人体前庭终器γ-氨基丁酸能神经免疫细胞化学研究
作者：孔维佳 Burkhard Hussl Annelies Schrott-Fischer
单位：奥地利 因斯布鲁克大学医学院；同济医科大学附属协和医院(孔维佳通讯地址：430022 武汉 同济医科大学附属协和医院耳鼻咽喉科)
关键词：前庭；神经末梢；GABA(受体；GABA-A)；神经元；传出；人类
中华耳鼻咽喉科杂志/990101 【摘要】 目的 探讨γ-氨基丁酸(gama-aminobutyric acid，GABA)能神经在人体前庭终器的分布。方法 应用包埋前染色免疫电镜技术，以抗GABA抗体为标记物，观察5例尸体GABA能神经在前庭终器的超微定位。结果 发现GABA免疫反应定位于富含突触小泡的神经末梢及无髓鞘神经纤维。GABA免疫反应阳性神经纤维与包绕Ⅰ型前庭毛细胞的传入神经盏形成突触。前庭毛细胞、传入神经盏及传入神经呈GABA染色阴性。结论 GABA能神经属前庭传出神经系统。
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Immunocytochemical study of gama-aminobutyric acid-ergic innervation in the end-organs of human vestibule KONG Weijia*, Burkhard Hussl, Annelies Schrott-Fischer. University of Innsbruck, Austria and* Department of Otorhinolaryngology Union Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022
【Abstract】 Objective To investigate γ-aminobutyric acid-ergic(GABAergic) innervation in the end-organs of human vestibule.Methods A modified pre-embedding immunostaining technique of immunoelectron microscopy were applied to accomplish this study with a polyclonal antibody to γ-aminobutyric acid.Results GABA-immunoreactive products were confined to the nerve terminals, which were rich in synaptic vesicles and the non-myelinated fibers. The GABA-immunoreactive nerve fibers synapse with afferent calices surrounding the type I hair cells.Conclusion This study shows that GABAergic fibers of human vestibular end-organs belong to the vestibular efferent system.
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【Key words】 Vestibule Nerve endings GABA(Receptors, GABA-A) Neurons,efferent Human
前庭传入神经系统将前庭毛细胞感受到的刺激信号传入脑干各相关神经核团、小脑以及大脑皮层，参与维持机体平衡。同时前庭感觉末梢器官接受前庭传出神经系统的神经支配。迄今前庭传出神经系统的构成成分、支配类型、递质种类及其功能意义尚未彻底阐明。最近我们观察了胆碱能神经在人体前庭终器感觉上皮的超微定位[1-3]。然而，γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)在前庭终器的定位及其功能的研究结果并没有达到统一，更缺乏GABA在人体前庭末梢器官定位研究的资料。本研究旨在探讨GABA在人体前庭终器的超微定位，为阐明GABA在前庭系统的功能作用提供化学神经解剖学基础。
材料与方法
1.供体内耳：5例内耳标本供体为死于头颈部肿瘤晚期恶液质、大出血等患者，生前无中耳和内耳疾患，在死亡后2 h内行内耳灌注固定，左、右耳分别以5%戊二醛二甲胂酸缓冲固定液(固定液A)或1.25%戊二醛-1%多聚甲醛磷酸缓冲固定液(固定液B)灌注固定后，在尸检室取出双侧颞骨标本，左右颞骨标本分别在与灌注固定相同的固定液中进一步浸泡固定20 h，解剖显微镜下解剖出前庭囊斑及壶腹嵴，按其固定液种类分别在0.1 mol/L二甲胂酸缓冲液或磷酸缓冲液(PBS)中漂洗后，供免疫细胞化学染色。
