红景天素对老龄大鼠嗅球中成纤维细胞生长因子表达的影响及意义
作者：关桂梅 王轶鹏 董震 杨占泉
单位：130031 长春 白求恩医科大学第三临床学院耳鼻咽喉-头颈外科
关键词：嗅球；；成纤维细胞生长因子；大鼠；红景天素
中华耳鼻烟喉科杂志990410 摘要 目的 探讨红景天素对老龄大鼠嗅球中成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)表达的影响及意义。方法 将20只老龄大鼠随机分成注射红景天素实验组(10只)和注射等量生理盐水对照组(10只)。分别取嗅球和嗅粘膜，经石蜡包埋，连续切片，免疫组化染色，光镜观察。结果 实验组嗅球中FGF阳性表达率明显高于对照组(P<0.01)，而2组嗅粘膜均未见FGF表达。结论 红景天素能够提高老龄大鼠嗅球中FGF的阳性表达率,提示其对嗅系统可能具有抗衰老作用。
Effects of rhidosin on expression of fibroblast growth factor on olfactory bulb in senile rats and its significance
, 百拇医药
GUAN Guimei,WANG Yipeng, DONG Zhen, et al.
Department of Otorhinolaryngology & Head and Neck Surgery, Third Teaching Hospital, Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130031
Abstract Objective To discuss the effects of rhidosin on expression of fibroblast growth factor (FGF) on olfactory bulb in senile rats and its significance. Methods Ten rats each were used in the rhidosin group and physiological saline control group. After decapitation, the olfactory mucosa and olfactory bulbs were immediately fixed with neutral formalin, followed with paraffin-embedding, serial sectioning, immunohistochemical staining and light microscopic observation. Results The positive expression rate of FGF on olfactory bulb in the rhidosin group was significantly higher than that in the physiological saline control group (P<0.01). No positive expression of FGF on olfactory mucosa was observed in these two groups. Conclusion Rhidosin can increase the expression of FGF on olfactory bulbs in senile rats and these may be one of the mechanisms by which rhidosin exerts its anti-aging effects on the olfactory system.
, 百拇医药
Key words Olfactory bulb Fibroblast growth factor Rats Rhidosin
红景天(rhodiola)是我国长白山的一种珍贵的药用植物，它的有效成分为甙或甙元[1]，红景天素与其作用基本一致，是一种抗氧化剂，具有明显的抗退变，抗衰老作用，其对中枢系统的抗老化作用已有报道[2]。近年来研究发现，成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)做为神经营养和再生因子，能够维持神经元的生存，促进中枢神经细胞生长、发育及存活[3]。本研究应用免疫组化方法观察红景天素对老龄大鼠嗅系统中FGF表达的影响,并初步探讨其意义。
材料及方法
一、材料
1.药物来源及提取：红景天是由吉林省临江林业局提供的园林栽培3年的干燥根茎。红景天素由白求恩医科大学基础医学院化学教研室参照Saralkov法[4]提取。
, http://www.100md.com
2. 实验动物：所用Wisar大鼠均为雄性，由吉林省药检所动物室提供。体重(408±75.22) kg，18个月龄。
3.免疫组化试剂：所用一抗为FGF兔多克隆抗体(SantaCruz,美国)，二抗为生物素标记的羊抗兔IgG，SP试剂盒由中山生物工程公司提供。
二、 方法
1. 给药方法及标本处理:20只18个月龄Wisar系大鼠喂养至26个月龄，随机分成实验组与对照组，每日上午实验组按15 mg/kg体重，肌肉注射红景天素，对照组给予15 mg/kg体重的生理盐水，连续给药30天，第31天晨将大鼠断头处死，分别取嗅球和嗅粘膜，经中性甲醛固定，石蜡包埋，连续切片4 μm厚。
2. 免疫组化方法:整个免疫组化染色方法参照产品说明书进行：①组织切片脱蜡，PBS洗3次；②滴加3%双氧水(室温20 min)；③加羊血清(室温20 min)；④加1∶100的一抗(37℃，30 min)，PBS洗3次；⑤滴加1∶100二抗(37℃，30 min)，PBS洗3次；⑥滴加过氧化物酶标记的HRP复合物(37℃ 30 min)，PBS洗3次；⑦DAB显色，苏木素复染。阴性对照：以PBS代替一抗。
