睫状神经营养因子在喉返神经再生过程中的表达及分布
作者：郑宏良 周水淼 由振东 李兆基 张青 路长林 严进 王成海
单位：200433 上海 第二军医大学附属长海医院耳鼻咽喉科(郑宏良、周水淼、李兆基、张青)，基础部神经科学研究所(由振东、路长林、严进、王成海)
关键词：声带麻痹；；神经再生；；神经生长因子；；喉返神经；；睫状神经营养因子
中华耳鼻烟喉科杂志990514 摘要 目的 阐述喉返神经修复后神经干睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)的表达及分布。方法 切断并立即缝合犬喉返神经为神经修复再生模型，采用原位杂交及免疫组织化学方法检测CNTF mRNA及其蛋白的表达，结合图像分析技术，测定反应产物的灰度值及面积百分率。结果 正常神经CNTF mRNA及其蛋白反应产物位于包绕轴突及髓鞘的雪旺细胞中。神经修复术后2周神经纤维降解，CNTF mRNA及其蛋白表达迅速下降，3周后随着神经的再生CNTF mRNA及其蛋白表达逐渐增加，表达产物仍位于包绕再生轴突及髓鞘的雪旺细胞中，CNTF蛋白还出现于再生的轴突中。18周后虽然神经再生完成，但反应产物灰度值及面积百分率仍明显低于正常状态。结论 再生神经CNTF的表达与轴突再生有关；表达呈下调型，提示补充外源性CNTF可能改善神经再生微环境。
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The expression and distribution of ciliary neurotrophic factor in laryngeal nerve regeneration
ZHENG Hongliang, ZHOU Shuimiao，YOU Zhendong, et al.
Department of Otorhinolaryngology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433
Abstract Objective To explore the expression and distribution of ciliary neurotrophic factor(CNTF) mRNA and its protein in laryngeal nerve regeneration. Methods The recurrent laryngeal nerves were sectioned and then sutured in twelve dogs. Both proximal and distal stumps of sutured region were sectioned on different post-operative days and the sections were separately used for CNTF immunohistochemistry and CNTF mRNA in situ hybridization. The area and intensity of reactive product were measured by computer image processing system. Results Strongly reactive product of CNTF mRNA and its protein deposited in myelin-related Schwann cells in normal laryngeal nerves. At week 2 following neurorrhaphy, there was very little hybridization signal and detectable CNTF immunoreactivity in distal stump and no regenerated nerve fibbers were found. At week 3, reactive product of CNTF mRNA and its protein was detected in thin Schwann cell processes ensheathing regenerated axons, while reactive product was not found in the proliferating Schwann cells which didn't ensheathe axons. CNTF immunoreactivity was also detected in the regenerated nerve axons. After longer survival times, hybridization signal and the CNTF immunoreactivity in Schwamm cells became more widespread, and the area and intensity of reactive product significantly increased , but even at the longest survival time, they were still significantly less than those in intact nerve. The same change of CNTF mRNA and its protein was observed in a short segment proximal to the sutured region. Conclusion CNTF expression could depend on Schwann cell-axon regeneration. The level of CNTF expression stands in striking contrast to the up-regulation of nerve growth factor in peripheral nerve degeneration and regeneration. These suggest that the exogenous CNTF might provide a supportive environment for axonal regeneration.
