耳蜗毛细胞核荧光染色计数法
作者：胡博华 郭维 王沛英
单位：100853 北京 解放军总医院耳鼻咽喉科研究所
关键词：
中华耳鼻烟喉科杂志990523 为寻找一种简便的毛细胞死亡早期检查方法，我们应用细胞核染色的方法进行死亡毛细胞的定量分析，并与毛细胞表皮板检查方法进行比较，现报道如下。
一、材料和方法
1.毛细胞损伤模型：选用纯白豚鼠10只，3只为健康对照组，7只为噪声暴露组。应用中心频率为4 kHz的窄带噪声(115 dB SPL，暴露4 h)损伤耳蜗毛细胞。
2.细胞核染色：噪声暴露20 d处死动物。4%多聚甲醛固定耳蜗组织，按常规耳蜗铺片方法取出基底膜，置于磷酸盐缓冲液内待染。
, http://www.100md.com
应用DNA荧光染料Hoechst 33342进行细胞核染色。Hoechst用蒸馏水配制成1 mmol/L的储藏液，避光保存。染色前将储藏液用磷酸盐缓冲液稀释为10 μmol/L的染色液。将解剖出的基底膜置于2 ml染色液中，避光和室温条件下染色10 min。染色后标本在PBS内清洗、铺片。
3.耳蜗肌动蛋白染色：部分标本(1个健康动物，3个噪声暴露动物)在细胞核染色前应用若丹明标记的毒伞素进行毛细胞表皮板和纤毛肌动蛋白的染色。染色方法见参考文献[1]。
4.标本观察：应用荧光显微镜观察染色的细胞核和表皮板、纤毛。细胞核观察(Hoechst染色)时荧光激发波长为337 nm，发射光波长为430 nm。肌动蛋白染色观察时荧光激发波长为550nm, 发射光波长为580 nm。
二、结果
1.正常毛细胞核Hoechst 33342染色：荧光显微镜下，毛细胞核为灰白色，排列整齐 (图1)。
, 百拇医药
图1 正常耳蜗毛细胞3排外毛细胞核和1排内毛细胞核染色清晰，核大小均匀。 Hoechst 33342染色 ×650
2.噪声暴露后毛细胞核病理改变和计数：噪声暴露后20 d，耳蜗显示出不同程度的毛细胞核病变。在荧光显微镜下，毛细胞核的变化有两种，一是毛细胞核消失，表现为在毛细胞核的位置出现染色空白区；二是毛细胞核肿胀，表现为核体积明显增大，染色变淡，且不均匀。有些肿胀细胞核外形不规则。肿胀的细胞核与周围的外形正常的细胞核明显不同，易于鉴别(图2a)。
图2 噪声后毛细胞核和表皮板变化。a 毛细胞核变化，箭头示肿胀的外毛细胞核，三角示核消失。周围细胞核形态正常，与病变细胞核易于区别。b 同区域表皮板变化(肌动蛋白染色)。白箭头示核消失的毛细胞区域表皮板亦消失。黑箭头示核肿胀毛细胞的表皮板染色正常。 Hoechst 33342染色 ×500
, 百拇医药
3.毛细胞核染色观察与耳蜗肌动蛋白检查比较：在荧光显微镜下，毛细胞肌动蛋白主要分布在毛细胞的纤毛和表皮板。当毛细胞缺失时，表皮板处染色消失，取而代之的是瘢痕条纹。将肌动蛋白染色与毛细胞核染色同部位检查可见：当毛细胞核消失后，该部位毛细胞的表皮板处亦无肌动蛋白染色，说明毛细胞完全消失。而当毛细胞核肿胀时，其表皮板和纤毛染色正常(图2b)。表明细胞核改变早于表皮板改变。
三、讨论
本实验应用细胞核染色方法观察毛细胞核的病理改变，以确定毛细胞的死亡。实验中发现两种毛细胞核的变化：一是细胞核消失，二是细胞核肿胀。毫无疑问细胞核消失是细胞死亡的晚期表现。而细胞核的肿胀一般认为是细胞不可逆损伤的早期表现[2]。所以观察细胞核病理改变不但能统计已经死亡、溶解的细胞数量，还能发现细胞尚存在，但已发生不可逆损伤的细胞。
将表皮板变化与细胞核改变进行比较发现，毛细胞核消失后毛细胞表皮板亦消失，说明细胞核溶解后，表皮板很快消失。但检查出现细胞核明显肿胀的毛细胞时，并未发现表皮板和纤毛染色异常，表明细胞核荧光染色检查明显优于表皮板检查方法，能够发现早期的死亡细胞。
, 百拇医药
在耳蜗病理损伤的研究中，如噪声损伤和耳毒性药物损伤的研究，能够发现早期的死亡细胞有利于判断耳蜗病变的发展。通过比较肿胀细胞核数与缺失细胞核数的比例，可以估计病变是否是急性期或已接近尾声，为研究提供更多的信息。
志谢 北京同仁医院李永新博士为本实验肌动蛋白标记提供了若丹明标记的毒伞素
参考文献
1 Hu BH, Henderson D. Changes in F-actin labeling in the outer hair cell and the Deiters cell in the chinchilla cochlea following noise exposure. Hear Res, 1997, 110: 209-218.
2 Abrams GD. Introduction to general pathology: mechanism of disease. In: Carroll DP, Boynton SD, Cowell MW, eds. Pathophysiology: clinical concepts of disease processes. New York: McGraw-Hill ,1982.5-104.
