喉鳞癌与HPV-E1序列的相关性研究
作者：王继群 张涛 张发岐
单位：王继群、张 涛 广州 暨南大学医学院附属第一临床医院耳鼻咽喉科 510630；张发岐 广东省清远市人民医院耳鼻咽喉科
关键词：喉肿瘤；基因；病毒；聚合酶链反应；乳头状瘤病毒；人；癌基因
中华耳鼻咽喉科杂志990213【摘要】 目的 为了解喉鳞癌中人类乳头状瘤病毒(human papilloma virus, HPV)HPV-E1亚基因片段的发生发展及其作用。方法 采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术对临床活体组织中HPV-E1的表达进行病毒病因学研究，所采用的公共产物代表HPV13个亚型。喉鳞癌25例，临床病理分级(UICC,1992)为：Ⅰ级5例，Ⅱ级15例，Ⅲ3例，Ⅳ2例。正常喉组织6例。结果 25例喉鳞状细胞癌中HPV-E1亚基因片段出现率为68%(17/25)，6例正常喉组织全部为阴性结果，统计学处理P<0.01。结论 某些喉鳞癌中存在HPV-E1的感染，但感染与否与喉鳞癌临床病理分级无关。
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Study On the association between squamous cell carcinoma of larynx and HPV subgene by PCR
WANG Jiqun, ZHANG Tao, ZHANG Faqi.Department of Otorhinolaryngology ， the First Affiliated Hospital, Medical College of Jinan University,Guangzhou 510630
【Abstract】 Objective To measure the human papilloma virus(HPV)HPV-E1 in squamous cell carcinoma of larynx. Methods Polymerase chain reaction(PCR)was used to detect the HPV subgene in 25 specimens of laryngeal carcinoma and 6 normal larynges. Results Positive expression of HPV-E1 was detected in 17 of 25 cases(68%)with squamous cell carcinoma and all the recurrent cases. However, there was no positive expression of HPV-E1 in the normal larynges (P<0.01). The expression rate was not significantly different among the histological grad groups. Conclusion HPV-E1 infection was found in laryngeal carcinoma but not related to its histologic grading.
, 百拇医药
【Key words】 Laryngeal neoplasms Genes,viral Polymerase chain reaction Papillama virus,human Oncogenes
人类乳头状瘤病毒(human papilloma virus, HPV)与头颈肿瘤及某些生殖道肿瘤有密切关系。HPV感染与喉鳞癌的关系国内已有报道[1,2]。我们采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术进行了HPV亚基因序列E1与喉鳞状细胞癌之间的相关研究。
材料及方法 一、组织标本来源
喉鳞癌来自门诊和住院患者的活组织检查和手术切除的肿瘤组织，共25例，临床病理分级(UICC) 为：Ⅰ级5例，Ⅱ级15例，Ⅲ级3例，Ⅳ级2例。已有颈部淋巴结转移者6例。6例正常喉组织取自非正常死亡的健康人。所有标本取下后一部分送病理学检查，另一部分立即放入液氮中保存。
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二、主要试剂及PCR引物设计
1.PCR引物设计采用Willem 等设计的E1区序列(代表1a,5,6p,8,11,16,18,31, 33等13个亚型的公共引物)[3]：
GP1+5'TGGTACAATGGGCATATGAT3'
GP2-5'AATGGCTTTTGGAATTTACA3'
Taq酶及dNTP等主要生物试剂购于华美生物工程公司及中国医学科学院。
三、实验方法
1.组织DNA膜板的提取：称取低温保存的组织200 mg，剪碎匀浆，消化；用饱和酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)混合液抽提，无水乙醇沉淀、离心，最后将DNA溶于灭菌的等离子水中，测量DNA的含量。
, 百拇医药
2.PCR步骤：反应总体积为50 μl，其中50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-HCl2， 2 单位Taq 酶及50 pmol/L prinmers。首先将模板DNA 100℃加热变性10 min，然后进入反应体积。PCR温变条件为变性94℃，1 min；退火42℃，2 min；延伸72℃,2 min。40个周期。
阳性对照用全组HPV-DNA做模板，阴性对照设3组，第一组为模板加离子水，第二组为模板加引物，第三组为Taq酶加模板。电泳，HE染色，观察结果。