, 百拇医药
Key words Vocal cord paralysis Nerve regeneration Nerve growth factors Recurrent laryngeal nerve Ciliary neurotrophic factor
近年来的研究资料提示周围神经再生时需要多种神经营养因子的调控，其影响着轴突的生长和生长方向[1]。周围神经干及靶器官是神经营养因子的主要来源之一，神经损伤修复过程中神经营养因子的表达及表达程度是神经再生研究的热点。本研究采用原位杂交及免疫组织化学方法探讨睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)在喉返神经再生过程中的表达及分布，为探讨神经再生机制和外源性神经营养因子的应用提供参考。
材料及方法
1.手术及取材：选健康成年犬12只, 体重8.0～15.0 kg。 动物全身麻醉后，于右侧第四气管环水平切断喉返神经, 立即在手术显微镜下以9-0无损伤缝线作喉返神经端端缝合术, 术后2、3、6、12、18、24周取材, 每时间亚组2只犬。暴露右侧喉返神经吻合处，在其以近0.2 cm、以远2 cm及对侧相应部位各取长约0.5 cm的神经干，置于4%多聚甲醛PBS中4℃固定8 h，冰冻切片，片厚30 μm。
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2. 地高辛标记的CNTF反义cRNA探针制备：将带CNTF基因的pKS质粒 (美国Yancopoules博士惠赠) 转染大肠杆菌(氯化钙转化法)，按常规方法进行扩增及质粒制备。经Ban HI酶切，使质粒完全线性化。酚氯仿抽提、回收，在T7 RNA聚合酶作用下按宝灵曼公司(美国)方法合成cRNA地高辛探针，以免疫检测法测定cRNA探针浓度为0.1 g/L，-80℃低温保存备用。
3. CNTF mRNA原位杂交：切片经漂洗5 min，0.1 mol/L盐酸孵育10 min，Triton X-100孵育10 min，蛋白酶K(1 mg/L)37℃消化30 min，4%多聚甲醛PBS终止酶消化，42℃预杂交2h后42℃杂交过夜，探针浓度约为0.5 mg/L。用4×SSC～0.1×SSC漂洗后，加入标记碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(1∶1 000)，室温2h，系列缓冲液洗，加入显色液NBT/BCIP避光显色4h，常规脱水、二甲苯透明，封片保存。对照一组以正义cRNA代替反义cRNA探针，对照二组加探针前以RNA酶消化切片，其余步骤均同实验组。
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4. CNTF免疫组化：切片用0.03%H2O2孵育10 min，以CNTF单克隆抗体(本校神经科学研究所提供)4℃孵育48 h，工作浓度1∶2 000，再以1∶200生物素化的羊抗鼠IgG(Sigma, 美国)室温反应2 h，ABC复合物室温1 h，最后以DAB液显色5 min，每步间用0.1 mol/L PBS洗2次，常规脱水、封片。对照组采用3% BSA缓冲液代替一抗，其余同实验组。实验过程中将近远侧段神经干切片与健侧神经切片裱在同一张载玻片上，所有样品切片同时进行原位杂交或免疫组化反应。
5. 计算机图像分析：在图像采集卡(华东理工大学自动化研究所)、IBM586和Olympus B X 60显微镜组成的图像处理系统上测量CNTF mRNA杂交信号及CNTF阳性反应产物的灰度及其面积占神经索面积的百分率。灰度值：O(黑)～255(白)，无反应产物的样品灰度为255， 同一样品切片灰度测试10个，面积测试5个不同的视野，各时间亚组计平均值，作t检验。
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结果
1. 神经再生过程中CNTF mRNA表达：原位杂交显示健侧神经组织CNTF mRNA杂交信号呈紫黑色位于有髓神经纤维周边的雪旺细胞内，呈晕状或瘦月牙状环绕髓鞘及轴突，髓鞘及轴突无杂交信号。在同一切面的无髓神经纤维束内仅少数有髓小纤维着色，无髓纤维无杂交信号(图1)。神经修复术后2周时，远段神经髓鞘降解，仅见散在微弱的杂交信号。术后3周可见再生的髓鞘及轴突，其周围的杂交信号强弱不均(图2)。术后6周杂交信号明显增多，但强弱分布仍不均匀(图3)。术后12周杂交信号形态与正常相似呈晕状、瘦月牙状，但信号强弱仍不均匀，有较多区域无杂交信号，术后18、24周与12周相似(图4)。神经再生时轴突、髓鞘及神经纤维外无杂交信号。近段神经干出现类似远段的改变，但术后2周即可见杂交信号环绕髓鞘及轴突，术后6周即与远段神经干12周相似。
