。活细胞呈圆形，胞体透明、边缘光滑、双折光性良好。存活细胞占细胞总数的(85±7.3)%(±s)。荧光双重染色后经激发光作用，可见 SGN活细胞呈明亮的黄绿色，椭圆形胞体与双极神经突起结构十分清晰(图1)。
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2.培养细胞形态观察：接种后6 h，已有部分细胞贴壁并生长，多数为分散的单细胞，少数呈团状分布。SGN可以直接贴附于多聚赖氨酸基质表面生长， 亦可附着在成纤维细胞形成的单层细胞“毯”的表面生长。培养12 h后贴壁完成并过渡为极性细胞。贴壁细胞单层排列，胞体透明，胞浆匀质，折光性能良好。培养24 h，多数SGN呈典型的双极神经元形态，胞体两极的轴丘部伸出神经突起。存活SGN数为每孔(24.42±3.87)个(
±s)。培养48～72 h后，细胞进一步分化，可见膨体、生长锥结构(图2)，每孔存活SGN达(28.26±5.4)个。培养5～7 d， SGN突起延长并相互交织，每孔存活SGN为(26.02±6.04)个。经测量轴突长度为35.34～62.42 μm，平均为(52.04±8.02)μm。此外，还发现少量SGN有3极神经突起。按文献标准，轴突长度大于胞体直径5倍者为SGN[3]。
3.免疫细胞化学染色：为在形态学上定性SGN，我们采用神经元特异性标志蛋白——NFP为观察指标，对大鼠SGN作免疫细胞化学染色。阳性反应细胞呈棕黄色，SGN全细胞着色，椭圆形胞体和神经突起十分清晰(图3)。长梭状Schwann细胞与扁平多角形的成纤维细胞呈NFP染色阴性反应。
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讨论
哺乳动物(如大鼠、豚鼠)的SGN属高分化终末细胞(terminal cell)，出生时其形态发育已基本完成，故又称永久细胞。出生后个体SGN的体外培养十分困难，使有关的离体研究受到限制。由于内耳损害(如药物中毒、噪声)所致的听神经病变多发生在出生后，选择这一时期的哺乳动物为受试对象更符合研究的需要。
耳蜗螺旋神经节的细胞成分除SGN外，还有Schwann细胞、成纤维细胞和内皮细胞等非神经元成分，对其进行的细胞培养属于混合型细胞培养，在培养中应根据细胞形态和生长方式的不同加以区别。我们观察到，早期贴壁细胞以成纤维细胞为主，Schwann细胞次之。 这些非神经元细胞呈指数生长，可形成细胞“毯”，并有接触性抑制现象。SGN特征为多数呈典型的双极神经元，少数有3极突起。 有作者认为双极SGN为螺旋神经节Ⅰ型细胞，而多极突起SGN可能为Ⅱ型细胞，尚有待证实[4]。为准确定性，我们应用NFP单克隆抗体对SGN进行了免疫细胞化学染色。NFP是神经元细胞骨架中等纤维的重要组份之一，在SGN胞体及突起等部均有分布，是鉴别SGN的标志性蛋白[5]。根据NFP分子量不同，可分为68 000(L)、160 000(M) 和200 000(H) 3种。本研究所用NFP单抗含上述3种亚单位，结合SP技术(灵敏度为ABC法的4～8倍)提高了反应的敏感性。
, 百拇医药
实验结果表明，在本组报告的有血清培养条件下，解离后的大鼠SGN仍可在体外存活，并出现正常的表型分化(包括胞体形态、轴突生长以及标志蛋白的表达)。提示：完成形态发育并已高度分化的SGN，经机械分离和酶解处理后仍具有稳定的神经元可塑性(neuronal plasticity)和轴突修复能力，其细胞形态、生存数量和存活时间均能满足体外实验的基本要求，可作为听神经体外实验(如药物作用、细胞电生理、分子生物学等实验)的理想材料。成体哺乳动物耳蜗SGN体外培养的方法扩大了内耳组织培养的材料来源，为外周听觉系统离体研究工作的开展提供了新的手段。
图1 解离后大鼠SGN的荧光染色。FDA/PI×800 图2 培养48小时后大鼠SGN倒置/相差显微镜像。空心箭头为分化良好的Schwann细胞。phaseⅡ×200 图3 培养大鼠SGN免疫细胞化学染色。红箭头为呈阳性反应的SGN，白尖头为纤维细胞。NFP×400
, 百拇医药
国家博士后科学基金资助项目(0964317)
参考文献
1Ard MD, Morest DK, Hauger SH. Trophic interactions between the cochleo vestibuar ganglion of the chick embryo and its synaptic targets in culture. Neuroscience, 1985,16:151-170.