结果
25例喉鳞状细胞癌中含HPV-E1片段者占68%(17/25)，17例阳性者中临床分级：Ⅰ级2例，Ⅱ级2例，Ⅲ2例，Ⅳ1例。6例正常喉组织中未见有HPV-E1片段(图1)。
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图1 N1为阳性对照，N2～N18为喉鳞癌HPV-E1阳性结果。N19～N21为阴性对照。M1为DNA标 尺(PBR322-HeaⅢ，第一条带含444bp)
讨论 Seedorf等[4]的结果认为，HPV-DNA基因呈环状，含有9个主要开放读码(majar open reading frame),即E1～E7、L1～L2。在L1和E6 之间存在着病毒长期控制的基因区，可能起着病毒转录和复制的调节作用，唯一的促进子在HPV-DNA的起始段。HPV-DNA环上含有两个转录基因片段，第4000bp之后的称早期转录基因，第7000bp之后的称晚期转录基因。HPV-DNA复制呈顺时针方向进行。Schwarz 等[5]报道，宫颈癌细胞株中HPV16和HPV18两种DNA序列部分或完全地整合部位以E1、E2基因片段为多。宫颈上皮内瘤样变(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)病灶，HPV-DNA通常在核内呈游离状态，在浸润性癌中则呈整合状态，或整合、游离共存[6]，这说明HPV-DNA-E1整合与病灶转化和浸润性癌有关。因此，在喉鳞癌中HPV-E1片段的数量及所出现的比率具有重要性。Howley 等[6]认为HPV-DNA整合引起病毒E2基因的缺失，使E2基因调节病毒长期控制区功能丧失。E2的缺失则导致E6和E7基因的表达失控，从而引起细胞的转化或恶变。Choo等[7]认为E6和E7是潜在的癌基因，当E1整合E2 缺失时才能使其活化。本实验结果表明，喉鳞癌同正常喉组织比较，HPV-E1 的感染率差异有显著性(P<0.01)，说明喉鳞癌中HPV-E1片段可能起非常重要的作用。 但与喉癌临床病理分级无显著性相关，可能HPV激活癌基因后即失去作用。 癌肿发展按癌基因的表达程序进行。
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本组25例喉鳞癌中有2例为手术+放射治疗后复发的患者，二者均存在HPV-DNAE1基因片段，可能提示虽然放射线能杀死癌细胞，但不能清除HPV-E1片段。肿瘤的复发是否与HPV-E1的存在有关需继续研究。发现有HPV感染的肿瘤，除化学治疗、放射治疗及手术治疗外，应配合清除HPV 的治疗，大多数HPV感染所致的病变目前尚无有效治疗措施，这有可能是HPV感染病变和喉鳞癌逐年增多的原因之一。据报道普达非伦(podophyllin)的有效率为30%，α/β干扰素的有效率为50%，Depal试用人纤维母细胞干扰素(human fibroblast interfern) 效果比较满意，其有效率可达60%左右。
本课题为国家自然科学基金项目(39300144)
参考文献
1 王继群,卜国铉.喉鳞癌组织HPV-DNA测定.中华耳鼻咽喉科杂志, 1993, 28(增刊):43-45.
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2 Wang JQ,Chi BR,Bu GX.Study on DNA sequence of human papilloma vinus in laryngeal carcinoma and laryngeal precancerous conditions.Kitasato Med,1993,23:499-502.
3 Melchers W, de Mare S, Kuitert E,et al.Human papilloma virus and cutaneous warts in meat handlers. J Clin Microbiol,1993, 31:2547-2549.
4 Seedorf K,Oltersdorf T,Krammer G, et al. Identification of early proteins of the human papilloma viruses type 16 (HPV16) and type 18 (HPV18) in cervical carcinoma cells. EMBO J,1987, 6:139-144.
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5 Schwarz E, Freese UK, Gissmann L, et al. Structure and transcription of human papilloma virus sequences in cervical carcinoma cells. Nature, 1985,314:111-114.
6 Howley PM, Schlegel R. The Human papilloma viruses. An overview. Am J Med, 1988,85:155-158.
7 Choo KB, Pan CL, Han SH. Integration of human papilloma viruses types 16 into cellular DNA of cervical carcinoma: preferential deletion of the E2 gene and invariable retention of the long control region and the E6/E7 open reading frames. Virology, 1987:161:259-261.