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图1 正常喉返神经CNTF mRNA原位杂交 ×400 图2 术后3周远段神经干CNTF mRNA原位杂交。 ×400 图3 术后6周远段神经干CNTF mRNA原位杂交。 ×400 图4 术后24周远段神经干CNTF mRNA原位杂交。图1～4中，CNTF mRNA杂交信号呈紫黑色位于有髓神经纤维周边的雪旺细胞内，呈晕状或瘦月牙状环绕未着色的髓鞘及轴突，无髓纤维无杂交信号。 ×400
2. 神经再生过程中CNTF免疫反应物质的改变:健侧神经组织CNTF阳性反应产物呈黄色、棕黄色位于有髓神经纤维周边的雪旺细胞内，与杂交信号相似呈晕状或瘦月牙形环绕髓鞘，髓鞘呈阴性反应。部分轴突也着色，但反应弱、面积小(图5)。神经修复后2周，远段神经纤维降解，代之以散在点状反应物。术后3周散在反应物增多，可见少量呈晕状的反应物环绕着色较浅的轴突。术后6周，纵切面显示较多反应产物呈长细丝状包绕着色浅淡的轴突及未着色的髓鞘，此外可见散在片状反应物。术后12周，反应物形态与正常相似呈晕状、瘦月牙状，但轴突区内及神经纤维外仍可见较多阳性反应物质(图6)。术后18及24周，除轴突区阳性反应物质减少外，其余与12周相似。近段神经干在神经再生时也出现类似远段的改变，但术后2周即出现较多的阳性反应物质，6周时情形与远段12周相似。
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图5 正常喉返神经CNTF免疫组化观察。CNTF阳性反应物呈黄色、棕黄色位于有髓神经纤维周边呈晕状或瘦月牙形的雪旺细胞内，髓鞘及轴突无反应物。 ×528 图6 术后12周远段神经干CNTF免疫组化观察。雪旺细胞内CNTF阳性反应物与正常神经相似呈晕状、瘦月牙状，但轴突区内及神经纤维外可见阳性反应物质。 ×528
3. 神经再生过程中CNTF mRNA原位杂交和CNTF免疫组化反应产物灰度值和面积百分率(图7,8)：远段神经干术后6周前各亚组间杂交信号灰度及面积百分率差异有非常显著性(P<0.01)。12周后各亚组间无显著差异性(P>0.05)，但均明显低于健侧及其近段神经干(P<0.01)。近段神经干6周前灰度和面积百分率各亚组间相差有显著性(P<0.05)，12周后各亚组间差异均无显著性意义(P>0.05)。但仍明显低于健侧(P<0.05)。
图7 神经再生过程中CNTF mRNA原位杂交和CNTF免疫组化反应产物灰度值
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图8 神经再生过程中CNTF mRNA原位杂交和CNTF免疫组化反应产物面积百分率
4. 对照试验: CNTF mRNA原位杂交及CNTF免疫组织化学对照试验, 显色反应均呈阴性。
讨论
CNTF是近年来发现的新的神经营养因子，其能保护神经元细胞，营养肌细胞，促进外周神经生长[2]。正常周围神经的雪旺细胞表达CNTF，运动神经元及其靶器官肌细胞表面CNTF受体具有很高水平的表达[3]，但是正常状态下内源性CNTF是否对神经元细胞及肌细胞有营养保护作用尚有争议。有学者在轴突内未发现CNTF，认为正常状态下CNTF仅贮存于雪旺细胞内并不释放，对神经元细胞及肌细胞并无作用[4]。Rende等[5]发现正常轴突内存在CNTF免疫反应产物，认为是由雪旺细胞内的CNTF转入轴突所致。本实验结果显示正常神经雪旺细胞具有较高水平的CNTF mRNA表达，其表达虽集中在雪旺细胞内，但轴突也有轻微的阳性反应，支持Rende的观点，提示正常状态下内源性CNTF即可通过轴突运输,对神经元及靶器官具有营养及保护作用。
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神经修复过程中，远段神经雪旺细胞增生活跃，但神经修复早期其合成CNTF mRNA及其蛋白的功能迅速下降，CNTF极其微量。由于神经损伤CNTF从崩解的髓鞘、雪旺细胞释放，尽管其含量甚微，损伤的轴突可直接吸收CNTF[3-5]。本实验显示不仅神经再生前存在弥散的CNTF阳性反应物，而且神经再生过程中轴突内及神经纤维外也有较强的阳性反应产物，提示神经损伤再生时CNTF从雪旺细胞转入轴突内，为保护神经元、营养肌肉及促进神经修复、再生提供合适环境。
