人喉癌引流淋巴结淋巴细胞局部应用疗效观察
作者：燕阳春 韩德宽
单位：100034 北京医科大学第一医院耳鼻咽喉科
关键词：喉肿瘤；；淋巴细胞；；过继免疫治疗
中华耳鼻烟喉科杂志990404 摘要 目的 为提高肿瘤引流淋巴结淋巴细胞(tumor draining lymph node lymphocyte,TDLNL)转输后在肿瘤局部的数量，采用肿瘤局部注射的方法对喉癌裸鼠移植瘤模型进行实验性治疗。方法 用20只人喉癌裸鼠移植瘤系PHC3的裸鼠移植模型作为治疗对象，随机分为2组。10只作为治疗组，取新鲜喉癌患者切除的淋巴结，分离得到淋巴细胞，体外培养并用白介素2(interleukin-2, IL-2)1 000 IU/ml激活后，每周一次注射于瘤内及周围，每次每只注射107个细胞(悬于0.1 ml D-Hanks液中)，另10只作为对照组，每周一次注射0.1 ml D-Hanks缓冲液于瘤内及周围。治疗2周，观察4周。结果 治疗组肿瘤生长较对照组缓慢，差异有显著性(P<0.05)。病理组织学检查可见治疗组肿瘤内片状及灶状坏死，肿瘤间质淋巴细胞浸润增多，肿瘤血管周围亦可见较多淋巴细胞聚集，脾小结明显增生，肝、脾及肺脏未见任何转移。对照组肿瘤细胞无明显坏死，间质淋巴细胞浸润很少，脾小结增生不明显，并观察到1例肺转移结节。结论 TDLNL在体外经IL-2短期活化后在肿瘤局部注射具有抗肿瘤作用，与以往经静脉注射TDLNL比较明显提高肿瘤局部淋巴细胞的分布，并可刺激肿瘤宿主的免疫反应，还可能有抗肿瘤转移的作用。为头颈部恶性肿瘤局部过继免疫治疗应用于临床提供了实验室基础。
, 百拇医药
Local treatment with human laryngeal squamous carcinoma draining lymph node lymphocytes in nude mice bearing human laryngeal carcinoma xenografts
YAN Yangchun,HAN Dekuan.
Department of Otorhinolaryngology, The First Affiliated Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034
Abstract Objective To increase the number of the tumor draining lymph nodes lymphocytes (TDLNLs) in tumor site and study its anti-tumor effect. Methods Interleukin 2-activated TDLNLs were administrated by local injection in 10 nude mice bearing human laryngeal cancer at 107 cells /mouse, once a week for two weeks. As a control, 10 nude mice bearing human laryngeal cancer were injected with D-Hanks buffer solution. Results The volume and weight of TDLNLs treated tumors were significantly reduced in comparison with those of the control (P<0.05). The observed histopathologic characteristics of treated tumors were tumor necrotic foci and increased infiltration of lymphocytes in tumor and around tumor vessels. Proliferation of spleen nodules was also observed in the treatment group. Remote metastasis was not found in this group. In contrast with the control group, tumor necrosis and proliferation of spleen nodules were not observed and infiltration of lymphocytes in the tumor was not significant. There was a lung metastasis in the control group. Conclusion Local injection of TDLNLs is effective against human laryngeal carcinoma xenografts in nude mice. It also could stimulate the immunoresponse of hosts and probably decrease the chance of tumor metastasis.