(收稿:1998-08-24 修回:1998-12-10), http://www.100md.com
单位：王继群、张 涛 广州 暨南大学医学院附属第一临床医院耳鼻咽喉科 510630；张发岐 广东省清远市人民医院耳鼻咽喉科
关键词：喉肿瘤；基因；病毒；聚合酶链反应；乳头状瘤病毒；人；癌基因
中华耳鼻咽喉科杂志990213【摘要】 目的 为了解喉鳞癌中人类乳头状瘤病毒(human papilloma virus, HPV)HPV-E1亚基因片段的发生发展及其作用。方法 采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术对临床活体组织中HPV-E1的表达进行病毒病因学研究，所采用的公共产物代表HPV13个亚型。喉鳞癌25例，临床病理分级(UICC,1992)为：Ⅰ级5例，Ⅱ级15例，Ⅲ3例，Ⅳ2例。正常喉组织6例。结果 25例喉鳞状细胞癌中HPV-E1亚基因片段出现率为68%(17/25)，6例正常喉组织全部为阴性结果，统计学处理P<0.01。结论 某些喉鳞癌中存在HPV-E1的感染，但感染与否与喉鳞癌临床病理分级无关。
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Study On the association between squamous cell carcinoma of larynx and HPV subgene by PCR
WANG Jiqun, ZHANG Tao, ZHANG Faqi.Department of Otorhinolaryngology ， the First Affiliated Hospital, Medical College of Jinan University,Guangzhou 510630
【Abstract】 Objective To measure the human papilloma virus(HPV)HPV-E1 in squamous cell carcinoma of larynx. Methods Polymerase chain reaction(PCR)was used to detect the HPV subgene in 25 specimens of laryngeal carcinoma and 6 normal larynges. Results Positive expression of HPV-E1 was detected in 17 of 25 cases(68%)with squamous cell carcinoma and all the recurrent cases. However, there was no positive expression of HPV-E1 in the normal larynges (P<0.01). The expression rate was not significantly different among the histological grad groups. Conclusion HPV-E1 infection was found in laryngeal carcinoma but not related to its histologic grading.
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【Key words】 Laryngeal neoplasms Genes,viral Polymerase chain reaction Papillama virus,human Oncogenes
人类乳头状瘤病毒(human papilloma virus, HPV)与头颈肿瘤及某些生殖道肿瘤有密切关系。HPV感染与喉鳞癌的关系国内已有报道[1,2]。我们采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)技术进行了HPV亚基因序列E1与喉鳞状细胞癌之间的相关研究。
材料及方法 一、组织标本来源
喉鳞癌来自门诊和住院患者的活组织检查和手术切除的肿瘤组织，共25例，临床病理分级(UICC) 为：Ⅰ级5例，Ⅱ级15例，Ⅲ级3例，Ⅳ级2例。已有颈部淋巴结转移者6例。6例正常喉组织取自非正常死亡的健康人。所有标本取下后一部分送病理学检查，另一部分立即放入液氮中保存。
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二、主要试剂及PCR引物设计
1.PCR引物设计采用Willem 等设计的E1区序列(代表1a,5,6p,8,11,16,18,31, 33等13个亚型的公共引物)[3]：
GP1+5'TGGTACAATGGGCATATGAT3'
GP2-5'AATGGCTTTTGGAATTTACA3'
Taq酶及dNTP等主要生物试剂购于华美生物工程公司及中国医学科学院。
三、实验方法
1.组织DNA膜板的提取：称取低温保存的组织200 mg，剪碎匀浆，消化；用饱和酚-氯仿-异戊醇(25:24:1)混合液抽提，无水乙醇沉淀、离心，最后将DNA溶于灭菌的等离子水中，测量DNA的含量。
, 百拇医药
2.PCR步骤：反应总体积为50 μl，其中50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris-HCl2， 2 单位Taq 酶及50 pmol/L prinmers。首先将模板DNA 100℃加热变性10 min，然后进入反应体积。PCR温变条件为变性94℃，1 min；退火42℃，2 min；延伸72℃,2 min。40个周期。
阳性对照用全组HPV-DNA做模板，阴性对照设3组，第一组为模板加离子水，第二组为模板加引物，第三组为Taq酶加模板。电泳，HE染色，观察结果。
