小鼠耳蜗胆碱乙酰化酶免疫反应的定位和分布
作者：杨仕明 姜泗长 杨伟炎 顾瑞 山下敏夫
单位：
100853北京 解放军总医院耳鼻咽喉科(杨仕明、姜泗长、杨伟炎、顾瑞)；日本关西医科大学耳鼻咽喉科(山下敏夫)
关键词：
中华耳鼻烟喉科杂志990532 大量研究表明，在哺乳动物中，乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)是耳蜗传出神经系统的主要递质，但大部分研究只涉及内侧系统。在一些涉及外侧系统的研究中大部分也仅用乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, AChE)观察耳蜗传出神经纤维的分布[1]。目前认为AChE不是可靠的胆碱能神经标记物，而ACh合成酶——胆碱乙酰化酶(choline acetyltransferase，ChAT)被认为是胆碱能神经最特异标记物[1,2]。本研究用免疫荧光法观察ChAT免疫反应在耳蜗中的分布，以确定ACh是否为耳蜗传出神经双侧系统的神经递质。
, 百拇医药
一、材料与方法
C57BL/6CrSIC成年小鼠18只，由日本关西医科大学实验动物中心提供，雌雄不拘。动物处死后迅速取出颞骨置于0.1 mol/L磷酸缓冲盐液，取下双侧耳蜗(一侧为实验组，另一侧为对照组)置于4%甲醛4℃固定1 h后，用磷酸缓冲盐液连续振洗20 min。去除耳蜗骨壁、螺旋韧带、血管纹、盖膜及大部分Reissner膜，制成基底膜铺片标本。标本经10%羊血清室温下封闭40 min，以减少非特异性染色。加入兔抗ChAT多克隆抗体(1:250, Chemicon International , 美国) 4℃下孵育过夜。滴加荧光素标记的羊抗兔IgG (1:25, Jackson Immunoresearch , 美国)室温下孵育20 min，每次孵育后，均在0.1 mol/L 磷酸缓冲盐液中连续振洗3次，每次5 min。标本经二甲苯透明，树脂胶封片，荧光显微镜(BH-2，Olympus, 日本)下观察。抗体稀释液为:1%羊血清，0.3% Triton X-100。用0.1 mol/L 磷酸缓冲盐液代替一抗做阴性对照。
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二、结果
免疫荧光显微镜下观察ChAT免疫阳性反应可见于小鼠耳蜗基底膜铺片中3排外毛细胞底部和穿行纤维(crossing fiber, CF)，相对应于耳蜗传出神经内侧系统(图1)。ChAT免疫阳性反应也可见于内毛细胞底部，内侧螺旋束(inner spiral bundle, ISB)和遂道螺旋束(tunnel spiral bundle, TSB)，相对应于耳蜗传出神经外侧系统(图2,3)。在3排外毛细胞底部可见许多ChAT免疫反应沉积物，尤其在第一排外毛细胞明显。蜗顶外毛细胞底部未见ChAT免疫反应，但仍可见对CF、TSB、ISB的阳性染色。ChAT免疫反应阳性染色可见CF穿行分布于3排外毛细胞，尤其是第一、二排毛细胞底部，1束CF分布数个外毛细胞，也可见数束CF分布于1个外毛细胞底部(图1)。以上结果在18个基底膜铺片标本中基本一致。阴性对照组均未见阳性染色。
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图1 小鼠耳蜗基底膜铺片中胆碱乙酰化酶(ChAT)免疫反应可见于3排外毛细胞(OHC)底部和穿行纤维(CF)。间接免疫荧光染色 ×500 图2 胆碱乙酰化酶(ChAT)免疫反应分布于内侧螺旋束(ISB)、遂道螺旋束(TSB)和穿行纤维(CF)。间接免疫荧光染色 × 500 图3 胆碱乙酰化酶(ChAT)免疫反应可见于3排外毛细胞(OHC)底部和穿行纤维(CF)，也可见于内毛细胞(IHC)底部。间接免疫荧光染色 × 500
三、讨论
本研究结果发现ChAT免疫反应可见于小鼠耳蜗Corti器中，是ACh作为传出神经系统递质一个有力证据。既往的研究结果发现ACh做为外侧系统递质主要来自于AChE免疫反应的观察，仅有Altshuler等[2]报道为ChAT的免疫反应观察，本实验结果与其结果相符。但ACh是否作为传出神经系统唯一的递质，仍值得探讨。