, 百拇医药
Key words Laryngeal neoplasms Lymphocytes Immunotherapy, adoptive
对于晚期及复发头颈部肿瘤，过继免疫治疗是一种极有前景的治疗方法。淋巴因子激活杀伤细胞(lymphkine activated killer cells,LAK)、肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)均被证明具有抑瘤作用[1,2]。我们以往研究证明，通过尾静脉注射活化肿瘤引流淋巴结淋巴细胞(tumor draining lymph node lymphocyte,TDLNL)可抑制裸鼠移植瘤的生长，但TDLNL在肿瘤局部分布极少[3]。肿瘤周围注射活化淋巴细胞可提高肿瘤局部淋巴细胞浸润[4]，故我们拟在裸鼠移植瘤局部注射活化TDLNL，观察其对肿瘤生长及宿主重要脏器的影响。
材料及方法
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一、淋巴结的采取
本实验所用淋巴结采自1例喉鳞状细胞癌患者，术前未接受放射治疗及化学治疗，术后病理证实为中至高分化鳞状细胞癌。患者在手术切除原发肿瘤的同时行颈廓清术，在无菌条件下取目视无转移迹象的淋巴结，半枚送病理检查，证实无肿瘤转移，另半枚立即送实验室进行活化培养。
二、培养和活化
机械分离法分离淋巴细胞[3]。将1.0×107个淋巴细胞加入35 cm2玻璃培养瓶中，并加入10 ml完全培养基(RPMI-1640[J.R.Scientific]10.4 g/L，Hepes [Boehiger Mnanheim]5.95 g/L，L-谷氨酰胺 0.3437 g/L，丙酮酸钠0.12936 g/L，碳酸氢钠2.0 g/L，2-ME 0.004 ml/L，青霉素 1.0×105 IU/L，链霉素1.0×105 IU/L，胎牛血清150 ml/L)，1.0×104 IU rIL-2(北京医科大学免疫教研室生产，标定活性为2.0×106 IU/mg)，在36.5～37℃，5%CO2，饱和湿度环境中培养，3～4天后收获为活化淋巴细胞。
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三、TDLNL动物体内抑瘤模型
取冻存14代PHC3瘤系[5](北京医科大学第一临床医学院耳鼻喉科实验室1993年建立)移植瘤块复苏并传代，将15代移植瘤块剪成1mm3大小，分别接种于20只裸小鼠右侧胁部皮下。2周后成瘤。将20只荷瘤裸小鼠随机分为2组，作好自标。分别在接种肿瘤后第29天、36天，将激活后的TDLNL局部注射于治疗组肿瘤内及肿瘤周围。每次注射量为1.0×107个TDLNL，悬于0.1ml D-Hanks液中。对照组每次注射D-Hanks液0.1ml。每周用卡尺测量肿瘤长、宽、高，至6周实验结束。完成实验观察后，处死小鼠，取肿瘤、肝、脾和肺做石蜡切片，常规HE染色后显微镜下行肿瘤形态学观察。
统计学处理：实验组和对照组间肿瘤体积和重量的比较采取t检验。
结果
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一、活化TDLNL体内抗肿瘤生长活性
治疗前和治疗后每周测量肿瘤的大小，用以下公式大致计算肿瘤的体积[3]：肿瘤体积(cm3)＝2/3(长×宽×高)，完成实验观察后处死小鼠，完整剥出肿瘤后称重，测量并计算肿瘤体积。治疗组自第4周开始肿瘤生长较对照组明显缓慢(P<0.05，表1)。
肿瘤体积与重量间显示出良好的正相关(r＝0.978)，治疗后6周治疗组肿瘤重量(0.12703±0.03782)g明显低于对照组(0.24068±0.14129)g，P<0.05。
表1 治疗开始后每周肿瘤体积(cm3，
±s) 时间(周)
对照组
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治疗组
1
0.08058±0.07214
0.07738±0.03440
2
0.09138±0.06392
0.10309±0.04576
3
0.12711±0.07485
0.14610±0.08562
4
0.16118±0.14254
, 百拇医药
0.12558±0.05970
5
0.22285±0.13892
0.11695±0.04446
6
0.32380±0.19093
0.17021±0.05046
二、肿瘤形态学改变
1.对照组：肿瘤细胞呈梭形或长椭圆形，细胞体积大，细胞核大，可见核仁，未见明显核分裂相，胞浆丰富，核/浆比约为1：1，肿瘤细胞呈条索状或不规则状排列，有的形成癌巢，中央可见角化和不全角化细胞，胞浆呈较强嗜酸性，有的可见角化珠，未见明显坏死，癌巢间可见少许纤维结缔组织、血管及少量淋巴细胞浸润(图1)。