(收稿：1998-12-07 修回：1999-04-30), http://www.100md.com
单位：100853 北京 解放军总医院耳鼻咽喉科研究所
关键词：
中华耳鼻烟喉科杂志990523 为寻找一种简便的毛细胞死亡早期检查方法，我们应用细胞核染色的方法进行死亡毛细胞的定量分析，并与毛细胞表皮板检查方法进行比较，现报道如下。
一、材料和方法
1.毛细胞损伤模型：选用纯白豚鼠10只，3只为健康对照组，7只为噪声暴露组。应用中心频率为4 kHz的窄带噪声(115 dB SPL，暴露4 h)损伤耳蜗毛细胞。
2.细胞核染色：噪声暴露20 d处死动物。4%多聚甲醛固定耳蜗组织，按常规耳蜗铺片方法取出基底膜，置于磷酸盐缓冲液内待染。
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应用DNA荧光染料Hoechst 33342进行细胞核染色。Hoechst用蒸馏水配制成1 mmol/L的储藏液，避光保存。染色前将储藏液用磷酸盐缓冲液稀释为10 μmol/L的染色液。将解剖出的基底膜置于2 ml染色液中，避光和室温条件下染色10 min。染色后标本在PBS内清洗、铺片。
3.耳蜗肌动蛋白染色：部分标本(1个健康动物，3个噪声暴露动物)在细胞核染色前应用若丹明标记的毒伞素进行毛细胞表皮板和纤毛肌动蛋白的染色。染色方法见参考文献[1]。
4.标本观察：应用荧光显微镜观察染色的细胞核和表皮板、纤毛。细胞核观察(Hoechst染色)时荧光激发波长为337 nm，发射光波长为430 nm。肌动蛋白染色观察时荧光激发波长为550nm, 发射光波长为580 nm。
二、结果
1.正常毛细胞核Hoechst 33342染色：荧光显微镜下，毛细胞核为灰白色，排列整齐 (图1)。
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图1 正常耳蜗毛细胞3排外毛细胞核和1排内毛细胞核染色清晰，核大小均匀。 Hoechst 33342染色 ×650
2.噪声暴露后毛细胞核病理改变和计数：噪声暴露后20 d，耳蜗显示出不同程度的毛细胞核病变。在荧光显微镜下，毛细胞核的变化有两种，一是毛细胞核消失，表现为在毛细胞核的位置出现染色空白区；二是毛细胞核肿胀，表现为核体积明显增大，染色变淡，且不均匀。有些肿胀细胞核外形不规则。肿胀的细胞核与周围的外形正常的细胞核明显不同，易于鉴别(图2a)。
图2 噪声后毛细胞核和表皮板变化。a 毛细胞核变化，箭头示肿胀的外毛细胞核，三角示核消失。周围细胞核形态正常，与病变细胞核易于区别。b 同区域表皮板变化(肌动蛋白染色)。白箭头示核消失的毛细胞区域表皮板亦消失。黑箭头示核肿胀毛细胞的表皮板染色正常。 Hoechst 33342染色 ×500
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3.毛细胞核染色观察与耳蜗肌动蛋白检查比较：在荧光显微镜下，毛细胞肌动蛋白主要分布在毛细胞的纤毛和表皮板。当毛细胞缺失时，表皮板处染色消失，取而代之的是瘢痕条纹。将肌动蛋白染色与毛细胞核染色同部位检查可见：当毛细胞核消失后，该部位毛细胞的表皮板处亦无肌动蛋白染色，说明毛细胞完全消失。而当毛细胞核肿胀时，其表皮板和纤毛染色正常(图2b)。表明细胞核改变早于表皮板改变。
三、讨论
本实验应用细胞核染色方法观察毛细胞核的病理改变，以确定毛细胞的死亡。实验中发现两种毛细胞核的变化：一是细胞核消失，二是细胞核肿胀。毫无疑问细胞核消失是细胞死亡的晚期表现。而细胞核的肿胀一般认为是细胞不可逆损伤的早期表现[2]。所以观察细胞核病理改变不但能统计已经死亡、溶解的细胞数量，还能发现细胞尚存在，但已发生不可逆损伤的细胞。
将表皮板变化与细胞核改变进行比较发现，毛细胞核消失后毛细胞表皮板亦消失，说明细胞核溶解后，表皮板很快消失。但检查出现细胞核明显肿胀的毛细胞时，并未发现表皮板和纤毛染色异常，表明细胞核荧光染色检查明显优于表皮板检查方法，能够发现早期的死亡细胞。
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在耳蜗病理损伤的研究中，如噪声损伤和耳毒性药物损伤的研究，能够发现早期的死亡细胞有利于判断耳蜗病变的发展。通过比较肿胀细胞核数与缺失细胞核数的比例，可以估计病变是否是急性期或已接近尾声，为研究提供更多的信息。
志谢 北京同仁医院李永新博士为本实验肌动蛋白标记提供了若丹明标记的毒伞素
参考文献
1 Hu BH, Henderson D. Changes in F-actin labeling in the outer hair cell and the Deiters cell in the chinchilla cochlea following noise exposure. Hear Res, 1997, 110: 209-218.
2 Abrams GD. Introduction to general pathology: mechanism of disease. In: Carroll DP, Boynton SD, Cowell MW, eds. Pathophysiology: clinical concepts of disease processes. New York: McGraw-Hill ,1982.5-104.
(收稿：1998-12-07 修回：1999-04-30), http://www.100md.com