分泌性中耳炎患者鼻咽部表面活性物质的检测
作者：邱丽华 秦学玲 李芳碧
单位：610041 成都 四川省肿瘤医院耳鼻咽喉科(邱丽华)；华西医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科(秦学玲)；四川省第五人民医院五官科(李芳碧)
关键词：中耳炎；伴渗出性；；磷脂类；；鼻咽；；粘膜
中华耳鼻烟喉科杂志990516 摘要 目的 通过定量测定健康人及分泌性中耳炎(secretory otitis media,SOM)患者鼻咽部灌洗液中代表表面活性物质的卵磷脂含量，进一步证实鼻咽部表面活性物质的存在，以探讨SOM的发病机理。方法 采集健康人和SOM患者鼻咽部灌洗液，用分光光度计法测定卵磷脂含量并进行对照。结果 SOM患者鼻咽部灌洗液中卵磷脂含量为(8.637±2.730)mg/L(
±s，下同)，明显低于健康对照组的(39.212±2.437)mg/L，儿童SOM患者其鼻咽部灌洗液中卵磷脂含量(8.062±2.925)mg/L较健康同龄对照组(39.787±2.557)mg/L显著减少，表面活性物质含量与SOM病程无明显相关。结论局部表面活性物质减少可能是SOM发病机理之一，外源性表面活性物质的应用和促进内源性表面活性物质的分泌可能是预防和治疗SOM的途径之一。
, 百拇医药
Measurement of surfactant in irrigating fluid from the nasopharynx of patients with secretory otitis media
QIU Lihua*, QIN Xueling, LI Fangbi.
*Department of Otorhinolaryngology, First Hospital of West China Medical Science University,Chengdu 610041
Abstract Objective dysfunction of the eustachian tube is believed to play a role in the pathogenesis of secretory otitis media (SOM). In the animal model, previous investigators have found that surfactant in the eustachian tube could decrease the eustachian tube opening pressure and improve eustachian tube functions. Because the nasopharynx is anatomically adjacent to the eustachian tube and the membrane of the nasopharynx continues to the middle ear via the eustachian tube, we hypothesized that the surfactant could also present in the nasopharynx and then designed the following experiment to confirm this hypothesis. Methods The concentrations of surfactants in the nasopharyngeal irrigating fluid were measured in normal control and SOM patients. Results (1) The surfactant from the SOM patients were significantly lower than that from the normal control (8.637±2.730)mg/L vs.(39.212±2.437)mg/L. (2) The concentration of surfactant from child SOM was also significantly lower than that of the normal control (8.062±2.925) mg/L vs. (39.787±2.557) mg/L. (3) The concentration of surfactant of SOM was not associated with the course of SOM. Conclusion Surfactant reduction in the nasopharynx could indirectly reflect the level of the surfactant in the eustachian tube and the middle ear and influence the eustachian tube function. So surfactant reduction is one of the causative factors in SOM. The strategy of increasing surfactant in the nasopharynx and eustachian tube should be beneficial to reducing persistent secretory otitis media.