, 百拇医药
图1 对照组肿瘤细胞呈梭形或长椭圆形，细胞体积大，细胞核大，可见核仁，未见明显核分裂相，胞浆丰富，核/浆比约为1：1。肿瘤细胞呈条索状或不规则状排列，有的形成癌巢，中央可见角化和不全角化细胞，胞浆呈较强嗜酸性，有的可见角化珠，未见明显坏死，癌巢间可见少许纤维结缔组织、血管及少量淋巴细胞浸润。HE×400
2. 治疗组：肿瘤组织浅层未见明显细胞坏死，肿瘤细胞形态与对照组肿瘤细胞大致相同，深层可见灶状、片状癌细胞坏死、裂解，可见肿瘤细胞核固缩，胞浆呈红染，残存肿瘤细胞呈簇状分布，坏死的肿瘤组织中可见淋巴细胞浸润，肿瘤间质中可见较多淋巴细胞浸润，血管周围淋巴细胞明显浸润(图2)。
图2 治疗组肿瘤细胞形态与对照组肿瘤细胞大致相同，可见灶状坏死、裂解，可见肿瘤细胞核固缩，胞浆呈红染，残存肿瘤细胞呈簇状分布，坏死的肿瘤组织中可见淋巴细胞浸润，间质中较多淋巴细胞浸润。HE×400倍
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对照组所有脾脏、肝脏均未见肿瘤转移，脾被膜完整，无增厚，脾小结增生不明显。可见1例肺转移结节，肿瘤细胞呈椭圆形，细胞体积大，胞核大，核浆比约为1：1，细胞呈乳头状排列，未形成癌巢，未见明显角化现象。
治疗组肝、脾、肺未见肿瘤转移结节，脾脏红、白髓清晰，被膜完整，无增厚，脾小结明显增生。
讨论
在过继免疫治疗中，效应细胞被转输入荷瘤宿主体内，其对肿瘤的抑制作用与效应细胞的来源和杀伤活性、肿瘤细胞对效应细胞的反应性、效应细胞在肿瘤局部的聚集以及效应细胞在宿主体内存活的时间等多种因素有关。TDLNL较其他LAK细胞来源，如：外周血淋巴细胞、脾细胞及肿瘤浸润淋巴细胞都容易获得，尤其是头颈部恶性肿瘤，颈部淋巴结清扫术可获得大量淋巴结。淋巴结中淋巴细胞含量丰富，我们以往报道每克淋巴结组织可分离到107～108个淋巴细胞[6]，且分离方法简便易行，故此我们认为TDLNL是一种理想的LAK细胞来源。但我们以往研究表明，经静脉注射TDLNL后主要分布于肝脏，脾、肾、肺也有少量分布，而肿瘤中分布极少[3]。而目前临床上淋巴细胞过继免疫治疗对恶性肿瘤疗效不甚满意可能与淋巴细胞在治疗局部分布很少有关。
, 百拇医药
为提高淋巴细胞在肿瘤局部的分布，学者们进行了多方面的研究。实验证明，结合抗CD3抗肿瘤的双特异抗体可提高淋巴细胞的抗肿瘤能力[7]。但更为常用的方法是对肿瘤进行局部治疗。有人在头颈部肿瘤患者引流淋巴结周围注射IL-2，可使肿瘤缩小或消退[8,9]。通过动、静脉灌注活化的淋巴细胞和IL-2也取得了较好的疗效[10]。更为直接的肿瘤内和肿瘤周围淋巴细胞和IL-2注射也被证明有满意疗效[4]。本实验通过在肿瘤周围及肿瘤内注射活化的TDLNL，观察到治疗组肿瘤生长较对照组明显缓慢，显微镜下可见肿瘤灶状及片状坏死，肿瘤间质淋巴细胞浸润增多，与Sacchi等[4]观察的结果基本相符。说明活化的TDLNL单独肿瘤局部注射可抑制肿瘤的生长，为TDLNL局部免疫治疗的临床应用提供了实验基础。
机体的免疫状态对肿瘤免疫治疗的影响至为重要，且肿瘤本身对机体免疫功能有抑制作用。我们的实验发现经TDLNL局部治疗的动物，脾小结有不同程度的增生，而对照组动物脾小结无明显增生，说明TDLNL局部治疗对宿主的免疫反应可能有上调作用。
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本实验着重研究活化的TDLNL在肿瘤局部注射对肿瘤的治疗作用及对荷瘤宿主的影响。结果表明：TDLNL的局部应用不但能增加肿瘤局部淋巴细胞的浸润，杀伤肿瘤细胞，并且可能提高宿主免疫功能。因而在头颈部恶性肿瘤的免疫治疗方面显示了较好的应用前景。
由于移植肿瘤与采集淋巴细胞患者的肿瘤不同，故本实验所用的TDLNL实际是一种非特异性LAK细胞。应用于临床时可用肿瘤患者自身的TDLNL回输，并先用其自身肿瘤的肿瘤抗原进行诱导，以提高治疗的特异性。
(本文图1，2见插页第21页)
参考文献
1 Grimn EA,Mazumedr A,Zhang A ,et al.The lymphokine-activated killer cell phenomenon: Lysis of NK resistant fresh solid tumor cells by IL-2 activated autologous human peripheral blood lymphocytes.J Exp Med,1982,155:1823-1841.