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结果
FGF阳性产物为棕褐色，主要表达于嗅球的神经纤维层，颗粒细胞层及僧帽细胞层，以前两者居多，位于细胞核，呈强阳性(图1，2)；后者散在，位于细胞质，呈弱阳性(图3)。阴性对照不着色，背景染色清晰，无非特异着色(图4)。实验组10例嗅球标本有9例阳性，(阳性率90.0%)，10例对照组3例呈阳性，(阳性率30.0%)。根据阳性例数表达率进行统计学χ2检验，实验组明显高于对照组(P<0.01)，而2组嗅粘膜标本均未见FGF表达。
图1 老龄鼠嗅球中成纤维细胞生长因子在神经纤维层表达(强阳性)×20 图2 老龄鼠嗅球中成纤维细胞生长因子在颗粒细胞层表达(强阳性)×20 图3 老龄鼠嗅球中成纤维细胞生长因子在僧帽细胞层表达(弱阳性)×20 图4 对照组成纤维细胞生长因子表达阴性×20
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讨论
FGF是含155个氨基酸的碱性蛋白质，为一种多功能活性细胞因子，具有促进创伤修复，诱导微血管形成和营养神经等多种生物学效应。做为神经营养和再生因子，其能够维持神经元的生存，对中枢神经细胞的生长发育及存活都起着关键的作用。
近来，国外学者应用原位杂交、细胞培养等方法对FGF在嗅球中的表达部位及其作用进行了研究，发现FGF mRNA位于鼠脑嗅球的纤维细胞层和僧帽细胞层；FGF可促进嗅感觉神经元细胞的分化，维持正常嗅感觉神经元的存活。研究结果表明：FGF对于调节嗅神经通路及神经纤维功能，延缓嗅神经衰退具有重要的意义[5,6]。
人的嗅觉系统包括：嗅觉感受器嗅球及嗅觉皮质区，其中嗅球属于嗅中枢，结构具有同心圆型板状分层；嗅粘膜是包括嗅觉感受器神经元的鼻上皮，来自于嗅粘膜的嗅神经终止于嗅球，由此将嗅觉冲动传入大脑海马附近的皮质。
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Inamitsu等[7]研究表明：嗅球对于维持正常成熟嗅觉感受神经群具有重要的作用。Cuschieri等[8]指出：嗅球对于嗅上皮内神经元的形成具有决定性作用。因为只有当嗅细胞轴突到达嗅球后嗅毛才能完全成熟。如果单独培养嗅上皮，嗅感觉神经元虽可分化，但不能完全成熟；如果将嗅粘膜与嗅球一起培养，许多感觉神经元可表达多重纤毛及嗅标志蛋白(olfactory marker protein)，且嗅细胞轴突与僧帽细胞之间形成突触。本实验观察了老龄鼠嗅球及嗅粘膜中的FGF表达，发现FGF主要位于嗅神经纤维层，颗粒细胞层及僧帽细胞层，而嗅粘膜中却未见FGF阳性细胞表达。基于FGF对于神经细胞的营养和促分化增殖作用，推测嗅球对嗅神经的促成熟作用可能与嗅球中的FGF密切相关。
红景天素的抗衰老作用已被很多实验所证实。以往公认的是其抗自由基机制。即红景天素能够通过促进细胞蛋白质的合成；降低酸性磷酸酶活性；抑制过氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性；抑制过氧化脂质的形成而消除机体内自由基；阻抑细胞器的退行性变化，发挥其对中枢神经系统的抗老化作用[2]。本实验发现红景天素能够显著提高FGF在老龄大鼠嗅球中的阳性表达率。提示红景天素可能通过嗅球中FGF对嗅神经的营养和促分化增殖作用发挥其对嗅系统的抗衰老作用。
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参考文献
1 陈可冀. 抗衰老中药学. 北京: 中医古籍出版社, 1987. 165.
2 姜文华,王淑兰,关桂梅.红景天素对大鼠中枢神经系统抗衰老作用研究.白求恩医科大学学报,1995,1:8-10.
3 Walicke PA.Interactions between basic fibroblast growth factor (FGF) and glycosoaminoglycans in promoting neurite outgrowth. Exp Neurol,1988,102:144-148.
4 肖雪媛，王淑兰，李淑莲.红景天甙对体外培养人胚胎二倍体成纤维细胞抗衰老研究.老年医学,1991，11：164-166.
5 Gomez-Pinilla F, Cotman CW. Distribution of fibroblast growth factor 5 mRNA in the rat brain: an in situ hybridization study. Brain Res, 1993, 606:79-86.
, http://www.100md.com
6 Key B, Treloar HB, Wangerek L, et al. Expression and localiztion of FGF-1 in the developing rat olfactory system. J Comp Neurol,1996,366:197-206.
7 Inamitsu M, Nakashima T, Uemura T.Immunopathology of olfactory mucosa following injury to the olfactory bulb. J Laryngol Otol, 1990,104: 959-964.
8 Cuschieri A, Bannister LH. The development of the olfactory mucosa in the mouse: light microscopy. J Anat, 1975, 119: 277-286.