结果
25例喉鳞状细胞癌中含HPV-E1片段者占68%(17/25)，17例阳性者中临床分级：Ⅰ级2例，Ⅱ级2例，Ⅲ2例，Ⅳ1例。6例正常喉组织中未见有HPV-E1片段(图1)。
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图1 N1为阳性对照，N2～N18为喉鳞癌HPV-E1阳性结果。N19～N21为阴性对照。M1为DNA标 尺(PBR322-HeaⅢ，第一条带含444bp)
讨论 Seedorf等[4]的结果认为，HPV-DNA基因呈环状，含有9个主要开放读码(majar open reading frame),即E1～E7、L1～L2。在L1和E6 之间存在着病毒长期控制的基因区，可能起着病毒转录和复制的调节作用，唯一的促进子在HPV-DNA的起始段。HPV-DNA环上含有两个转录基因片段，第4000bp之后的称早期转录基因，第7000bp之后的称晚期转录基因。HPV-DNA复制呈顺时针方向进行。Schwarz 等[5]报道，宫颈癌细胞株中HPV16和HPV18两种DNA序列部分或完全地整合部位以E1、E2基因片段为多。宫颈上皮内瘤样变(cervical intraepithelial neoplasia, CIN)病灶，HPV-DNA通常在核内呈游离状态，在浸润性癌中则呈整合状态，或整合、游离共存[6]，这说明HPV-DNA-E1整合与病灶转化和浸润性癌有关。因此，在喉鳞癌中HPV-E1片段的数量及所出现的比率具有重要性。Howley 等[6]认为HPV-DNA整合引起病毒E2基因的缺失，使E2基因调节病毒长期控制区功能丧失。E2的缺失则导致E6和E7基因的表达失控，从而引起细胞的转化或恶变。Choo等[7]认为E6和E7是潜在的癌基因，当E1整合E2 缺失时才能使其活化。本实验结果表明，喉鳞癌同正常喉组织比较，HPV-E1 的感染率差异有显著性(P<0.01)，说明喉鳞癌中HPV-E1片段可能起非常重要的作用。 但与喉癌临床病理分级无显著性相关，可能HPV激活癌基因后即失去作用。 癌肿发展按癌基因的表达程序进行。
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本组25例喉鳞癌中有2例为手术+放射治疗后复发的患者，二者均存在HPV-DNAE1基因片段，可能提示虽然放射线能杀死癌细胞，但不能清除HPV-E1片段。肿瘤的复发是否与HPV-E1的存在有关需继续研究。发现有HPV感染的肿瘤，除化学治疗、放射治疗及手术治疗外，应配合清除HPV 的治疗，大多数HPV感染所致的病变目前尚无有效治疗措施，这有可能是HPV感染病变和喉鳞癌逐年增多的原因之一。据报道普达非伦(podophyllin)的有效率为30%，α/β干扰素的有效率为50%，Depal试用人纤维母细胞干扰素(human fibroblast interfern) 效果比较满意，其有效率可达60%左右。
本课题为国家自然科学基金项目(39300144)
参考文献
1 王继群,卜国铉.喉鳞癌组织HPV-DNA测定.中华耳鼻咽喉科杂志, 1993, 28(增刊):43-45.
, http://www.100md.com
2 Wang JQ,Chi BR,Bu GX.Study on DNA sequence of human papilloma vinus in laryngeal carcinoma and laryngeal precancerous conditions.Kitasato Med,1993,23:499-502.
3 Melchers W, de Mare S, Kuitert E,et al.Human papilloma virus and cutaneous warts in meat handlers. J Clin Microbiol,1993, 31:2547-2549.
4 Seedorf K,Oltersdorf T,Krammer G, et al. Identification of early proteins of the human papilloma viruses type 16 (HPV16) and type 18 (HPV18) in cervical carcinoma cells. EMBO J,1987, 6:139-144.
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5 Schwarz E, Freese UK, Gissmann L, et al. Structure and transcription of human papilloma virus sequences in cervical carcinoma cells. Nature, 1985,314:111-114.
6 Howley PM, Schlegel R. The Human papilloma viruses. An overview. Am J Med, 1988,85:155-158.
7 Choo KB, Pan CL, Han SH. Integration of human papilloma viruses types 16 into cellular DNA of cervical carcinoma: preferential deletion of the E2 gene and invariable retention of the long control region and the E6/E7 open reading frames. Virology, 1987:161:259-261.
(收稿:1998-08-24 修回:1998-12-10), http://www.100md.com