周围神经再生时CNTF表达机理目前尚不清楚，有研究发现当雪旺细胞脱离轴突接触，其内CNTF的表达迅速下降，相反当雪旺细胞重新形成髓鞘包绕轴突时CNTF表达重新出现[4]。
本实验结果显示神经修复2周时，神经纤维尚未再生，CNTF mRNA及其蛋白表达迅速下降。 神经修复3周后，出现再生神经纤维，其周围的雪旺细胞重新表达CNTF，无轴突长入的雪旺细胞尽管增生活跃，均不表达CNTF。随着再生神经纤维增多，CNTF表达也增多。提示雪旺细胞表达CNTF与轴突生长及神经再生程度有关。有关周围神经再生时CNTF的表达程度目前尚有争议。多数学者的结果显示CNTF mRNA及其蛋白表达与NGF相反，呈下降型[3-5]。少数学者的实验结果显示CNTF免疫活性物质增加面积增大[6]。本实验结果显示CNTF mRNA及其蛋白表达也呈下降型，提示补充外源性CNTF能克服内源性CNTF的不足，促进周围神经再生，提高神经修复效果。
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本实验结果显示CNTF mRNA及其蛋白表达程度、表达时间与文献报道有所不同，这可能与选用动物及神经修复方式不同有关。文献选用鼠的坐骨神经，以钳夹损伤神经再生为模型[3-5]，本实验采用大动物犬为研究对象，并以临床神经修复最普遍、效果最佳的神经缝合术为模型[7]，因此更接近临床。实验结果显示神经吻合术后12周以前为神经再生期，内源性CNTF尤为不足，12周后神经再生完成，内源性CNTF相对稳定，提示外源性CNTF在神经缝合术后12周内使用为佳。
参考文献
1 Sebert ME, Shooter EM. Expression of mRNA for neurotrophic factors and their receptors in the rat dorsal root ganglion and sciatic nerve following nerve injury. J Neurosci Res, 1993, 36:357-367.
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2 Ulenkate HJ，Gispen WH,Jennekens FG. Effects of ciliary neurotrophic factor on retrograde cell reaction after facial nerve crush in young adult rats. Brain Res，1996, 717: 29-37.
3 Fu SY,Gordon J. The cellular and molecular basis of peripheral nerve regeneration. Molecular Neurobiol, 1997, 14:67-76.
4 Sendtner M, Stockli KA , Thoenen H. Synthesis and localization of ciliary neurotrophic factor in the sciatic nerve of the adult rat after lesion and during regeneration. J Cell Biol, 1992, 118:139-148.
, 百拇医药
5 Rende M, Muir D, Ruoslahti E, et al. Immunolocation of ciliary neuronotrophic factor in adult rat sciatic nerve. Glia, 1992, 5:25-32.
6 顾晓松，严志强，范明，等.CNTF和NGF在损伤后变性神经组织中的表达与分布.中华显微外科杂志，1998，21：121-123.
7 Zheng HL, Zhou S, Li Z, et al. An experimental comparison of different kinds of laryngeal muscle reinnervation. Otolaryngol Head Neck Surg, 1998, 119: 540-547.
