内耳缺血对一氧化氮合酶在耳蜗表达的影响
作者：周波 李学佩
单位：100083 北京医科大学第三临床医院耳鼻咽喉科
关键词：
中华耳鼻咽喉科杂志980520 一氧化氮(NO)是一种重要的神经递质或调质及血管活性物质，在机体内广泛参与生理调节，影响多种疾病的病理生理过程。本文研究内耳缺血对耳蜗NOS(nitric Oxide synthese, 一氧化氮合酶)mRNA表达的影响，从分子水平探讨耳蜗缺血条件下NO作用机制。
一、材料与方法
实验动物与分组：健康纯白红目豚鼠35只，雌雄不拘，体重380～450 g，由军事医学科学院动物中心提供。实验分成实验1组：内耳缺血4 h；2组：内耳缺血8 h；正常对照组各10只，另5只在实验中死亡。
, http://www.100md.com
采用李学佩等[1]设计制作的椎基底动脉脑缺血动物模型，造成供血脑区和内耳缺血。常规制备耳蜗和小脑组织冰冻切片，后者作组化染色正常对照。
耳蜗及小脑组织NADPH-黄递酶组织化学常规染色，光镜下观察并照相。
耳蜗NOSmRNA原位杂交：NOS寡聚核苷酸引物由中国科学院微生物所合成。本实验室构建NOScDNA-PGEM-3ZF(+)重组质粒，分别经EcoRI和HindⅢ酶切获得线性化DNA模板，用SP6 RNA和T7RNA 聚合酶转录合成出与靶mRNA序列互补或相同的反、正义链RNA，用于探测靶mRNA或对照。用随机引物制备32PNOScDNA探针。耳蜗冰冻切片经预处理后，用Dig标记的NOScRNA反义链和正义链探针进行杂交、显色、镜检、照相。
Northern印迹杂交：将同一组豚鼠10只耳蜗合并，提取耳蜗总RNA。各组取总RNA 30 μg，经甲醛变性凝胶电泳和毛细管法转膜，用32P标记的cNOScDNA探针进行Northern印迹杂交，经图像分析仪扫描定量。
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二、结果
1. 耳蜗和小脑NADPH-黄递酶组织化学染色：实验1、2组和正常对照组耳蜗各回内、外毛细胞(IHC、OHC)、螺旋神经节细胞(SGC) 及血管纹边缘细胞，胞浆可见阳性蓝色反应(图1)，小脑神经元胞浆及突起也呈阳性蓝色反应(图2)。
2. 耳蜗NOSmRNA原位杂交：cNOS-cRNA反义链探针杂交，在实验1、2组和正常对照组耳蜗各回IHC、OHC和SGC胞浆内均可见蓝紫色阳性染色颗粒，各组染色无明显差别，各组血管纹未见阳性染色颗粒(图3～5)。cNOScRNA正义链探针对照杂交，实验和正常对照组上述各部位均未见阳性染色颗粒。
3. Northern印迹杂交：图像分析仪扫描结果显示，实验1、2组和正常对照组的平均吸光度(A)分别为0.2433、0.2460和0.2722，而积分光密度值(IOD)则有差异，分别为1993.0、2189.0和812.2。两实验组间IOD较为接近，与对照组有较大差异。
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三、讨论
脑缺血时，贮存于突触前部的谷氨酸大量释放，引起突触后膜上的N-甲基右旋天门冬氨酸受体过度激动，同时激活过量的NOS，产生过量的NO，可能以其自由基活性而对神经元产生毒害[2]。实验研究发现，NO参与谷氨酸对原代培养的脑皮层的神经毒性，NOS抑制剂能阻止由N-甲基右旋天门冬氨酸和相关的兴奋性氨基酸引起的神经中毒，这个效应能被L-精氨酸逆转。NO不仅能介导中枢神经系统兴奋性氨基酸受体过度激动引起的神经中毒，在急性缺血耳蜗也可发生类似于脑缺血时兴奋性氨基酸受体过度激动引起的神经中毒。NO在其中起重要的介导作用。