, 百拇医药
Key words Otitis media with effusion Phospholipids Nasopharynx Mucous membrane
分泌性中耳炎(secretory otitis media ,SOM)的发病与咽鼓管功能障碍、免疫反应及感染有关。咽鼓管功能障碍表现在粘膜表面张力受到其自身分泌表面活性物质影响。我们采用分光光度计法定量测定鼻咽部灌洗液中表面活性物质含量，间接反映SOM患者中耳、咽鼓管表面活性物质的改变。
材料及方法
一、主要试剂与设备
1.试剂：磷标准储备液(100 μg/ml)、磷标准使用液(10μg/ml)、消化液(高氯酸-硝酸1∶4混合液)、5%钼酸铵溶液、Hank 液(均由我院实验室配制)；卵磷脂标准品(重庆东方试剂厂)。
, 百拇医药
2.设备：72型分光光度计(上海分析仪器厂)。
二、实验对象
1. 健康对照组：共40例。本校实习同学身体健康无耳鼻咽喉疾患(成年组)，年龄19～24岁，平均22岁；男14名，女11名。健康儿童(未成年组)，年龄8～12岁，平均10岁；男11名，女4名。
2. SOM组：共40例，本科门诊及住院患者(病程1周～18月)。成年组25例，其中男16例，女9例；年龄18～59岁，平均39岁。未成年组15例，其中男9例，女6例；年龄5～13岁，平均年龄9岁。
3. 诊断标准：①耳闷、耳鸣和听力下降；②鼓膜内陷、活动受限和积液征；③纯音测听：传导性聋；④声导抗：鼓室压图为“B”型、镫骨肌反射消失；⑤鼓膜穿刺抽出积液。
4.排除标准：鼻咽癌所致的SOM，腺样体肥大造成咽鼓管咽口机械阻塞者，伴鼻炎、鼻窦炎者。
, 百拇医药
三、实验方法
1.鼻咽部灌洗液的采集：30 ml 细胞冲洗液在纤维支气管镜下灌洗鼻咽部，回吸液约20～25 ml。
2.鼻咽部灌洗液表面活性物质的测定：采用分光光度计法[1]。
灌洗液经高氯酸-硝酸消化，消化液中的磷在酸性条件下与钼酸铵结合生成磷钼酸铵，此化合物经对苯二酚、亚硫酸钠还原成蓝色化合物——钼蓝。用分光光度计在波长660 nm处测定钼蓝的吸光度在磷标准曲线上求出磷含量，以磷含量乘以25计算出代表表面活性物质的卵磷脂含量。
标准曲线的制备：取25 ml比色管7支，分别加入磷标准使用液各0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，各管再分别加入5%钼酸铵液2 ml，20%亚硫酸钠1 ml、0.5%对苯二酚1ml，加蒸馏水至20 ml，放置30 min后测吸光度值并绘制磷标准曲线图。吸光度值与磷含量之间呈良好的线性关系，相关系数r=0.9984，回归方程为：Y=6.66×10-2X+1.42×10-3，通过每次实验所做的标准曲线，共30次，求得标准曲线的相对标准偏差为2.74%～5.20%。
, http://www.100md.com
样本的测定：经消化的样本和空白对照按标准曲线绘制方法进行显色测定，将测得的吸光度值在磷标准曲线上查出磷含量，并计算出代表表面活性物质的卵磷脂含量。通过连续测定混合样本6次，得到样本相对标准偏差为5.57%。
方法准确度(样本加标回收实验)：取样本6份，每份取20 ml回收液，置于2支比色管中，每管10 ml，其中一管加入卵磷脂标准品30 μg，一管不加， 按测定样本的方法进行测定，将测定结果在磷标准曲线上查出磷含量，然后求出卵磷脂的回收率。回收率为86%～90%。
结果
1.SOM 患者鼻咽部灌洗液表面活性物质含量的测定：鼻咽部灌洗液中代表表面活性物质的卵磷脂含量健康对照组为(39.212±2.437)mg/L (±s，下同)，SOM 患者为(8.637±2.730)mg/L，两组比较经t检验(t =3.252)差异有显著性(P<0.005)。
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2.按年龄分组，SOM患者鼻咽灌洗液中表面活性物质的卵磷脂含量与健康对照组的比较见表1。
表1 不同年龄组SOM患者鼻咽部灌洗液卵磷脂含量(±s)与健康对照组比较 分组
例数
卵磷脂含量(mg/L)
t值
P 值
SOM组
健康对照组
未成年
15
, 百拇医药
8.062±2.925
39.787±2.557
3.197
0.005
成年
25
9.478±2.313
38.656±2.278
3.174
0.005
3. 不同病程SOM患者鼻咽灌洗液中卵磷脂含量测定见表2。表2 不同病程SOM患者鼻咽部灌洗液卵磷脂含量(±s) 病 程
, 百拇医药
例数
卵磷脂含量(mg/L)
3个月以内
14
8.276±2.437
3～12个月
17
9.062±2.336
1年+
9
8.677±3.487