本研究中还发现ChAT免疫反应不仅见于内侧系统也见于外侧系统，表明ACh不仅是内侧也是外侧耳蜗传出神经系统的神经递质。目前，ACh在内、外侧系统，尤其在外侧系统中的作用仍不完全清楚。在内侧系统 ACh可能直接参与传出神经末梢与外毛细胞底部直接形成突触的递质传递。有研究发现ACh减少外毛细胞长度变化[3]，而外毛细胞长度变化与耳蜗机械特性有关，因此推测，胆碱能神经在耳蜗传出神经内侧系统通过释放ACh调控外毛细胞机能。在外侧系统ACh对内毛细胞的作用的研究很少。Felix等报告将ACh微泵至内毛细胞附近，发现它增加耳蜗辐射传入纤维自发放电，推测耳蜗传出神经系统释放的ACh可能维持螺旋神经节细胞的活性，其对耳蜗的作用是间接性的。如何维持螺旋神经节细胞的活性，从而保持足够的神经节细胞数量，对听觉传导有重要意义，有必要进一步探讨ACh对内毛细胞的作用，为耳聋治疗提供新的途径。
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参考文献
1 Eybalin M. Neurotransmitters and neuromodulators of the mammalian cochlea. Physiol Rev, 1993, 73: 309-373.
2 Altschuler RA, Kachar B, Rubio JA, et al. Immunocytochemical localization of choline acetyltransferase-like immunoreactivity in the guinea pig cochlea. Brain Res, 1985, 338: 1-11.
3 Plinkert PK, Gitter AH, Zimmermann U, et al. Visualization and functional testing of acetylcholine receptor-like molecules in cochlear outer hair cells. Hear Res, 1990, 44: 25-34.
(收稿：1998-11-06 修回：1999-05-28), http://www.100md.com
单位：
100853北京 解放军总医院耳鼻咽喉科(杨仕明、姜泗长、杨伟炎、顾瑞)；日本关西医科大学耳鼻咽喉科(山下敏夫)
关键词：
中华耳鼻烟喉科杂志990532 大量研究表明，在哺乳动物中，乙酰胆碱(acetylcholine, ACh)是耳蜗传出神经系统的主要递质，但大部分研究只涉及内侧系统。在一些涉及外侧系统的研究中大部分也仅用乙酰胆碱酯酶(acetylcholinesterase, AChE)观察耳蜗传出神经纤维的分布[1]。目前认为AChE不是可靠的胆碱能神经标记物，而ACh合成酶——胆碱乙酰化酶(choline acetyltransferase，ChAT)被认为是胆碱能神经最特异标记物[1,2]。本研究用免疫荧光法观察ChAT免疫反应在耳蜗中的分布，以确定ACh是否为耳蜗传出神经双侧系统的神经递质。
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一、材料与方法
C57BL/6CrSIC成年小鼠18只，由日本关西医科大学实验动物中心提供，雌雄不拘。动物处死后迅速取出颞骨置于0.1 mol/L磷酸缓冲盐液，取下双侧耳蜗(一侧为实验组，另一侧为对照组)置于4%甲醛4℃固定1 h后，用磷酸缓冲盐液连续振洗20 min。去除耳蜗骨壁、螺旋韧带、血管纹、盖膜及大部分Reissner膜，制成基底膜铺片标本。标本经10%羊血清室温下封闭40 min，以减少非特异性染色。加入兔抗ChAT多克隆抗体(1:250, Chemicon International , 美国) 4℃下孵育过夜。滴加荧光素标记的羊抗兔IgG (1:25, Jackson Immunoresearch , 美国)室温下孵育20 min，每次孵育后，均在0.1 mol/L 磷酸缓冲盐液中连续振洗3次，每次5 min。标本经二甲苯透明，树脂胶封片，荧光显微镜(BH-2，Olympus, 日本)下观察。抗体稀释液为:1%羊血清，0.3% Triton X-100。用0.1 mol/L 磷酸缓冲盐液代替一抗做阴性对照。