2Hemond SG, Morest DK. Trophic effects of otic epithelium on cochleo- vestibular ganglion fiber growth in vitro. Anat Rec, 1992,232:273-284.
3孙建军,汪吉宝,李桂榕.生长因子对离体听神经元存活与轴突再生的影响.中华耳鼻咽喉科杂志,1996,31:274-276.
, 百拇医药
4Ross MD, Burkel W. Multipolar neurons in spiral ganglion of the rat. Acta Otolaryngol, 1973,76:381-394.
5Kuijpers W, Tonnaer ELG, Peter TA, et al. Expression of intermediate filament proteins in the mature inner ear of the rat and guinea pig. Hear Res,1991,52:133-146.
(收稿：1997-08-07 修回：1998-04-28), 百拇医药
单位：100037 北京海军总医院耳鼻咽喉科(孙建军)；北京市耳鼻咽喉科研究所(刘钅延)
关键词：螺旋神经节；神经元；细胞；培养的；免疫组织化学
中华耳鼻咽喉科杂志980401 【摘要】 目的 建立成体哺乳动物耳蜗螺旋神经节神经元 (spiral ganglion neuron, SGN)体外培养的细胞模型。方法 对出生后7d的Wistar大鼠的螺旋神经节细胞进行解离与分散培养。用荧光显微镜与倒置相差显微镜观察原代培养SGN细胞的活力以及生长与分化过程。应用链霉卵白素过氧化物酶(SP)方法和抗神经丝蛋白单克隆抗体(NFP-McAb)对 SGN进行免疫细胞化学染色鉴定。结果 幼龄Wistar大鼠的SGN在体外条件下，可良好存活并有正常的表型分化，表现出稳定的神经元可塑性。其细胞数量与形态以及存活周期可满足体外实验的基本要求。结论 此方法扩大了内耳组织培养的材料来源，有助于外周听觉系统离体研究的开展。
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Primary culture and immunocytochemical identification of spiral ganglion neurons in postnatal Wistar rats Sun Jianjun*, Liu Chan.*PLA Navy General Hospital,Beijing 100037
【Abstract】 Objective To create a cytological model of spiral ganglion neurons in postnatal mammals in vitro. Methods The primary culture of spiral ganglion neurons (SGN) was carried out with seven-day postnatal Wistar rats. The process of cellular growth and differentiation of SGN were observed by fluorescent microscope and inverted/phase contrast microscopy. Immunocytochemical identification was performed on the cultured SGN of Wistar rats by methods of S-P and the monoclonal antibody of neurofilament protein ( NFP-McAb ). Results The present work showed that the dissociated SGN of Wistar rat could survive well and had a normal phenotypic differentiation in vitro. The cell amount and surviving period of SGN were able to meet the requirements of cytological experiments. The stable neuronal plasticity of SGN existed in the postnatal mammal under the present experimental conditions. Conclusion This method extends the material sources of inner ear tissue culture and provides a useful approach to the neurobiologic studies on the peripheral auditory system in vitro.