不同病程SOM患者鼻咽灌洗液中卵磷脂量经方差分析P=0.1，差异无显著性。讨论
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关于分泌性中耳炎发病因素研究，目前认为主要由咽鼓管功能障碍、感染因素和免疫变态反应因素所致，其中作为主要病因的咽鼓管功能障碍又分为机械性阻塞和功能性阻塞。1963年 Flisberg等[2]首先提出在咽鼓管中可能存在与肺表面活性物质相似的物质，认为表面活性物质参与了咽鼓管的开放机制。Tsuruhara等[3](1989)和 Fornadley等[4](1994)经动物实验证实表面活性物质与咽鼓管的开放有关。历年来有关表面活性物质与SOM 关系的基础研究表明，中耳腔、咽鼓管及鼻咽部的确存在着表面活性物质及其分泌细胞，并证实了它对咽鼓管开放的影响。本实验结果表明，SOM 患者鼻咽部灌洗液中代表表面活性物质的卵磷脂量比健康对照组明显减少，与其他学者实验相吻合。
为了科学、准确地测定鼻咽部表面活性物质，本实验采用仰卧垂头位、使鼻咽部处于最低位，在纤维支气管镜直视下冲洗鼻咽部，每次灌入2～4 ml，共30 ml，并立即回吸冲洗液，使每份样品中所含物质仅来自鼻咽部，且容积相同，从而保证样品不受污染和取量客观、准确。在测定表面活性物质的实验方法上采用精确度较高的分光光度法，测定灌洗液中磷含量来换算卵磷脂量，而表面活性物质的主要成分为卵磷脂，因此可定量反映出灌洗液中表面活性物质含量。在实验测定中所做标准曲线相对标准偏差低，样本加标回收实验其磷回收率高，说明实验所得数据准确、可靠，为定量测定鼻咽部表面活性物质建立了一个可靠、简单的方法。
, 百拇医药
SOM 患者以儿童居多，长期中耳积液可导致听力损害，语言发育迟缓，慢性中耳炎急性发作。有学者认为主要与儿童鼻咽、中耳及咽鼓管局部解剖和免疫功能不健全有关[5]。本实验把12岁以下SOM患者与健康对照组相应年龄组进行了鼻咽灌洗液中卵磷脂含量对比分析，发现SOM患儿的卵磷脂明显低于同龄健康儿童。结果还表明，健康对照组及SOM组中未成年与成年组比较，鼻咽部灌洗液中卵磷脂含量差异无显著性，说明局部表面活性物质的含量可能与年龄无关。
SOM患者不同病程组中，卵磷脂含量差异无显著性，说明鼻咽部表面活性物质的变化不能反映病程的长短，这可能与SOM是一慢性炎症性疾病有关。疾病进入慢性稳定阶段,其病理改变和局部反应趋于缓慢、渐进,因此影响咽鼓管开放功能的表面活性物质也呈现了较稳定结果。表面活性物质减少是SOM的病因还是结果尚有争议，更多学者认为表面活性物质减少影响了咽鼓管的开放压是SOM发病机制之一[6，7]。因此，我们考虑外源性表面活性物质的应用和促进内源性表面活性物质的分泌可能是预防和治疗SOM的途径之一。
, 百拇医药
本课题系四川省科委科研基金资助项目(编号：G0096)
参考文献
1 崔福生.医学生化检验手册.天津：天津科学技术出版社，1982.235-238.
2 Flisberg K, Zngelstedt S, Ortegren U, The valve and “locking” mechanisms of the eustachian tube. Acta Otolaryngol Suppl, 1963,182:57-68.
3 Tsuruhara K, Morii S, Kumazawa T, Ultracytochemical demonstration of phospholipids in the surface layer of the guinea pig eustachian tube. Acta Otolaryngol, 1989,108:434-441.
, 百拇医药
4 Fornadley JA, Burns JK. The effect of surfactant on eustachian tube function in a gerbil model of Otitis media with effusion. Otolaryngol Head Neck Surg, 1994, 110: 110-114.
5 White P. Effect of exogenous surfactant on eustachian tube function in the rat. Am J Otolaryngol, 1989,10:301-304.
6 Grace A, Kwok P, Hawke M. Surfactant in middle ear effusions. Otolaryngol Head Neck Surg, 1987,96:336-340.
7 杨伟炎，王荣光，孙建和,等. 咽鼓管粘膜分泌细胞与表面活性物质样板层体的观察. 中华耳鼻咽喉科杂志, 1995,30:224-226.