, 百拇医药
2 Rosenberg SA,Spress D,Lafreniere R.A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor infitrating lymphocytes. Science , 1986, 233:1318-1321.
3 吴园丁，郭敏.喉癌引流淋巴结淋巴细胞对裸鼠移植人喉癌的治疗观察. 中华耳鼻咽喉科杂志，1996，31:26-28.
4 Sacchi M, Vitolo P, Johnson JT, et al .Induction of tumor regression in experimental model of human head and neck cancer by human A-LAK cells and IL-2. Int J Cancer, 1991, 47:784-791.
, 百拇医药
5 韩德宽，张滨学，王洁良,等.人喉癌裸鼠移植瘤系的建立. 中华耳鼻咽喉科杂志，1993，28：154-156.
6 安伟，郭敏.喉癌引流淋巴结淋巴细胞抗肿瘤活性的观察.中华耳鼻咽喉科杂志，1993，12：93-95.
7 Azuma A,Yagita H,Okumura K.Potentiation of long-term-cultured lymphokine-activated killer cell cytotoxicity againist small-cell lung carcinoma by anti-CD3/anti-(tumor-associated antigen) bispecific antibody. Cancer Immunol Immunother, 1994, 38:294-298.
8 Forin G, Musiani P, De Campora E ,et al. Effect of low doses of interleukin-2 injected perilymphatically and peritumorally in patients with advanced primary head and neck squamous cell carcinoma. J Biol Response Mod, 1989, 8:571-578.
, 百拇医药
9 Cortesina G, Forni G, Cavallo GP ,et al. Interleukin-2 injected around tumor-draining lymph nodes in head and neck cancer. Head Neck,1991, 13: 125-131.
10 Hayakawa M, Koyama Y, Williams RD ,et al. Lymphokine-activated killer traffic assay and our preliminary clinical results of regional arterial infusion of lymphokine-activated killer cells for renal cell carcinoma. Urol Int, 1991, 47 (Suppl 1):127-131.
(收稿：1999-02-10 修回：1999-05-02), 百拇医药
单位：100034 北京医科大学第一医院耳鼻咽喉科
关键词：喉肿瘤；；淋巴细胞；；过继免疫治疗
中华耳鼻烟喉科杂志990404 摘要 目的 为提高肿瘤引流淋巴结淋巴细胞(tumor draining lymph node lymphocyte,TDLNL)转输后在肿瘤局部的数量，采用肿瘤局部注射的方法对喉癌裸鼠移植瘤模型进行实验性治疗。方法 用20只人喉癌裸鼠移植瘤系PHC3的裸鼠移植模型作为治疗对象，随机分为2组。10只作为治疗组，取新鲜喉癌患者切除的淋巴结，分离得到淋巴细胞，体外培养并用白介素2(interleukin-2, IL-2)1 000 IU/ml激活后，每周一次注射于瘤内及周围，每次每只注射107个细胞(悬于0.1 ml D-Hanks液中)，另10只作为对照组，每周一次注射0.1 ml D-Hanks缓冲液于瘤内及周围。治疗2周，观察4周。结果 治疗组肿瘤生长较对照组缓慢，差异有显著性(P<0.05)。病理组织学检查可见治疗组肿瘤内片状及灶状坏死，肿瘤间质淋巴细胞浸润增多，肿瘤血管周围亦可见较多淋巴细胞聚集，脾小结明显增生，肝、脾及肺脏未见任何转移。对照组肿瘤细胞无明显坏死，间质淋巴细胞浸润很少，脾小结增生不明显，并观察到1例肺转移结节。结论 TDLNL在体外经IL-2短期活化后在肿瘤局部注射具有抗肿瘤作用，与以往经静脉注射TDLNL比较明显提高肿瘤局部淋巴细胞的分布，并可刺激肿瘤宿主的免疫反应，还可能有抗肿瘤转移的作用。为头颈部恶性肿瘤局部过继免疫治疗应用于临床提供了实验室基础。
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Local treatment with human laryngeal squamous carcinoma draining lymph node lymphocytes in nude mice bearing human laryngeal carcinoma xenografts
YAN Yangchun,HAN Dekuan.