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【Key words】 Spiral ganglion Neurous Cells,cultured Immunohistochemistry
耳蜗螺旋神经节神经元(spiral ganglion neuron，SGN)培养是建立体外实验条件下观察和分析单个神经元形态与功能状态的重要手段之一。对分散培养的SGN模拟某种病理环境，可建立细胞水平的损伤模型以供体外研究。文献报告多以两栖类或鸟纲动物为对象，哺乳动物则多系胚胎材料[1，2]。鉴于生后哺乳动物的听觉神经系统的形态发育业已完成，感觉神经元的体外培养尤为困难。我们在对鸟纲动物听神经元培养的基础上[3]，选用出生后7d的大鼠进行SGN的原代培养和细胞学鉴定，报告如下。
材料与方法
1.实验动物：出生后7d发育正常的Wistar大鼠50只 (军事医学科学院动物中心提供)，分5批培养，每批10只(20耳)，取双侧螺旋神经节合并处理，以提高接种细胞密度。
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2.培养液制备：选用适于神经组织培养的DMEM(Gibco，美国)合成培养基，加入10%灭活胎牛血清(Sigma，美国)，青霉素100 000 IU/L，用5.6%NaHCO3调节pH至7.2，经0.22 μm微孔滤膜除菌。
3.螺旋神经节的解离与细胞悬液制备：体视显微镜下开放听泡，将耳蜗组织完整取出，置入预冷D-Hank液中。高倍镜下分离并除去耳蜗外侧壁组织与骨性蜗轴，同样方法分离对侧。操作过程在无菌条件下进行。将分离后的螺旋神经节组织依次加入胶原酶与胰蛋白酶(Sigma，美国)，37℃水浴消化，吹打分散、离心后加入含有血清的培养液充分混合。倒置显微镜下细胞计数， 将接种的密度控制在(8～10)×107/L范围。
4.细胞活力判定：倒置显微镜下观察细胞活力，每批取100 μL细胞悬液加入乙酰乙酸荧光素 (Sigma，美国) 和碘化丙锭(Sigma，美国)室温下滴染，荧光显微镜( Reichert，美国)观察。
, http://www.100md.com
5.SGN原代培养：巴士德吸管取细胞悬液接种于多聚赖氨酸处理的15 mm培养板 (Costar，美国) 内，在37℃，5%CO2全自动恒温箱中静置培养，贴壁后加入DMEM胎牛血清(FCS)，培养周期5～7d。
6. 免疫细胞化学染色：培养终止后，用抗神经丝蛋白 (neurofilament protein，NFP)单克隆抗体(Zymed，美国)，按SP(链霉卵白素过氧化物酶，Zymed，美国)程序对SGN进行了免疫细胞化学反应，经DAB显色后光镜观察。阴性对照样品用磷酸缓冲液(pH 7.4)代替一抗反应，其余步骤相同(试剂由北京中山公司提供)。
结果
5批大鼠SGN的单离培养均成功。
1.细胞活力观察：在倒置相差显微镜下用改良Neubauer计数板观察计数。活细胞呈圆形，胞体透明、边缘光滑、双折光性良好。存活细胞占细胞总数的(85±7.3)%(±s)。荧光双重染色后经激发光作用，可见 SGN活细胞呈明亮的黄绿色，椭圆形胞体与双极神经突起结构十分清晰(图1)。
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2.培养细胞形态观察：接种后6 h，已有部分细胞贴壁并生长，多数为分散的单细胞，少数呈团状分布。SGN可以直接贴附于多聚赖氨酸基质表面生长， 亦可附着在成纤维细胞形成的单层细胞“毯”的表面生长。培养12 h后贴壁完成并过渡为极性细胞。贴壁细胞单层排列，胞体透明，胞浆匀质，折光性能良好。培养24 h，多数SGN呈典型的双极神经元形态，胞体两极的轴丘部伸出神经突起。存活SGN数为每孔(24.42±3.87)个(
±s)。培养48～72 h后，细胞进一步分化，可见膨体、生长锥结构(图2)，每孔存活SGN达(28.26±5.4)个。培养5～7 d， SGN突起延长并相互交织，每孔存活SGN为(26.02±6.04)个。经测量轴突长度为35.34～62.42 μm，平均为(52.04±8.02)μm。此外，还发现少量SGN有3极神经突起。按文献标准，轴突长度大于胞体直径5倍者为SGN[3]。3.免疫细胞化学染色：为在形态学上定性SGN，我们采用神经元特异性标志蛋白——NFP为观察指标，对大鼠SGN作免疫细胞化学染色。阳性反应细胞呈棕黄色，SGN全细胞着色，椭圆形胞体和神经突起十分清晰(图3)。长梭状Schwann细胞与扁平多角形的成纤维细胞呈NFP染色阴性反应。