(收稿：1999-01-11 修回：1999-07-12), 百拇医药
单位：610041 成都 四川省肿瘤医院耳鼻咽喉科(邱丽华)；华西医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科(秦学玲)；四川省第五人民医院五官科(李芳碧)
关键词：中耳炎；伴渗出性；；磷脂类；；鼻咽；；粘膜
中华耳鼻烟喉科杂志990516 摘要 目的 通过定量测定健康人及分泌性中耳炎(secretory otitis media,SOM)患者鼻咽部灌洗液中代表表面活性物质的卵磷脂含量，进一步证实鼻咽部表面活性物质的存在，以探讨SOM的发病机理。方法 采集健康人和SOM患者鼻咽部灌洗液，用分光光度计法测定卵磷脂含量并进行对照。结果 SOM患者鼻咽部灌洗液中卵磷脂含量为(8.637±2.730)mg/L(
±s，下同)，明显低于健康对照组的(39.212±2.437)mg/L，儿童SOM患者其鼻咽部灌洗液中卵磷脂含量(8.062±2.925)mg/L较健康同龄对照组(39.787±2.557)mg/L显著减少，表面活性物质含量与SOM病程无明显相关。结论局部表面活性物质减少可能是SOM发病机理之一，外源性表面活性物质的应用和促进内源性表面活性物质的分泌可能是预防和治疗SOM的途径之一。, 百拇医药
Measurement of surfactant in irrigating fluid from the nasopharynx of patients with secretory otitis media
QIU Lihua*, QIN Xueling, LI Fangbi.
*Department of Otorhinolaryngology, First Hospital of West China Medical Science University,Chengdu 610041
Abstract Objective dysfunction of the eustachian tube is believed to play a role in the pathogenesis of secretory otitis media (SOM). In the animal model, previous investigators have found that surfactant in the eustachian tube could decrease the eustachian tube opening pressure and improve eustachian tube functions. Because the nasopharynx is anatomically adjacent to the eustachian tube and the membrane of the nasopharynx continues to the middle ear via the eustachian tube, we hypothesized that the surfactant could also present in the nasopharynx and then designed the following experiment to confirm this hypothesis. Methods The concentrations of surfactants in the nasopharyngeal irrigating fluid were measured in normal control and SOM patients. Results (1) The surfactant from the SOM patients were significantly lower than that from the normal control (8.637±2.730)mg/L vs.(39.212±2.437)mg/L. (2) The concentration of surfactant from child SOM was also significantly lower than that of the normal control (8.062±2.925) mg/L vs. (39.787±2.557) mg/L. (3) The concentration of surfactant of SOM was not associated with the course of SOM. Conclusion Surfactant reduction in the nasopharynx could indirectly reflect the level of the surfactant in the eustachian tube and the middle ear and influence the eustachian tube function. So surfactant reduction is one of the causative factors in SOM. The strategy of increasing surfactant in the nasopharynx and eustachian tube should be beneficial to reducing persistent secretory otitis media.