(收稿：1998-10-13 修回：1999-03-01), http://www.100md.com
单位：130031 长春 白求恩医科大学第三临床学院耳鼻咽喉-头颈外科
关键词：嗅球；；成纤维细胞生长因子；大鼠；红景天素
中华耳鼻烟喉科杂志990410 摘要 目的 探讨红景天素对老龄大鼠嗅球中成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)表达的影响及意义。方法 将20只老龄大鼠随机分成注射红景天素实验组(10只)和注射等量生理盐水对照组(10只)。分别取嗅球和嗅粘膜，经石蜡包埋，连续切片，免疫组化染色，光镜观察。结果 实验组嗅球中FGF阳性表达率明显高于对照组(P<0.01)，而2组嗅粘膜均未见FGF表达。结论 红景天素能够提高老龄大鼠嗅球中FGF的阳性表达率,提示其对嗅系统可能具有抗衰老作用。
Effects of rhidosin on expression of fibroblast growth factor on olfactory bulb in senile rats and its significance
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GUAN Guimei,WANG Yipeng, DONG Zhen, et al.
Department of Otorhinolaryngology & Head and Neck Surgery, Third Teaching Hospital, Bethune University of Medical Sciences, Changchun 130031
Abstract Objective To discuss the effects of rhidosin on expression of fibroblast growth factor (FGF) on olfactory bulb in senile rats and its significance. Methods Ten rats each were used in the rhidosin group and physiological saline control group. After decapitation, the olfactory mucosa and olfactory bulbs were immediately fixed with neutral formalin, followed with paraffin-embedding, serial sectioning, immunohistochemical staining and light microscopic observation. Results The positive expression rate of FGF on olfactory bulb in the rhidosin group was significantly higher than that in the physiological saline control group (P<0.01). No positive expression of FGF on olfactory mucosa was observed in these two groups. Conclusion Rhidosin can increase the expression of FGF on olfactory bulbs in senile rats and these may be one of the mechanisms by which rhidosin exerts its anti-aging effects on the olfactory system.
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Key words Olfactory bulb Fibroblast growth factor Rats Rhidosin
红景天(rhodiola)是我国长白山的一种珍贵的药用植物，它的有效成分为甙或甙元[1]，红景天素与其作用基本一致，是一种抗氧化剂，具有明显的抗退变，抗衰老作用，其对中枢系统的抗老化作用已有报道[2]。近年来研究发现，成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor, FGF)做为神经营养和再生因子，能够维持神经元的生存，促进中枢神经细胞生长、发育及存活[3]。本研究应用免疫组化方法观察红景天素对老龄大鼠嗅系统中FGF表达的影响,并初步探讨其意义。
材料及方法
一、材料
1.药物来源及提取：红景天是由吉林省临江林业局提供的园林栽培3年的干燥根茎。红景天素由白求恩医科大学基础医学院化学教研室参照Saralkov法[4]提取。
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2. 实验动物：所用Wisar大鼠均为雄性，由吉林省药检所动物室提供。体重(408±75.22) kg，18个月龄。
3.免疫组化试剂：所用一抗为FGF兔多克隆抗体(SantaCruz,美国)，二抗为生物素标记的羊抗兔IgG，SP试剂盒由中山生物工程公司提供。
二、 方法
1. 给药方法及标本处理:20只18个月龄Wisar系大鼠喂养至26个月龄，随机分成实验组与对照组，每日上午实验组按15 mg/kg体重，肌肉注射红景天素，对照组给予15 mg/kg体重的生理盐水，连续给药30天，第31天晨将大鼠断头处死，分别取嗅球和嗅粘膜，经中性甲醛固定，石蜡包埋，连续切片4 μm厚。
