Ki67和转化生长因子α在中耳胆脂瘤中的表达
作者：许昱 金康业 董卫国
单位：430060 武汉 湖北医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科(许昱、董卫国)；湖北医科大学附属第二医院(金康业)
关键词：
中华耳鼻烟喉科杂志990533 研究表明胆脂瘤上皮具有高度增殖性，其与胆脂瘤的发生、发展密切相关。细胞周期相关核抗原Ki67是一种广泛应用的细胞增殖标志物，转化生长因子α(transforming growth factor alpha, TGF-α)是一种重要的细胞生长调节因子。我们采用免疫组化方法观察Ki67、TGFα在中耳胆脂瘤中的分布和表达水平，报道如下。
一、材料和方法
1. 材料：取自1995～1998年慢性化脓性中耳炎患者，包括胆脂瘤组织22例，外耳道骨部皮肤10例。胆脂瘤患者男女之比为13∶9，年龄11～57岁。标本于中耳手术中取出，术后立即用10%甲醛固定，常规石蜡包埋，作4 μm厚的连续切片，其中之一作HE染色。胆脂瘤标本均经有经验的病理医师阅片证实。
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2. 试剂：鼠抗人TGFα单抗IgG2a(Oncogene research公司，美国)，与人或鼠表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)无交叉反应，购自武汉博士德生物工程有限公司。鼠抗人Ki67单抗IgG1(克隆号MIB1)及免疫组化SP试剂盒均为美国Maxim公司产品，购自福州迈新生物技术开发公司。
3. 方法：采用免疫组化SP染色法，实验步骤参照SP试剂盒说明书，显色剂为DAB。阴性对照用PBS取代一抗。以排除非特异性染色。
4. 结果判断：细胞浆出现棕黄色颗粒为TGFα阳性细胞，细胞核出现棕黄色颗粒为Ki67阳性细胞。根据染色强度分为弱阳性(淡黄色)，中等阳性(棕色)，强阳性(棕褐色)。
5. 计算机图像分析：采用MAPIAS-500多媒体彩色图文分析系统对染色结果进行定量分析，每个标本看一张切片。每张切片选取阳性颗粒清晰，无非特异性背景着色，并能反映该切片染色强度的部位为代表性部位。在1.718×105μm2测量窗下，测量上皮阳性细胞的平均积分光密度，取其均值为该标本的测量结果。对Ki67的染色切片，同时还测量其面数密度(单位面积中的阳性细胞数目)，从而推算出Ki67阳性指数=平均积分光密度×面数密度。
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6. 统计分析：采用两样本均数的t检验进行差异性分析。
二、结果
Ki67染色32例标本均为阳性，外耳道皮肤的阳性细胞胞核着色浅淡，数目少，局限于上皮基底层(图1)，皮下组织未见阳性细胞。胆脂瘤上皮阳性细胞数目较多，染色较深，部分标本(8/22)阳性细胞不仅出现于基底层，还延伸到基底层以上的棘细胞层(图2)。Ki67在胆脂瘤上皮组织中的表达具有明显异质性，不同标本及同一标本的不同部位染色强度不同，大致趋势为炎性反应较强的组织中染色强度较高，胆脂瘤上皮下结缔组织中可见散在或密集的阳性细胞。Ki67阳性指数(
±s)外耳道皮肤为(19.11±8.06)，中耳胆脂瘤为(40.43±13.50)个，t=6.60，P<0.001。
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图1 外耳道皮肤中Ki67的表达。阳性细胞局限于上皮基底层，着色淡，数目少；皮下组织为阴性。SP染色 ×133 图2 胆脂瘤中Ki67的表达。上皮基底层及相邻棘层细胞出现胞核的强阳性反应，皮下组织可见散在阳性细胞。SP染色 ×133
TGFα染色所有外耳道皮肤标本均呈弱阳性，表现为淡黄色颗粒在表皮全层稀疏均一地分布(图3)，皮下组织未见阳性细胞。所有胆脂瘤标本均呈中等或强阳性，棕黄色颗粒密布于上皮各层细胞的胞浆中(图4)，平均积分光密度为2.321，显著高于外耳道表皮(1.465)，P<0.05。
图3 外耳道皮肤中TGFα的表达。淡黄色颗粒稀疏散在于上皮全层细胞的胞浆。SP染色 ×133 图4 胆脂瘤中TGFα的表达。上皮全层细胞胞浆呈现均一的强阳性反应，皮下组织可见散在阳性细胞。SP染色 ×133
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阴性对照片无着色。
三、讨论