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2.抗GABA抗体免疫细胞化学染色：供体前庭末梢器官按固定液不同而分为A，B两组，采用PAP(peroxidase-anti-peroxidase)法作包埋前免疫细胞化学染色。简述步骤如下：①30%羊血清-1%小牛血清蛋白室温封闭30 min；②兔抗GABA抗体(1∶100，A组使用法国Immuno Tech公司，B组使用美国Chemicon Internatilnal公司产品)4℃孵育24 h；③羊抗兔IgG(1∶40，美国ICN Biomedicals公司)室温孵育2 h；④兔PAP复合物(1∶100，美国Jackson Immuno Research Laboratories公司)室温孵化2 h；⑤DAB(3，3’-diaminobenzidine)-过氧化氢-氯化钴增强显色。以上步骤之间用缓冲液漂洗3次，每次10 min。
在各次重复实验中，用大鼠前庭终器标本作为阳性对照染色，用正常兔血清取代兔抗GABA抗体作为阴性对照染色。
3.标本包埋及观察：将经免疫细胞化学染色处理的标本按常规方法行梯度酒精脱水、Spurr树脂塑料包埋。Reichert-Jung切片机上行半薄切片，光镜下观察、定位，超薄切片。超薄切片标本在Jeol 100-C透射电镜下观察。
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结果
本实验选用两个不同生物制品公司生产的商品化的兔抗GABA抗体，是为了比较抗体染色的特异性，旨在确证实验结果的可靠性。固定液A及固定液B的设置是根据不同生物制品公司的兔抗GABA抗体的特性而决定的。实验结果表明，该2个生物制品公司的兔抗GABA抗体染色类型完全相同。人体前庭感觉上皮抗GABA抗体阳性染色位于富含突触小泡的神经末梢及神经纤维。呈抗GABA抗体免疫染色阳性反应的神经末梢与传入神经盏形成突触联系(图1)，在高倍电镜下观察见GABA免疫反应产物位于突触小泡(图2，3)。Ⅰ型毛细胞、Ⅱ型毛细胞、杯状环绕Ⅰ型毛细胞的传入神经盏(图1)以及传入神经纤维(图3)抗GABA抗体染色阴性。在基底膜以下的组织内，可见抗GABA抗体染色阳性的神经纤维为无髓鞘纤维，而有髓鞘的传入神经纤维呈阴性染色(图4)。前庭囊斑及壶腹嵴染色类型相同。
图1 人体椭圆囊斑感觉上皮抗GABA抗体免疫电镜照片。示GABA阳性染色的神经末梢(↑)与传入神经盏(ch)呈突触联系。Ⅰ型毛细胞(Ⅰ)胞体顶浆内可见色素沉着。×3 600
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图2 为图1局部之高倍电镜照片。 示GABA免疫染色阳性反应产物位于突触小泡。ch 传入神经盏。×17 500
图3 人体前庭感觉上皮基底膜区域抗GABA抗体免疫电镜照片示GABA免疫染色阳性神经纤维内充满突触小泡(▲), 而不含突触小泡的传入神经纤维(↑)呈GABA染色阴性。×9 000
图4 人体椭圆囊斑感觉上皮基底膜下方组织免疫电镜照片示抗GABA抗体染色阳性的神经纤维为无髓鞘神经纤维(↑)。有髓鞘神经纤维(A)染色阴性。×8 000
在免疫细胞化学染色重复实验中，用作阳性对照染色的大鼠前庭终器标本，其GABA染色结果与文献[4]一致，而所有阴性对照染色标本全部未显染色。
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讨论
Flock和Lam 1974年首次提出GABA可能是前庭感觉末梢器官的传入神经递质，20余年以来，许多学者致力于探讨GABA在前庭感觉末梢器官的结构定位及功能作用。Usami等[5]报道鸡前庭毛细胞抗GABA抗体免疫染色呈阳性反应，认为GABA可能是鸡的前庭传入神经递质。此后，Usami等[6]又报道了鼠猴(squirrel monkey)前庭GABA免疫染色与鸡前庭相矛盾的实验结果，他们发现鼠猴前庭毛细胞抗GABA抗体免疫染色呈阴性反应，而神经纤维呈阳性反应。Lopez等[7]的豚鼠实验结果亦支持有关GABA是前庭传入神经递质的学说。然而，上述动物实验研究皆局限于光镜水平。我们用免疫电镜技术观察发现GABA是大鼠前庭传出神经递质[4]。本研究选用2种来自不同生物制品公司生产的GABA抗体，获得一致的GABA免疫染色反应结果，发现GABA存在于人体前庭终器，其呈GABA免疫染色阳性反应的神经纤维和神经末梢属于前庭传出神经系统，表明GABA是人体前庭传出神经递质。