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Key words Otitis media with effusion Phospholipids Nasopharynx Mucous membrane
分泌性中耳炎(secretory otitis media ,SOM)的发病与咽鼓管功能障碍、免疫反应及感染有关。咽鼓管功能障碍表现在粘膜表面张力受到其自身分泌表面活性物质影响。我们采用分光光度计法定量测定鼻咽部灌洗液中表面活性物质含量，间接反映SOM患者中耳、咽鼓管表面活性物质的改变。
材料及方法
一、主要试剂与设备
1.试剂：磷标准储备液(100 μg/ml)、磷标准使用液(10μg/ml)、消化液(高氯酸-硝酸1∶4混合液)、5%钼酸铵溶液、Hank 液(均由我院实验室配制)；卵磷脂标准品(重庆东方试剂厂)。
, 百拇医药
2.设备：72型分光光度计(上海分析仪器厂)。
二、实验对象
1. 健康对照组：共40例。本校实习同学身体健康无耳鼻咽喉疾患(成年组)，年龄19～24岁，平均22岁；男14名，女11名。健康儿童(未成年组)，年龄8～12岁，平均10岁；男11名，女4名。
2. SOM组：共40例，本科门诊及住院患者(病程1周～18月)。成年组25例，其中男16例，女9例；年龄18～59岁，平均39岁。未成年组15例，其中男9例，女6例；年龄5～13岁，平均年龄9岁。
3. 诊断标准：①耳闷、耳鸣和听力下降；②鼓膜内陷、活动受限和积液征；③纯音测听：传导性聋；④声导抗：鼓室压图为“B”型、镫骨肌反射消失；⑤鼓膜穿刺抽出积液。
4.排除标准：鼻咽癌所致的SOM，腺样体肥大造成咽鼓管咽口机械阻塞者，伴鼻炎、鼻窦炎者。
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三、实验方法
1.鼻咽部灌洗液的采集：30 ml 细胞冲洗液在纤维支气管镜下灌洗鼻咽部，回吸液约20～25 ml。
2.鼻咽部灌洗液表面活性物质的测定：采用分光光度计法[1]。
灌洗液经高氯酸-硝酸消化，消化液中的磷在酸性条件下与钼酸铵结合生成磷钼酸铵，此化合物经对苯二酚、亚硫酸钠还原成蓝色化合物——钼蓝。用分光光度计在波长660 nm处测定钼蓝的吸光度在磷标准曲线上求出磷含量，以磷含量乘以25计算出代表表面活性物质的卵磷脂含量。
标准曲线的制备：取25 ml比色管7支，分别加入磷标准使用液各0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 ml，各管再分别加入5%钼酸铵液2 ml，20%亚硫酸钠1 ml、0.5%对苯二酚1ml，加蒸馏水至20 ml，放置30 min后测吸光度值并绘制磷标准曲线图。吸光度值与磷含量之间呈良好的线性关系，相关系数r=0.9984，回归方程为：Y=6.66×10-2X+1.42×10-3，通过每次实验所做的标准曲线，共30次，求得标准曲线的相对标准偏差为2.74%～5.20%。
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样本的测定：经消化的样本和空白对照按标准曲线绘制方法进行显色测定，将测得的吸光度值在磷标准曲线上查出磷含量，并计算出代表表面活性物质的卵磷脂含量。通过连续测定混合样本6次，得到样本相对标准偏差为5.57%。
方法准确度(样本加标回收实验)：取样本6份，每份取20 ml回收液，置于2支比色管中，每管10 ml，其中一管加入卵磷脂标准品30 μg，一管不加， 按测定样本的方法进行测定，将测定结果在磷标准曲线上查出磷含量，然后求出卵磷脂的回收率。回收率为86%～90%。
结果
1.SOM 患者鼻咽部灌洗液表面活性物质含量的测定：鼻咽部灌洗液中代表表面活性物质的卵磷脂含量健康对照组为(39.212±2.437)mg/L (
±s，下同)，SOM 患者为(8.637±2.730)mg/L，两组比较经t检验(t =3.252)差异有显著性(P<0.005)。, http://www.100md.com
2.按年龄分组，SOM患者鼻咽灌洗液中表面活性物质的卵磷脂含量与健康对照组的比较见表1。
表1 不同年龄组SOM患者鼻咽部灌洗液卵磷脂含量(
±s)与健康对照组比较 分组例数
卵磷脂含量(mg/L)
t值
P 值
SOM组
健康对照组
未成年
15
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8.062±2.925
39.787±2.557
3.197
0.005
成年
25
9.478±2.313
38.656±2.278
3.174
0.005
3. 不同病程SOM患者鼻咽灌洗液中卵磷脂含量测定见表2。表2 不同病程SOM患者鼻咽部灌洗液卵磷脂含量(
±s) 病 程, 百拇医药
例数
卵磷脂含量(mg/L)
3个月以内
14
8.276±2.437
3～12个月
17
9.062±2.336
1年+
9
8.677±3.487
不同病程SOM患者鼻咽灌洗液中卵磷脂量经方差分析P=0.1，差异无显著性。讨论