Ki67是由Gerdes等于1983年发现的位于核内的大分子蛋白，它存在于细胞周期的G1后期、S1、S2、M期，而不存在于静止G0期细胞。其功能与染色质和细胞有丝分裂有关，但确切功能尚不清楚。由于它能反映全部增殖细胞活性，因而广泛用于肿瘤及非肿瘤疾病的增殖细胞动力学研究。1993年Key 等[1]制备出针对Ki67抗原决定族的单克隆抗体MIB1，可用于常规石蜡切片，据认为是目前最好的细胞增生标记。
本研究结果说明胆脂瘤上皮细胞处于一种异常的增生分化状态，Ki67在胆脂瘤上皮中的表达呈异质性，提示局部的炎性反应可能提高上皮细胞的增殖能力。
TGFα是一种重要的生长因子，体外实验显示TGFα能诱导人类角质细胞的增生、分化[2]，在很多鳞状细胞癌及上皮增生性疾病如银屑病中都发现有TGF-α的过度表达[3]，自身更新较快的正常上皮组织(如皮肤)中也存在极低量的TGFα mRNA。本研究中胆脂瘤上皮的TGFα的表达显著高于外耳道皮肤，说明TGFα以一种活性增高的自分泌调节方式促进了胆脂瘤上皮的细胞增生。
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参考文献
1 Key G, Becker MHG, Baron B, et al. New Ki67-equivalent murine monoclonal antibodies (MIB1-3) generated against bacterially expressed parts of the Ki67 cDNA containing three 62 base pair repetitive elements encoding for the KI67 epitope. Lab Invest, 1993,68:629-636.
2 Coffey RJ, Derynck R, Wilcox JN, et al. Production and auto-induction of transforming growth factor alpha in human keratinocytes. Nature, 1987,328:817-830.
3 James T, Elder GJ, Fisher PB, et al. Overexpression of transforming growth factor α in psoriatic epidermis. Science,1989,243:811-813.
(收稿：1998-11-06 修回：1999-05-28), http://www.100md.com
单位：430060 武汉 湖北医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科(许昱、董卫国)；湖北医科大学附属第二医院(金康业)
关键词：
中华耳鼻烟喉科杂志990533 研究表明胆脂瘤上皮具有高度增殖性，其与胆脂瘤的发生、发展密切相关。细胞周期相关核抗原Ki67是一种广泛应用的细胞增殖标志物，转化生长因子α(transforming growth factor alpha, TGF-α)是一种重要的细胞生长调节因子。我们采用免疫组化方法观察Ki67、TGFα在中耳胆脂瘤中的分布和表达水平，报道如下。
一、材料和方法
1. 材料：取自1995～1998年慢性化脓性中耳炎患者，包括胆脂瘤组织22例，外耳道骨部皮肤10例。胆脂瘤患者男女之比为13∶9，年龄11～57岁。标本于中耳手术中取出，术后立即用10%甲醛固定，常规石蜡包埋，作4 μm厚的连续切片，其中之一作HE染色。胆脂瘤标本均经有经验的病理医师阅片证实。
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2. 试剂：鼠抗人TGFα单抗IgG2a(Oncogene research公司，美国)，与人或鼠表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)无交叉反应，购自武汉博士德生物工程有限公司。鼠抗人Ki67单抗IgG1(克隆号MIB1)及免疫组化SP试剂盒均为美国Maxim公司产品，购自福州迈新生物技术开发公司。
3. 方法：采用免疫组化SP染色法，实验步骤参照SP试剂盒说明书，显色剂为DAB。阴性对照用PBS取代一抗。以排除非特异性染色。
4. 结果判断：细胞浆出现棕黄色颗粒为TGFα阳性细胞，细胞核出现棕黄色颗粒为Ki67阳性细胞。根据染色强度分为弱阳性(淡黄色)，中等阳性(棕色)，强阳性(棕褐色)。
5. 计算机图像分析：采用MAPIAS-500多媒体彩色图文分析系统对染色结果进行定量分析，每个标本看一张切片。每张切片选取阳性颗粒清晰，无非特异性背景着色，并能反映该切片染色强度的部位为代表性部位。在1.718×105μm2测量窗下，测量上皮阳性细胞的平均积分光密度，取其均值为该标本的测量结果。对Ki67的染色切片，同时还测量其面数密度(单位面积中的阳性细胞数目)，从而推算出Ki67阳性指数=平均积分光密度×面数密度。