Department of Otorhinolaryngology, The First Affiliated Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034
Abstract Objective To increase the number of the tumor draining lymph nodes lymphocytes (TDLNLs) in tumor site and study its anti-tumor effect. Methods Interleukin 2-activated TDLNLs were administrated by local injection in 10 nude mice bearing human laryngeal cancer at 107 cells /mouse, once a week for two weeks. As a control, 10 nude mice bearing human laryngeal cancer were injected with D-Hanks buffer solution. Results The volume and weight of TDLNLs treated tumors were significantly reduced in comparison with those of the control (P<0.05). The observed histopathologic characteristics of treated tumors were tumor necrotic foci and increased infiltration of lymphocytes in tumor and around tumor vessels. Proliferation of spleen nodules was also observed in the treatment group. Remote metastasis was not found in this group. In contrast with the control group, tumor necrosis and proliferation of spleen nodules were not observed and infiltration of lymphocytes in the tumor was not significant. There was a lung metastasis in the control group. Conclusion Local injection of TDLNLs is effective against human laryngeal carcinoma xenografts in nude mice. It also could stimulate the immunoresponse of hosts and probably decrease the chance of tumor metastasis.
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Key words Laryngeal neoplasms Lymphocytes Immunotherapy, adoptive
对于晚期及复发头颈部肿瘤，过继免疫治疗是一种极有前景的治疗方法。淋巴因子激活杀伤细胞(lymphkine activated killer cells,LAK)、肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)均被证明具有抑瘤作用[1,2]。我们以往研究证明，通过尾静脉注射活化肿瘤引流淋巴结淋巴细胞(tumor draining lymph node lymphocyte,TDLNL)可抑制裸鼠移植瘤的生长，但TDLNL在肿瘤局部分布极少[3]。肿瘤周围注射活化淋巴细胞可提高肿瘤局部淋巴细胞浸润[4]，故我们拟在裸鼠移植瘤局部注射活化TDLNL，观察其对肿瘤生长及宿主重要脏器的影响。
材料及方法
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一、淋巴结的采取
本实验所用淋巴结采自1例喉鳞状细胞癌患者，术前未接受放射治疗及化学治疗，术后病理证实为中至高分化鳞状细胞癌。患者在手术切除原发肿瘤的同时行颈廓清术，在无菌条件下取目视无转移迹象的淋巴结，半枚送病理检查，证实无肿瘤转移，另半枚立即送实验室进行活化培养。
二、培养和活化