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关于分泌性中耳炎发病因素研究，目前认为主要由咽鼓管功能障碍、感染因素和免疫变态反应因素所致，其中作为主要病因的咽鼓管功能障碍又分为机械性阻塞和功能性阻塞。1963年 Flisberg等[2]首先提出在咽鼓管中可能存在与肺表面活性物质相似的物质，认为表面活性物质参与了咽鼓管的开放机制。Tsuruhara等[3](1989)和 Fornadley等[4](1994)经动物实验证实表面活性物质与咽鼓管的开放有关。历年来有关表面活性物质与SOM 关系的基础研究表明，中耳腔、咽鼓管及鼻咽部的确存在着表面活性物质及其分泌细胞，并证实了它对咽鼓管开放的影响。本实验结果表明，SOM 患者鼻咽部灌洗液中代表表面活性物质的卵磷脂量比健康对照组明显减少，与其他学者实验相吻合。
为了科学、准确地测定鼻咽部表面活性物质，本实验采用仰卧垂头位、使鼻咽部处于最低位，在纤维支气管镜直视下冲洗鼻咽部，每次灌入2～4 ml，共30 ml，并立即回吸冲洗液，使每份样品中所含物质仅来自鼻咽部，且容积相同，从而保证样品不受污染和取量客观、准确。在测定表面活性物质的实验方法上采用精确度较高的分光光度法，测定灌洗液中磷含量来换算卵磷脂量，而表面活性物质的主要成分为卵磷脂，因此可定量反映出灌洗液中表面活性物质含量。在实验测定中所做标准曲线相对标准偏差低，样本加标回收实验其磷回收率高，说明实验所得数据准确、可靠，为定量测定鼻咽部表面活性物质建立了一个可靠、简单的方法。
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SOM 患者以儿童居多，长期中耳积液可导致听力损害，语言发育迟缓，慢性中耳炎急性发作。有学者认为主要与儿童鼻咽、中耳及咽鼓管局部解剖和免疫功能不健全有关[5]。本实验把12岁以下SOM患者与健康对照组相应年龄组进行了鼻咽灌洗液中卵磷脂含量对比分析，发现SOM患儿的卵磷脂明显低于同龄健康儿童。结果还表明，健康对照组及SOM组中未成年与成年组比较，鼻咽部灌洗液中卵磷脂含量差异无显著性，说明局部表面活性物质的含量可能与年龄无关。
SOM患者不同病程组中，卵磷脂含量差异无显著性，说明鼻咽部表面活性物质的变化不能反映病程的长短，这可能与SOM是一慢性炎症性疾病有关。疾病进入慢性稳定阶段,其病理改变和局部反应趋于缓慢、渐进,因此影响咽鼓管开放功能的表面活性物质也呈现了较稳定结果。表面活性物质减少是SOM的病因还是结果尚有争议，更多学者认为表面活性物质减少影响了咽鼓管的开放压是SOM发病机制之一[6，7]。因此，我们考虑外源性表面活性物质的应用和促进内源性表面活性物质的分泌可能是预防和治疗SOM的途径之一。
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本课题系四川省科委科研基金资助项目(编号：G0096)
参考文献
1 崔福生.医学生化检验手册.天津：天津科学技术出版社，1982.235-238.
2 Flisberg K, Zngelstedt S, Ortegren U, The valve and “locking” mechanisms of the eustachian tube. Acta Otolaryngol Suppl, 1963,182:57-68.
3 Tsuruhara K, Morii S, Kumazawa T, Ultracytochemical demonstration of phospholipids in the surface layer of the guinea pig eustachian tube. Acta Otolaryngol, 1989,108:434-441.
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4 Fornadley JA, Burns JK. The effect of surfactant on eustachian tube function in a gerbil model of Otitis media with effusion. Otolaryngol Head Neck Surg, 1994, 110: 110-114.
5 White P. Effect of exogenous surfactant on eustachian tube function in the rat. Am J Otolaryngol, 1989,10:301-304.
6 Grace A, Kwok P, Hawke M. Surfactant in middle ear effusions. Otolaryngol Head Neck Surg, 1987,96:336-340.
7 杨伟炎，王荣光，孙建和,等. 咽鼓管粘膜分泌细胞与表面活性物质样板层体的观察. 中华耳鼻咽喉科杂志, 1995,30:224-226.
(收稿：1999-01-11 修回：1999-07-12), 百拇医药