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6. 统计分析：采用两样本均数的t检验进行差异性分析。
二、结果
Ki67染色32例标本均为阳性，外耳道皮肤的阳性细胞胞核着色浅淡，数目少，局限于上皮基底层(图1)，皮下组织未见阳性细胞。胆脂瘤上皮阳性细胞数目较多，染色较深，部分标本(8/22)阳性细胞不仅出现于基底层，还延伸到基底层以上的棘细胞层(图2)。Ki67在胆脂瘤上皮组织中的表达具有明显异质性，不同标本及同一标本的不同部位染色强度不同，大致趋势为炎性反应较强的组织中染色强度较高，胆脂瘤上皮下结缔组织中可见散在或密集的阳性细胞。Ki67阳性指数(
±s)外耳道皮肤为(19.11±8.06)，中耳胆脂瘤为(40.43±13.50)个，t=6.60，P<0.001。, http://www.100md.com
图1 外耳道皮肤中Ki67的表达。阳性细胞局限于上皮基底层，着色淡，数目少；皮下组织为阴性。SP染色 ×133 图2 胆脂瘤中Ki67的表达。上皮基底层及相邻棘层细胞出现胞核的强阳性反应，皮下组织可见散在阳性细胞。SP染色 ×133
TGFα染色所有外耳道皮肤标本均呈弱阳性，表现为淡黄色颗粒在表皮全层稀疏均一地分布(图3)，皮下组织未见阳性细胞。所有胆脂瘤标本均呈中等或强阳性，棕黄色颗粒密布于上皮各层细胞的胞浆中(图4)，平均积分光密度为2.321，显著高于外耳道表皮(1.465)，P<0.05。
图3 外耳道皮肤中TGFα的表达。淡黄色颗粒稀疏散在于上皮全层细胞的胞浆。SP染色 ×133 图4 胆脂瘤中TGFα的表达。上皮全层细胞胞浆呈现均一的强阳性反应，皮下组织可见散在阳性细胞。SP染色 ×133
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阴性对照片无着色。
三、讨论
Ki67是由Gerdes等于1983年发现的位于核内的大分子蛋白，它存在于细胞周期的G1后期、S1、S2、M期，而不存在于静止G0期细胞。其功能与染色质和细胞有丝分裂有关，但确切功能尚不清楚。由于它能反映全部增殖细胞活性，因而广泛用于肿瘤及非肿瘤疾病的增殖细胞动力学研究。1993年Key 等[1]制备出针对Ki67抗原决定族的单克隆抗体MIB1，可用于常规石蜡切片，据认为是目前最好的细胞增生标记。
本研究结果说明胆脂瘤上皮细胞处于一种异常的增生分化状态，Ki67在胆脂瘤上皮中的表达呈异质性，提示局部的炎性反应可能提高上皮细胞的增殖能力。
TGFα是一种重要的生长因子，体外实验显示TGFα能诱导人类角质细胞的增生、分化[2]，在很多鳞状细胞癌及上皮增生性疾病如银屑病中都发现有TGF-α的过度表达[3]，自身更新较快的正常上皮组织(如皮肤)中也存在极低量的TGFα mRNA。本研究中胆脂瘤上皮的TGFα的表达显著高于外耳道皮肤，说明TGFα以一种活性增高的自分泌调节方式促进了胆脂瘤上皮的细胞增生。
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参考文献
1 Key G, Becker MHG, Baron B, et al. New Ki67-equivalent murine monoclonal antibodies (MIB1-3) generated against bacterially expressed parts of the Ki67 cDNA containing three 62 base pair repetitive elements encoding for the KI67 epitope. Lab Invest, 1993,68:629-636.
2 Coffey RJ, Derynck R, Wilcox JN, et al. Production and auto-induction of transforming growth factor alpha in human keratinocytes. Nature, 1987,328:817-830.
3 James T, Elder GJ, Fisher PB, et al. Overexpression of transforming growth factor α in psoriatic epidermis. Science,1989,243:811-813.
(收稿：1998-11-06 修回：1999-05-28), http://www.100md.com