2. 免疫组化方法:整个免疫组化染色方法参照产品说明书进行：①组织切片脱蜡，PBS洗3次；②滴加3%双氧水(室温20 min)；③加羊血清(室温20 min)；④加1∶100的一抗(37℃，30 min)，PBS洗3次；⑤滴加1∶100二抗(37℃，30 min)，PBS洗3次；⑥滴加过氧化物酶标记的HRP复合物(37℃ 30 min)，PBS洗3次；⑦DAB显色，苏木素复染。阴性对照：以PBS代替一抗。
, 百拇医药
结果
FGF阳性产物为棕褐色，主要表达于嗅球的神经纤维层，颗粒细胞层及僧帽细胞层，以前两者居多，位于细胞核，呈强阳性(图1，2)；后者散在，位于细胞质，呈弱阳性(图3)。阴性对照不着色，背景染色清晰，无非特异着色(图4)。实验组10例嗅球标本有9例阳性，(阳性率90.0%)，10例对照组3例呈阳性，(阳性率30.0%)。根据阳性例数表达率进行统计学χ2检验，实验组明显高于对照组(P<0.01)，而2组嗅粘膜标本均未见FGF表达。
图1 老龄鼠嗅球中成纤维细胞生长因子在神经纤维层表达(强阳性)×20 图2 老龄鼠嗅球中成纤维细胞生长因子在颗粒细胞层表达(强阳性)×20 图3 老龄鼠嗅球中成纤维细胞生长因子在僧帽细胞层表达(弱阳性)×20 图4 对照组成纤维细胞生长因子表达阴性×20
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讨论
FGF是含155个氨基酸的碱性蛋白质，为一种多功能活性细胞因子，具有促进创伤修复，诱导微血管形成和营养神经等多种生物学效应。做为神经营养和再生因子，其能够维持神经元的生存，对中枢神经细胞的生长发育及存活都起着关键的作用。
近来，国外学者应用原位杂交、细胞培养等方法对FGF在嗅球中的表达部位及其作用进行了研究，发现FGF mRNA位于鼠脑嗅球的纤维细胞层和僧帽细胞层；FGF可促进嗅感觉神经元细胞的分化，维持正常嗅感觉神经元的存活。研究结果表明：FGF对于调节嗅神经通路及神经纤维功能，延缓嗅神经衰退具有重要的意义[5,6]。
人的嗅觉系统包括：嗅觉感受器嗅球及嗅觉皮质区，其中嗅球属于嗅中枢，结构具有同心圆型板状分层；嗅粘膜是包括嗅觉感受器神经元的鼻上皮，来自于嗅粘膜的嗅神经终止于嗅球，由此将嗅觉冲动传入大脑海马附近的皮质。
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Inamitsu等[7]研究表明：嗅球对于维持正常成熟嗅觉感受神经群具有重要的作用。Cuschieri等[8]指出：嗅球对于嗅上皮内神经元的形成具有决定性作用。因为只有当嗅细胞轴突到达嗅球后嗅毛才能完全成熟。如果单独培养嗅上皮，嗅感觉神经元虽可分化，但不能完全成熟；如果将嗅粘膜与嗅球一起培养，许多感觉神经元可表达多重纤毛及嗅标志蛋白(olfactory marker protein)，且嗅细胞轴突与僧帽细胞之间形成突触。本实验观察了老龄鼠嗅球及嗅粘膜中的FGF表达，发现FGF主要位于嗅神经纤维层，颗粒细胞层及僧帽细胞层，而嗅粘膜中却未见FGF阳性细胞表达。基于FGF对于神经细胞的营养和促分化增殖作用，推测嗅球对嗅神经的促成熟作用可能与嗅球中的FGF密切相关。
红景天素的抗衰老作用已被很多实验所证实。以往公认的是其抗自由基机制。即红景天素能够通过促进细胞蛋白质的合成；降低酸性磷酸酶活性；抑制过氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性；抑制过氧化脂质的形成而消除机体内自由基；阻抑细胞器的退行性变化，发挥其对中枢神经系统的抗老化作用[2]。本实验发现红景天素能够显著提高FGF在老龄大鼠嗅球中的阳性表达率。提示红景天素可能通过嗅球中FGF对嗅神经的营养和促分化增殖作用发挥其对嗅系统的抗衰老作用。
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参考文献
1 陈可冀. 抗衰老中药学. 北京: 中医古籍出版社, 1987. 165.
2 姜文华,王淑兰,关桂梅.红景天素对大鼠中枢神经系统抗衰老作用研究.白求恩医科大学学报,1995,1:8-10.
3 Walicke PA.Interactions between basic fibroblast growth factor (FGF) and glycosoaminoglycans in promoting neurite outgrowth. Exp Neurol,1988,102:144-148.
4 肖雪媛，王淑兰，李淑莲.红景天甙对体外培养人胚胎二倍体成纤维细胞抗衰老研究.老年医学,1991，11：164-166.
5 Gomez-Pinilla F, Cotman CW. Distribution of fibroblast growth factor 5 mRNA in the rat brain: an in situ hybridization study. Brain Res, 1993, 606:79-86.
, http://www.100md.com
6 Key B, Treloar HB, Wangerek L, et al. Expression and localiztion of FGF-1 in the developing rat olfactory system. J Comp Neurol,1996,366:197-206.
7 Inamitsu M, Nakashima T, Uemura T.Immunopathology of olfactory mucosa following injury to the olfactory bulb. J Laryngol Otol, 1990,104: 959-964.
8 Cuschieri A, Bannister LH. The development of the olfactory mucosa in the mouse: light microscopy. J Anat, 1975, 119: 277-286.
(收稿：1998-10-13 修回：1999-03-01), http://www.100md.com