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二、结果
免疫荧光显微镜下观察ChAT免疫阳性反应可见于小鼠耳蜗基底膜铺片中3排外毛细胞底部和穿行纤维(crossing fiber, CF)，相对应于耳蜗传出神经内侧系统(图1)。ChAT免疫阳性反应也可见于内毛细胞底部，内侧螺旋束(inner spiral bundle, ISB)和遂道螺旋束(tunnel spiral bundle, TSB)，相对应于耳蜗传出神经外侧系统(图2,3)。在3排外毛细胞底部可见许多ChAT免疫反应沉积物，尤其在第一排外毛细胞明显。蜗顶外毛细胞底部未见ChAT免疫反应，但仍可见对CF、TSB、ISB的阳性染色。ChAT免疫反应阳性染色可见CF穿行分布于3排外毛细胞，尤其是第一、二排毛细胞底部，1束CF分布数个外毛细胞，也可见数束CF分布于1个外毛细胞底部(图1)。以上结果在18个基底膜铺片标本中基本一致。阴性对照组均未见阳性染色。
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图1 小鼠耳蜗基底膜铺片中胆碱乙酰化酶(ChAT)免疫反应可见于3排外毛细胞(OHC)底部和穿行纤维(CF)。间接免疫荧光染色 ×500 图2 胆碱乙酰化酶(ChAT)免疫反应分布于内侧螺旋束(ISB)、遂道螺旋束(TSB)和穿行纤维(CF)。间接免疫荧光染色 × 500 图3 胆碱乙酰化酶(ChAT)免疫反应可见于3排外毛细胞(OHC)底部和穿行纤维(CF)，也可见于内毛细胞(IHC)底部。间接免疫荧光染色 × 500
三、讨论
本研究结果发现ChAT免疫反应可见于小鼠耳蜗Corti器中，是ACh作为传出神经系统递质一个有力证据。既往的研究结果发现ACh做为外侧系统递质主要来自于AChE免疫反应的观察，仅有Altshuler等[2]报道为ChAT的免疫反应观察，本实验结果与其结果相符。但ACh是否作为传出神经系统唯一的递质，仍值得探讨。
本研究中还发现ChAT免疫反应不仅见于内侧系统也见于外侧系统，表明ACh不仅是内侧也是外侧耳蜗传出神经系统的神经递质。目前，ACh在内、外侧系统，尤其在外侧系统中的作用仍不完全清楚。在内侧系统 ACh可能直接参与传出神经末梢与外毛细胞底部直接形成突触的递质传递。有研究发现ACh减少外毛细胞长度变化[3]，而外毛细胞长度变化与耳蜗机械特性有关，因此推测，胆碱能神经在耳蜗传出神经内侧系统通过释放ACh调控外毛细胞机能。在外侧系统ACh对内毛细胞的作用的研究很少。Felix等报告将ACh微泵至内毛细胞附近，发现它增加耳蜗辐射传入纤维自发放电，推测耳蜗传出神经系统释放的ACh可能维持螺旋神经节细胞的活性，其对耳蜗的作用是间接性的。如何维持螺旋神经节细胞的活性，从而保持足够的神经节细胞数量，对听觉传导有重要意义，有必要进一步探讨ACh对内毛细胞的作用，为耳聋治疗提供新的途径。
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参考文献
1 Eybalin M. Neurotransmitters and neuromodulators of the mammalian cochlea. Physiol Rev, 1993, 73: 309-373.
2 Altschuler RA, Kachar B, Rubio JA, et al. Immunocytochemical localization of choline acetyltransferase-like immunoreactivity in the guinea pig cochlea. Brain Res, 1985, 338: 1-11.
3 Plinkert PK, Gitter AH, Zimmermann U, et al. Visualization and functional testing of acetylcholine receptor-like molecules in cochlear outer hair cells. Hear Res, 1990, 44: 25-34.
(收稿：1998-11-06 修回：1999-05-28), http://www.100md.com