机械分离法分离淋巴细胞[3]。将1.0×107个淋巴细胞加入35 cm2玻璃培养瓶中，并加入10 ml完全培养基(RPMI-1640[J.R.Scientific]10.4 g/L，Hepes [Boehiger Mnanheim]5.95 g/L，L-谷氨酰胺 0.3437 g/L，丙酮酸钠0.12936 g/L，碳酸氢钠2.0 g/L，2-ME 0.004 ml/L，青霉素 1.0×105 IU/L，链霉素1.0×105 IU/L，胎牛血清150 ml/L)，1.0×104 IU rIL-2(北京医科大学免疫教研室生产，标定活性为2.0×106 IU/mg)，在36.5～37℃，5%CO2，饱和湿度环境中培养，3～4天后收获为活化淋巴细胞。
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三、TDLNL动物体内抑瘤模型
取冻存14代PHC3瘤系[5](北京医科大学第一临床医学院耳鼻喉科实验室1993年建立)移植瘤块复苏并传代，将15代移植瘤块剪成1mm3大小，分别接种于20只裸小鼠右侧胁部皮下。2周后成瘤。将20只荷瘤裸小鼠随机分为2组，作好自标。分别在接种肿瘤后第29天、36天，将激活后的TDLNL局部注射于治疗组肿瘤内及肿瘤周围。每次注射量为1.0×107个TDLNL，悬于0.1ml D-Hanks液中。对照组每次注射D-Hanks液0.1ml。每周用卡尺测量肿瘤长、宽、高，至6周实验结束。完成实验观察后，处死小鼠，取肿瘤、肝、脾和肺做石蜡切片，常规HE染色后显微镜下行肿瘤形态学观察。
统计学处理：实验组和对照组间肿瘤体积和重量的比较采取t检验。
结果
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一、活化TDLNL体内抗肿瘤生长活性
治疗前和治疗后每周测量肿瘤的大小，用以下公式大致计算肿瘤的体积[3]：肿瘤体积(cm3)＝2/3(长×宽×高)，完成实验观察后处死小鼠，完整剥出肿瘤后称重，测量并计算肿瘤体积。治疗组自第4周开始肿瘤生长较对照组明显缓慢(P<0.05，表1)。
肿瘤体积与重量间显示出良好的正相关(r＝0.978)，治疗后6周治疗组肿瘤重量(0.12703±0.03782)g明显低于对照组(0.24068±0.14129)g，P<0.05。
表1 治疗开始后每周肿瘤体积(cm3，
±s) 时间(周)对照组
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治疗组
1
0.08058±0.07214
0.07738±0.03440
2
0.09138±0.06392
0.10309±0.04576
3
0.12711±0.07485
0.14610±0.08562
4
0.16118±0.14254
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0.12558±0.05970
5
0.22285±0.13892
0.11695±0.04446
6
0.32380±0.19093
0.17021±0.05046
二、肿瘤形态学改变
1.对照组：肿瘤细胞呈梭形或长椭圆形，细胞体积大，细胞核大，可见核仁，未见明显核分裂相，胞浆丰富，核/浆比约为1：1，肿瘤细胞呈条索状或不规则状排列，有的形成癌巢，中央可见角化和不全角化细胞，胞浆呈较强嗜酸性，有的可见角化珠，未见明显坏死，癌巢间可见少许纤维结缔组织、血管及少量淋巴细胞浸润(图1)。
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图1 对照组肿瘤细胞呈梭形或长椭圆形，细胞体积大，细胞核大，可见核仁，未见明显核分裂相，胞浆丰富，核/浆比约为1：1。肿瘤细胞呈条索状或不规则状排列，有的形成癌巢，中央可见角化和不全角化细胞，胞浆呈较强嗜酸性，有的可见角化珠，未见明显坏死，癌巢间可见少许纤维结缔组织、血管及少量淋巴细胞浸润。HE×400
2. 治疗组：肿瘤组织浅层未见明显细胞坏死，肿瘤细胞形态与对照组肿瘤细胞大致相同，深层可见灶状、片状癌细胞坏死、裂解，可见肿瘤细胞核固缩，胞浆呈红染，残存肿瘤细胞呈簇状分布，坏死的肿瘤组织中可见淋巴细胞浸润，肿瘤间质中可见较多淋巴细胞浸润，血管周围淋巴细胞明显浸润(图2)。
图2 治疗组肿瘤细胞形态与对照组肿瘤细胞大致相同，可见灶状坏死、裂解，可见肿瘤细胞核固缩，胞浆呈红染，残存肿瘤细胞呈簇状分布，坏死的肿瘤组织中可见淋巴细胞浸润，间质中较多淋巴细胞浸润。HE×400倍
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对照组所有脾脏、肝脏均未见肿瘤转移，脾被膜完整，无增厚，脾小结增生不明显。可见1例肺转移结节，肿瘤细胞呈椭圆形，细胞体积大，胞核大，核浆比约为1：1，细胞呈乳头状排列，未形成癌巢，未见明显角化现象。