(收稿:1999-02-29 修回:1999-05-10), 百拇医药
单位：200433 上海 第二军医大学附属长海医院耳鼻咽喉科(郑宏良、周水淼、李兆基、张青)，基础部神经科学研究所(由振东、路长林、严进、王成海)
关键词：声带麻痹；；神经再生；；神经生长因子；；喉返神经；；睫状神经营养因子
中华耳鼻烟喉科杂志990514 摘要 目的 阐述喉返神经修复后神经干睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor, CNTF)的表达及分布。方法 切断并立即缝合犬喉返神经为神经修复再生模型，采用原位杂交及免疫组织化学方法检测CNTF mRNA及其蛋白的表达，结合图像分析技术，测定反应产物的灰度值及面积百分率。结果 正常神经CNTF mRNA及其蛋白反应产物位于包绕轴突及髓鞘的雪旺细胞中。神经修复术后2周神经纤维降解，CNTF mRNA及其蛋白表达迅速下降，3周后随着神经的再生CNTF mRNA及其蛋白表达逐渐增加，表达产物仍位于包绕再生轴突及髓鞘的雪旺细胞中，CNTF蛋白还出现于再生的轴突中。18周后虽然神经再生完成，但反应产物灰度值及面积百分率仍明显低于正常状态。结论 再生神经CNTF的表达与轴突再生有关；表达呈下调型，提示补充外源性CNTF可能改善神经再生微环境。
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The expression and distribution of ciliary neurotrophic factor in laryngeal nerve regeneration
ZHENG Hongliang, ZHOU Shuimiao，YOU Zhendong, et al.
Department of Otorhinolaryngology, Changhai Hospital, Second Military Medical University, Shanghai 200433
Abstract Objective To explore the expression and distribution of ciliary neurotrophic factor(CNTF) mRNA and its protein in laryngeal nerve regeneration. Methods The recurrent laryngeal nerves were sectioned and then sutured in twelve dogs. Both proximal and distal stumps of sutured region were sectioned on different post-operative days and the sections were separately used for CNTF immunohistochemistry and CNTF mRNA in situ hybridization. The area and intensity of reactive product were measured by computer image processing system. Results Strongly reactive product of CNTF mRNA and its protein deposited in myelin-related Schwann cells in normal laryngeal nerves. At week 2 following neurorrhaphy, there was very little hybridization signal and detectable CNTF immunoreactivity in distal stump and no regenerated nerve fibbers were found. At week 3, reactive product of CNTF mRNA and its protein was detected in thin Schwann cell processes ensheathing regenerated axons, while reactive product was not found in the proliferating Schwann cells which didn't ensheathe axons. CNTF immunoreactivity was also detected in the regenerated nerve axons. After longer survival times, hybridization signal and the CNTF immunoreactivity in Schwamm cells became more widespread, and the area and intensity of reactive product significantly increased , but even at the longest survival time, they were still significantly less than those in intact nerve. The same change of CNTF mRNA and its protein was observed in a short segment proximal to the sutured region. Conclusion CNTF expression could depend on Schwann cell-axon regeneration. The level of CNTF expression stands in striking contrast to the up-regulation of nerve growth factor in peripheral nerve degeneration and regeneration. These suggest that the exogenous CNTF might provide a supportive environment for axonal regeneration.