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前庭传出神经纤维进入前庭终器感觉上皮层后分支支配毛细胞。一般认为它与Ⅰ型毛细胞无直接接触，而以轴-树突触形式与包绕Ⅰ型毛细胞的传入神经盏相接触或直接与Ⅱ型毛细胞形成轴-体突触联系。本实验发现人体前庭终器GABA能神经传出神经仅与包绕Ⅰ型毛细胞的传入神经盏形成突触联系，未发现GABA能传出神经直接与Ⅱ型毛细胞形成突触。GABA能传出神经在人体前庭终器的神经支配类型与大鼠前庭终器GABA能神经支配类型相似[4]。另外，人体前庭胆碱能神经对Ⅰ型及Ⅱ型前庭毛细胞都有神经支配[2，3]，GABA能传出神经与胆碱能神经支配类型不同。本实验结果表明，GABA能传出神经是人体前庭传出神经的组成部分之一。
哺乳动物前庭传出神经系统的神经元胞体位于脑干，它至少源于外展神经核外侧以及面神经膝部内侧等两个区域，由此向双侧发出纤维支配前庭末梢器官。降钙素基因相关肽被定位于前庭传出神经系统[8，9]，乙酰胆碱是大鼠[10]及人体[2，3]前庭传出神经递质，以及GABA亦为前庭传出神经递质，提示前庭传出神经是一个多源性的、含有数种神经递质的传出神经系统，其复杂的功能意义有待进一步探讨。
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《参考文献》
[1] Kong WJ, Egg G, Hussl B, et al. A study of neurotransmitters in human inner ear: preservation of human temporal bone and value of organ donation for inner ear research. Acta Otolaryngol, 1994,114:245-253.
[2] Kong WJ, Hussl B, Thumfart WF, et al. Ultrastructural localization of CHAT-like immunoreactivity in the human vestibular periphery. Hear Res, 1998, 119:96-103.
[3] 孔维佳, Hussl B, Schrott-Fischer A.人体前庭感觉上皮胆碱能神经免疫细胞化学研究. 中华耳鼻咽喉科杂志,1998,33:7-9.
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[4] 孔维佳, Schrott-Fischer A.γ-氨基丁酸在大鼠前庭终器的超微定位.临床耳鼻咽喉科杂志, 1996,10:195-197.
[5] Usami S, Igarashi M, Thompson GC. GABA- like immunoreactivity in the chick vestibular end organs.Brain Res, 1987,418:383-387.
[6] Usami S, Igarashi M, Thompson GC. GABA-like immunoreactivity in the squirrel monkey vestibular endorgans. Brain Res, 1987,417:367-370.
[7] Lopez I,Juiz JM, Altschuler RA, et al. Distribution of GABA-like immunoreactivity in the guinea pig vestibular cristae ampullaris.Brain Res,1990,530:170-175.
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[8] Tanaka M, Takeda N, Senba E, et al. Localization, origin and fine structure of calcitonin gene-related peptide-containing fibers in the vestibular end-organs of the rat. Brain Res, 1989,504:31-35.
[9] 孔维佳, Schrott-Fischer A. 大鼠前庭传出神经末梢降钙素基因相关肽染色分类.听力及言语疾病杂志, 1996,4:130-133.
[10] Kong WJ, Egg G, Hussl B, et al. Localization of chat-like immunoreactivity in the vestibular endorgans of the rat. Hear Res, 1994,75:191-200.