治疗组肝、脾、肺未见肿瘤转移结节，脾脏红、白髓清晰，被膜完整，无增厚，脾小结明显增生。
讨论
在过继免疫治疗中，效应细胞被转输入荷瘤宿主体内，其对肿瘤的抑制作用与效应细胞的来源和杀伤活性、肿瘤细胞对效应细胞的反应性、效应细胞在肿瘤局部的聚集以及效应细胞在宿主体内存活的时间等多种因素有关。TDLNL较其他LAK细胞来源，如：外周血淋巴细胞、脾细胞及肿瘤浸润淋巴细胞都容易获得，尤其是头颈部恶性肿瘤，颈部淋巴结清扫术可获得大量淋巴结。淋巴结中淋巴细胞含量丰富，我们以往报道每克淋巴结组织可分离到107～108个淋巴细胞[6]，且分离方法简便易行，故此我们认为TDLNL是一种理想的LAK细胞来源。但我们以往研究表明，经静脉注射TDLNL后主要分布于肝脏，脾、肾、肺也有少量分布，而肿瘤中分布极少[3]。而目前临床上淋巴细胞过继免疫治疗对恶性肿瘤疗效不甚满意可能与淋巴细胞在治疗局部分布很少有关。
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为提高淋巴细胞在肿瘤局部的分布，学者们进行了多方面的研究。实验证明，结合抗CD3抗肿瘤的双特异抗体可提高淋巴细胞的抗肿瘤能力[7]。但更为常用的方法是对肿瘤进行局部治疗。有人在头颈部肿瘤患者引流淋巴结周围注射IL-2，可使肿瘤缩小或消退[8,9]。通过动、静脉灌注活化的淋巴细胞和IL-2也取得了较好的疗效[10]。更为直接的肿瘤内和肿瘤周围淋巴细胞和IL-2注射也被证明有满意疗效[4]。本实验通过在肿瘤周围及肿瘤内注射活化的TDLNL，观察到治疗组肿瘤生长较对照组明显缓慢，显微镜下可见肿瘤灶状及片状坏死，肿瘤间质淋巴细胞浸润增多，与Sacchi等[4]观察的结果基本相符。说明活化的TDLNL单独肿瘤局部注射可抑制肿瘤的生长，为TDLNL局部免疫治疗的临床应用提供了实验基础。
机体的免疫状态对肿瘤免疫治疗的影响至为重要，且肿瘤本身对机体免疫功能有抑制作用。我们的实验发现经TDLNL局部治疗的动物，脾小结有不同程度的增生，而对照组动物脾小结无明显增生，说明TDLNL局部治疗对宿主的免疫反应可能有上调作用。
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本实验着重研究活化的TDLNL在肿瘤局部注射对肿瘤的治疗作用及对荷瘤宿主的影响。结果表明：TDLNL的局部应用不但能增加肿瘤局部淋巴细胞的浸润，杀伤肿瘤细胞，并且可能提高宿主免疫功能。因而在头颈部恶性肿瘤的免疫治疗方面显示了较好的应用前景。
由于移植肿瘤与采集淋巴细胞患者的肿瘤不同，故本实验所用的TDLNL实际是一种非特异性LAK细胞。应用于临床时可用肿瘤患者自身的TDLNL回输，并先用其自身肿瘤的肿瘤抗原进行诱导，以提高治疗的特异性。
(本文图1，2见插页第21页)
参考文献
1 Grimn EA,Mazumedr A,Zhang A ,et al.The lymphokine-activated killer cell phenomenon: Lysis of NK resistant fresh solid tumor cells by IL-2 activated autologous human peripheral blood lymphocytes.J Exp Med,1982,155:1823-1841.
, 百拇医药
2 Rosenberg SA,Spress D,Lafreniere R.A new approach to the adoptive immunotherapy of cancer with tumor infitrating lymphocytes. Science , 1986, 233:1318-1321.
3 吴园丁，郭敏.喉癌引流淋巴结淋巴细胞对裸鼠移植人喉癌的治疗观察. 中华耳鼻咽喉科杂志，1996，31:26-28.
4 Sacchi M, Vitolo P, Johnson JT, et al .Induction of tumor regression in experimental model of human head and neck cancer by human A-LAK cells and IL-2. Int J Cancer, 1991, 47:784-791.
, 百拇医药
5 韩德宽，张滨学，王洁良,等.人喉癌裸鼠移植瘤系的建立. 中华耳鼻咽喉科杂志，1993，28：154-156.
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(收稿：1999-02-10 修回：1999-05-02), 百拇医药