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哺乳动物(如大鼠、豚鼠)的SGN属高分化终末细胞(terminal cell)，出生时其形态发育已基本完成，故又称永久细胞。出生后个体SGN的体外培养十分困难，使有关的离体研究受到限制。由于内耳损害(如药物中毒、噪声)所致的听神经病变多发生在出生后，选择这一时期的哺乳动物为受试对象更符合研究的需要。
耳蜗螺旋神经节的细胞成分除SGN外，还有Schwann细胞、成纤维细胞和内皮细胞等非神经元成分，对其进行的细胞培养属于混合型细胞培养，在培养中应根据细胞形态和生长方式的不同加以区别。我们观察到，早期贴壁细胞以成纤维细胞为主，Schwann细胞次之。 这些非神经元细胞呈指数生长，可形成细胞“毯”，并有接触性抑制现象。SGN特征为多数呈典型的双极神经元，少数有3极突起。 有作者认为双极SGN为螺旋神经节Ⅰ型细胞，而多极突起SGN可能为Ⅱ型细胞，尚有待证实[4]。为准确定性，我们应用NFP单克隆抗体对SGN进行了免疫细胞化学染色。NFP是神经元细胞骨架中等纤维的重要组份之一，在SGN胞体及突起等部均有分布，是鉴别SGN的标志性蛋白[5]。根据NFP分子量不同，可分为68 000(L)、160 000(M) 和200 000(H) 3种。本研究所用NFP单抗含上述3种亚单位，结合SP技术(灵敏度为ABC法的4～8倍)提高了反应的敏感性。
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实验结果表明，在本组报告的有血清培养条件下，解离后的大鼠SGN仍可在体外存活，并出现正常的表型分化(包括胞体形态、轴突生长以及标志蛋白的表达)。提示：完成形态发育并已高度分化的SGN，经机械分离和酶解处理后仍具有稳定的神经元可塑性(neuronal plasticity)和轴突修复能力，其细胞形态、生存数量和存活时间均能满足体外实验的基本要求，可作为听神经体外实验(如药物作用、细胞电生理、分子生物学等实验)的理想材料。成体哺乳动物耳蜗SGN体外培养的方法扩大了内耳组织培养的材料来源，为外周听觉系统离体研究工作的开展提供了新的手段。
图1 解离后大鼠SGN的荧光染色。FDA/PI×800 图2 培养48小时后大鼠SGN倒置/相差显微镜像。空心箭头为分化良好的Schwann细胞。phaseⅡ×200 图3 培养大鼠SGN免疫细胞化学染色。红箭头为呈阳性反应的SGN，白尖头为纤维细胞。NFP×400
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国家博士后科学基金资助项目(0964317)
参考文献
1Ard MD, Morest DK, Hauger SH. Trophic interactions between the cochleo vestibuar ganglion of the chick embryo and its synaptic targets in culture. Neuroscience, 1985,16:151-170.
2Hemond SG, Morest DK. Trophic effects of otic epithelium on cochleo- vestibular ganglion fiber growth in vitro. Anat Rec, 1992,232:273-284.
3孙建军,汪吉宝,李桂榕.生长因子对离体听神经元存活与轴突再生的影响.中华耳鼻咽喉科杂志,1996,31:274-276.
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4Ross MD, Burkel W. Multipolar neurons in spiral ganglion of the rat. Acta Otolaryngol, 1973,76:381-394.
5Kuijpers W, Tonnaer ELG, Peter TA, et al. Expression of intermediate filament proteins in the mature inner ear of the rat and guinea pig. Hear Res,1991,52:133-146.
(收稿：1997-08-07 修回：1998-04-28), 百拇医药