(收稿：1998-07-14 修回：1998-10-30), 百拇医药
单位：奥地利 因斯布鲁克大学医学院；同济医科大学附属协和医院(孔维佳通讯地址：430022 武汉 同济医科大学附属协和医院耳鼻咽喉科)
关键词：前庭；神经末梢；GABA(受体；GABA-A)；神经元；传出；人类
中华耳鼻咽喉科杂志/990101 【摘要】 目的 探讨γ-氨基丁酸(gama-aminobutyric acid，GABA)能神经在人体前庭终器的分布。方法 应用包埋前染色免疫电镜技术，以抗GABA抗体为标记物，观察5例尸体GABA能神经在前庭终器的超微定位。结果 发现GABA免疫反应定位于富含突触小泡的神经末梢及无髓鞘神经纤维。GABA免疫反应阳性神经纤维与包绕Ⅰ型前庭毛细胞的传入神经盏形成突触。前庭毛细胞、传入神经盏及传入神经呈GABA染色阴性。结论 GABA能神经属前庭传出神经系统。
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Immunocytochemical study of gama-aminobutyric acid-ergic innervation in the end-organs of human vestibule KONG Weijia*, Burkhard Hussl, Annelies Schrott-Fischer. University of Innsbruck, Austria and* Department of Otorhinolaryngology Union Hospital, Tongji Medical University, Wuhan 430022
【Abstract】 Objective To investigate γ-aminobutyric acid-ergic(GABAergic) innervation in the end-organs of human vestibule.Methods A modified pre-embedding immunostaining technique of immunoelectron microscopy were applied to accomplish this study with a polyclonal antibody to γ-aminobutyric acid.Results GABA-immunoreactive products were confined to the nerve terminals, which were rich in synaptic vesicles and the non-myelinated fibers. The GABA-immunoreactive nerve fibers synapse with afferent calices surrounding the type I hair cells.Conclusion This study shows that GABAergic fibers of human vestibular end-organs belong to the vestibular efferent system.
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【Key words】 Vestibule Nerve endings GABA(Receptors, GABA-A) Neurons,efferent Human
前庭传入神经系统将前庭毛细胞感受到的刺激信号传入脑干各相关神经核团、小脑以及大脑皮层，参与维持机体平衡。同时前庭感觉末梢器官接受前庭传出神经系统的神经支配。迄今前庭传出神经系统的构成成分、支配类型、递质种类及其功能意义尚未彻底阐明。最近我们观察了胆碱能神经在人体前庭终器感觉上皮的超微定位[1-3]。然而，γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)在前庭终器的定位及其功能的研究结果并没有达到统一，更缺乏GABA在人体前庭末梢器官定位研究的资料。本研究旨在探讨GABA在人体前庭终器的超微定位，为阐明GABA在前庭系统的功能作用提供化学神经解剖学基础。
材料与方法
1.供体内耳：5例内耳标本供体为死于头颈部肿瘤晚期恶液质、大出血等患者，生前无中耳和内耳疾患，在死亡后2 h内行内耳灌注固定，左、右耳分别以5%戊二醛二甲胂酸缓冲固定液(固定液A)或1.25%戊二醛-1%多聚甲醛磷酸缓冲固定液(固定液B)灌注固定后，在尸检室取出双侧颞骨标本，左右颞骨标本分别在与灌注固定相同的固定液中进一步浸泡固定20 h，解剖显微镜下解剖出前庭囊斑及壶腹嵴，按其固定液种类分别在0.1 mol/L二甲胂酸缓冲液或磷酸缓冲液(PBS)中漂洗后，供免疫细胞化学染色。