NO作为血管内皮舒张因子在内耳微循环调节中起重要作用，已证实耳蜗微循环中确实存在NOS，经血管内皮合成释放后，通过激活鸟苷酸环化酶提高血管平滑肌细胞内cGMP(环磷酸鸟苷)水平，引起平滑肌舒张，产生舒血管效应，参与维持血管床静息张力和血流调节。另外，NO还能通过激活血小板内鸟苷酸环化酶，升高cGMP水平，抑制血小板聚集。Brechtelsbauer等[3](1994)证实经静脉给予NOS竞争性抑制剂或NOS的天然底物L-精氨酸，则能降低或提高耳蜗血流。
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图1 实验组耳蜗第二回蜗管可见IHC、OHC、SGC血管纹边缘细胞和神经纤维呈蓝色阳性染色颗粒。NADPH-黄递酶组化染色×100
图2小脑阳性对照神经元胞浆呈蓝色阳性染色，由神经元胞体发出的突起清晰可见。NADPH-黄递酶给化染色×100
图3原位杂交实验Corti器IHC、OHC胞浆中可见蓝色阳性颗粒。×200
图4株位杂交血管纹边缘细胞元阳性染色。×200图5原位杂交实验组螺旋神经节细细胞胞浆中可见丰富的蓝紫色阳性颗粒。×100
本文为卫生部科研基金资助项目
参考文献
1 李学佩，马芙蓉，王伟，等.椎基底动脉脑缺血动物模型.北京医科大学学报.1995, 27:427-429.
2 Choi DW. Glutamate neurotoxicity and diseases of the nervous system. Neuron,1988,1:623-634.
3 Brechtelsbauer PB, Nuttall AL, Millar JM. Basal nitric oxide production in regulation of cochlear blood flow. Hear Res,1994,77:38-42.
(收稿：1997-12-04 修回：1998-06-20), http://www.100md.com
单位：100083 北京医科大学第三临床医院耳鼻咽喉科
关键词：
中华耳鼻咽喉科杂志980520 一氧化氮(NO)是一种重要的神经递质或调质及血管活性物质，在机体内广泛参与生理调节，影响多种疾病的病理生理过程。本文研究内耳缺血对耳蜗NOS(nitric Oxide synthese, 一氧化氮合酶)mRNA表达的影响，从分子水平探讨耳蜗缺血条件下NO作用机制。
一、材料与方法
实验动物与分组：健康纯白红目豚鼠35只，雌雄不拘，体重380～450 g，由军事医学科学院动物中心提供。实验分成实验1组：内耳缺血4 h；2组：内耳缺血8 h；正常对照组各10只，另5只在实验中死亡。
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采用李学佩等[1]设计制作的椎基底动脉脑缺血动物模型，造成供血脑区和内耳缺血。常规制备耳蜗和小脑组织冰冻切片，后者作组化染色正常对照。
耳蜗及小脑组织NADPH-黄递酶组织化学常规染色，光镜下观察并照相。
耳蜗NOSmRNA原位杂交：NOS寡聚核苷酸引物由中国科学院微生物所合成。本实验室构建NOScDNA-PGEM-3ZF(+)重组质粒，分别经EcoRI和HindⅢ酶切获得线性化DNA模板，用SP6 RNA和T7RNA 聚合酶转录合成出与靶mRNA序列互补或相同的反、正义链RNA，用于探测靶mRNA或对照。用随机引物制备32PNOScDNA探针。耳蜗冰冻切片经预处理后，用Dig标记的NOScRNA反义链和正义链探针进行杂交、显色、镜检、照相。
Northern印迹杂交：将同一组豚鼠10只耳蜗合并，提取耳蜗总RNA。各组取总RNA 30 μg，经甲醛变性凝胶电泳和毛细管法转膜，用32P标记的cNOScDNA探针进行Northern印迹杂交，经图像分析仪扫描定量。