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2.抗GABA抗体免疫细胞化学染色：供体前庭末梢器官按固定液不同而分为A，B两组，采用PAP(peroxidase-anti-peroxidase)法作包埋前免疫细胞化学染色。简述步骤如下：①30%羊血清-1%小牛血清蛋白室温封闭30 min；②兔抗GABA抗体(1∶100，A组使用法国Immuno Tech公司，B组使用美国Chemicon Internatilnal公司产品)4℃孵育24 h；③羊抗兔IgG(1∶40，美国ICN Biomedicals公司)室温孵育2 h；④兔PAP复合物(1∶100，美国Jackson Immuno Research Laboratories公司)室温孵化2 h；⑤DAB(3，3’-diaminobenzidine)-过氧化氢-氯化钴增强显色。以上步骤之间用缓冲液漂洗3次，每次10 min。
在各次重复实验中，用大鼠前庭终器标本作为阳性对照染色，用正常兔血清取代兔抗GABA抗体作为阴性对照染色。
3.标本包埋及观察：将经免疫细胞化学染色处理的标本按常规方法行梯度酒精脱水、Spurr树脂塑料包埋。Reichert-Jung切片机上行半薄切片，光镜下观察、定位，超薄切片。超薄切片标本在Jeol 100-C透射电镜下观察。
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结果
本实验选用两个不同生物制品公司生产的商品化的兔抗GABA抗体，是为了比较抗体染色的特异性，旨在确证实验结果的可靠性。固定液A及固定液B的设置是根据不同生物制品公司的兔抗GABA抗体的特性而决定的。实验结果表明，该2个生物制品公司的兔抗GABA抗体染色类型完全相同。人体前庭感觉上皮抗GABA抗体阳性染色位于富含突触小泡的神经末梢及神经纤维。呈抗GABA抗体免疫染色阳性反应的神经末梢与传入神经盏形成突触联系(图1)，在高倍电镜下观察见GABA免疫反应产物位于突触小泡(图2，3)。Ⅰ型毛细胞、Ⅱ型毛细胞、杯状环绕Ⅰ型毛细胞的传入神经盏(图1)以及传入神经纤维(图3)抗GABA抗体染色阴性。在基底膜以下的组织内，可见抗GABA抗体染色阳性的神经纤维为无髓鞘纤维，而有髓鞘的传入神经纤维呈阴性染色(图4)。前庭囊斑及壶腹嵴染色类型相同。
图1 人体椭圆囊斑感觉上皮抗GABA抗体免疫电镜照片。示GABA阳性染色的神经末梢(↑)与传入神经盏(ch)呈突触联系。Ⅰ型毛细胞(Ⅰ)胞体顶浆内可见色素沉着。×3 600
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图2 为图1局部之高倍电镜照片。 示GABA免疫染色阳性反应产物位于突触小泡。ch 传入神经盏。×17 500
图3 人体前庭感觉上皮基底膜区域抗GABA抗体免疫电镜照片示GABA免疫染色阳性神经纤维内充满突触小泡(▲), 而不含突触小泡的传入神经纤维(↑)呈GABA染色阴性。×9 000
图4 人体椭圆囊斑感觉上皮基底膜下方组织免疫电镜照片示抗GABA抗体染色阳性的神经纤维为无髓鞘神经纤维(↑)。有髓鞘神经纤维(A)染色阴性。×8 000
在免疫细胞化学染色重复实验中，用作阳性对照染色的大鼠前庭终器标本，其GABA染色结果与文献[4]一致，而所有阴性对照染色标本全部未显染色。
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讨论
Flock和Lam 1974年首次提出GABA可能是前庭感觉末梢器官的传入神经递质，20余年以来，许多学者致力于探讨GABA在前庭感觉末梢器官的结构定位及功能作用。Usami等[5]报道鸡前庭毛细胞抗GABA抗体免疫染色呈阳性反应，认为GABA可能是鸡的前庭传入神经递质。此后，Usami等[6]又报道了鼠猴(squirrel monkey)前庭GABA免疫染色与鸡前庭相矛盾的实验结果，他们发现鼠猴前庭毛细胞抗GABA抗体免疫染色呈阴性反应，而神经纤维呈阳性反应。Lopez等[7]的豚鼠实验结果亦支持有关GABA是前庭传入神经递质的学说。然而，上述动物实验研究皆局限于光镜水平。我们用免疫电镜技术观察发现GABA是大鼠前庭传出神经递质[4]。本研究选用2种来自不同生物制品公司生产的GABA抗体，获得一致的GABA免疫染色反应结果，发现GABA存在于人体前庭终器，其呈GABA免疫染色阳性反应的神经纤维和神经末梢属于前庭传出神经系统，表明GABA是人体前庭传出神经递质。
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前庭传出神经纤维进入前庭终器感觉上皮层后分支支配毛细胞。一般认为它与Ⅰ型毛细胞无直接接触，而以轴-树突触形式与包绕Ⅰ型毛细胞的传入神经盏相接触或直接与Ⅱ型毛细胞形成轴-体突触联系。本实验发现人体前庭终器GABA能神经传出神经仅与包绕Ⅰ型毛细胞的传入神经盏形成突触联系，未发现GABA能传出神经直接与Ⅱ型毛细胞形成突触。GABA能传出神经在人体前庭终器的神经支配类型与大鼠前庭终器GABA能神经支配类型相似[4]。另外，人体前庭胆碱能神经对Ⅰ型及Ⅱ型前庭毛细胞都有神经支配[2，3]，GABA能传出神经与胆碱能神经支配类型不同。本实验结果表明，GABA能传出神经是人体前庭传出神经的组成部分之一。
哺乳动物前庭传出神经系统的神经元胞体位于脑干，它至少源于外展神经核外侧以及面神经膝部内侧等两个区域，由此向双侧发出纤维支配前庭末梢器官。降钙素基因相关肽被定位于前庭传出神经系统[8，9]，乙酰胆碱是大鼠[10]及人体[2，3]前庭传出神经递质，以及GABA亦为前庭传出神经递质，提示前庭传出神经是一个多源性的、含有数种神经递质的传出神经系统，其复杂的功能意义有待进一步探讨。
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《参考文献》
[1] Kong WJ, Egg G, Hussl B, et al. A study of neurotransmitters in human inner ear: preservation of human temporal bone and value of organ donation for inner ear research. Acta Otolaryngol, 1994,114:245-253.
[2] Kong WJ, Hussl B, Thumfart WF, et al. Ultrastructural localization of CHAT-like immunoreactivity in the human vestibular periphery. Hear Res, 1998, 119:96-103.
[3] 孔维佳, Hussl B, Schrott-Fischer A.人体前庭感觉上皮胆碱能神经免疫细胞化学研究. 中华耳鼻咽喉科杂志,1998,33:7-9.
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[4] 孔维佳, Schrott-Fischer A.γ-氨基丁酸在大鼠前庭终器的超微定位.临床耳鼻咽喉科杂志, 1996,10:195-197.
[5] Usami S, Igarashi M, Thompson GC. GABA- like immunoreactivity in the chick vestibular end organs.Brain Res, 1987,418:383-387.
[6] Usami S, Igarashi M, Thompson GC. GABA-like immunoreactivity in the squirrel monkey vestibular endorgans. Brain Res, 1987,417:367-370.
[7] Lopez I,Juiz JM, Altschuler RA, et al. Distribution of GABA-like immunoreactivity in the guinea pig vestibular cristae ampullaris.Brain Res,1990,530:170-175.
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[8] Tanaka M, Takeda N, Senba E, et al. Localization, origin and fine structure of calcitonin gene-related peptide-containing fibers in the vestibular end-organs of the rat. Brain Res, 1989,504:31-35.
[9] 孔维佳, Schrott-Fischer A. 大鼠前庭传出神经末梢降钙素基因相关肽染色分类.听力及言语疾病杂志, 1996,4:130-133.
[10] Kong WJ, Egg G, Hussl B, et al. Localization of chat-like immunoreactivity in the vestibular endorgans of the rat. Hear Res, 1994,75:191-200.
(收稿：1998-07-14 修回：1998-10-30), 百拇医药