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二、结果
1. 耳蜗和小脑NADPH-黄递酶组织化学染色：实验1、2组和正常对照组耳蜗各回内、外毛细胞(IHC、OHC)、螺旋神经节细胞(SGC) 及血管纹边缘细胞，胞浆可见阳性蓝色反应(图1)，小脑神经元胞浆及突起也呈阳性蓝色反应(图2)。
2. 耳蜗NOSmRNA原位杂交：cNOS-cRNA反义链探针杂交，在实验1、2组和正常对照组耳蜗各回IHC、OHC和SGC胞浆内均可见蓝紫色阳性染色颗粒，各组染色无明显差别，各组血管纹未见阳性染色颗粒(图3～5)。cNOScRNA正义链探针对照杂交，实验和正常对照组上述各部位均未见阳性染色颗粒。
3. Northern印迹杂交：图像分析仪扫描结果显示，实验1、2组和正常对照组的平均吸光度(A)分别为0.2433、0.2460和0.2722，而积分光密度值(IOD)则有差异，分别为1993.0、2189.0和812.2。两实验组间IOD较为接近，与对照组有较大差异。
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三、讨论
脑缺血时，贮存于突触前部的谷氨酸大量释放，引起突触后膜上的N-甲基右旋天门冬氨酸受体过度激动，同时激活过量的NOS，产生过量的NO，可能以其自由基活性而对神经元产生毒害[2]。实验研究发现，NO参与谷氨酸对原代培养的脑皮层的神经毒性，NOS抑制剂能阻止由N-甲基右旋天门冬氨酸和相关的兴奋性氨基酸引起的神经中毒，这个效应能被L-精氨酸逆转。NO不仅能介导中枢神经系统兴奋性氨基酸受体过度激动引起的神经中毒，在急性缺血耳蜗也可发生类似于脑缺血时兴奋性氨基酸受体过度激动引起的神经中毒。NO在其中起重要的介导作用。
NO作为血管内皮舒张因子在内耳微循环调节中起重要作用，已证实耳蜗微循环中确实存在NOS，经血管内皮合成释放后，通过激活鸟苷酸环化酶提高血管平滑肌细胞内cGMP(环磷酸鸟苷)水平，引起平滑肌舒张，产生舒血管效应，参与维持血管床静息张力和血流调节。另外，NO还能通过激活血小板内鸟苷酸环化酶，升高cGMP水平，抑制血小板聚集。Brechtelsbauer等[3](1994)证实经静脉给予NOS竞争性抑制剂或NOS的天然底物L-精氨酸，则能降低或提高耳蜗血流。
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图1 实验组耳蜗第二回蜗管可见IHC、OHC、SGC血管纹边缘细胞和神经纤维呈蓝色阳性染色颗粒。NADPH-黄递酶组化染色×100
图2小脑阳性对照神经元胞浆呈蓝色阳性染色，由神经元胞体发出的突起清晰可见。NADPH-黄递酶给化染色×100
图3原位杂交实验Corti器IHC、OHC胞浆中可见蓝色阳性颗粒。×200
图4株位杂交血管纹边缘细胞元阳性染色。×200图5原位杂交实验组螺旋神经节细细胞胞浆中可见丰富的蓝紫色阳性颗粒。×100
本文为卫生部科研基金资助项目
参考文献
1 李学佩，马芙蓉，王伟，等.椎基底动脉脑缺血动物模型.北京医科大学学报.1995, 27:427-429.
2 Choi DW. Glutamate neurotoxicity and diseases of the nervous system. Neuron,1988,1:623-634.
3 Brechtelsbauer PB, Nuttall AL, Millar JM. Basal nitric oxide production in regulation of cochlear blood flow. Hear Res,1994,77:38-42.
(收稿：1997-12-04 修回：1998-06-20), http://www.100md.com