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Key words Vocal cord paralysis Nerve regeneration Nerve growth factors Recurrent laryngeal nerve Ciliary neurotrophic factor
近年来的研究资料提示周围神经再生时需要多种神经营养因子的调控，其影响着轴突的生长和生长方向[1]。周围神经干及靶器官是神经营养因子的主要来源之一，神经损伤修复过程中神经营养因子的表达及表达程度是神经再生研究的热点。本研究采用原位杂交及免疫组织化学方法探讨睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)在喉返神经再生过程中的表达及分布，为探讨神经再生机制和外源性神经营养因子的应用提供参考。
材料及方法
1.手术及取材：选健康成年犬12只, 体重8.0～15.0 kg。 动物全身麻醉后，于右侧第四气管环水平切断喉返神经, 立即在手术显微镜下以9-0无损伤缝线作喉返神经端端缝合术, 术后2、3、6、12、18、24周取材, 每时间亚组2只犬。暴露右侧喉返神经吻合处，在其以近0.2 cm、以远2 cm及对侧相应部位各取长约0.5 cm的神经干，置于4%多聚甲醛PBS中4℃固定8 h，冰冻切片，片厚30 μm。
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2. 地高辛标记的CNTF反义cRNA探针制备：将带CNTF基因的pKS质粒 (美国Yancopoules博士惠赠) 转染大肠杆菌(氯化钙转化法)，按常规方法进行扩增及质粒制备。经Ban HI酶切，使质粒完全线性化。酚氯仿抽提、回收，在T7 RNA聚合酶作用下按宝灵曼公司(美国)方法合成cRNA地高辛探针，以免疫检测法测定cRNA探针浓度为0.1 g/L，-80℃低温保存备用。
3. CNTF mRNA原位杂交：切片经漂洗5 min，0.1 mol/L盐酸孵育10 min，Triton X-100孵育10 min，蛋白酶K(1 mg/L)37℃消化30 min，4%多聚甲醛PBS终止酶消化，42℃预杂交2h后42℃杂交过夜，探针浓度约为0.5 mg/L。用4×SSC～0.1×SSC漂洗后，加入标记碱性磷酸酶的抗地高辛抗体(1∶1 000)，室温2h，系列缓冲液洗，加入显色液NBT/BCIP避光显色4h，常规脱水、二甲苯透明，封片保存。对照一组以正义cRNA代替反义cRNA探针，对照二组加探针前以RNA酶消化切片，其余步骤均同实验组。
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4. CNTF免疫组化：切片用0.03%H2O2孵育10 min，以CNTF单克隆抗体(本校神经科学研究所提供)4℃孵育48 h，工作浓度1∶2 000，再以1∶200生物素化的羊抗鼠IgG(Sigma, 美国)室温反应2 h，ABC复合物室温1 h，最后以DAB液显色5 min，每步间用0.1 mol/L PBS洗2次，常规脱水、封片。对照组采用3% BSA缓冲液代替一抗，其余同实验组。实验过程中将近远侧段神经干切片与健侧神经切片裱在同一张载玻片上，所有样品切片同时进行原位杂交或免疫组化反应。
5. 计算机图像分析：在图像采集卡(华东理工大学自动化研究所)、IBM586和Olympus B X 60显微镜组成的图像处理系统上测量CNTF mRNA杂交信号及CNTF阳性反应产物的灰度及其面积占神经索面积的百分率。灰度值：O(黑)～255(白)，无反应产物的样品灰度为255， 同一样品切片灰度测试10个，面积测试5个不同的视野，各时间亚组计平均值，作t检验。
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结果
1. 神经再生过程中CNTF mRNA表达：原位杂交显示健侧神经组织CNTF mRNA杂交信号呈紫黑色位于有髓神经纤维周边的雪旺细胞内，呈晕状或瘦月牙状环绕髓鞘及轴突，髓鞘及轴突无杂交信号。在同一切面的无髓神经纤维束内仅少数有髓小纤维着色，无髓纤维无杂交信号(图1)。神经修复术后2周时，远段神经髓鞘降解，仅见散在微弱的杂交信号。术后3周可见再生的髓鞘及轴突，其周围的杂交信号强弱不均(图2)。术后6周杂交信号明显增多，但强弱分布仍不均匀(图3)。术后12周杂交信号形态与正常相似呈晕状、瘦月牙状，但信号强弱仍不均匀，有较多区域无杂交信号，术后18、24周与12周相似(图4)。神经再生时轴突、髓鞘及神经纤维外无杂交信号。近段神经干出现类似远段的改变，但术后2周即可见杂交信号环绕髓鞘及轴突，术后6周即与远段神经干12周相似。
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图1 正常喉返神经CNTF mRNA原位杂交 ×400 图2 术后3周远段神经干CNTF mRNA原位杂交。 ×400 图3 术后6周远段神经干CNTF mRNA原位杂交。 ×400 图4 术后24周远段神经干CNTF mRNA原位杂交。图1～4中，CNTF mRNA杂交信号呈紫黑色位于有髓神经纤维周边的雪旺细胞内，呈晕状或瘦月牙状环绕未着色的髓鞘及轴突，无髓纤维无杂交信号。 ×400
2. 神经再生过程中CNTF免疫反应物质的改变:健侧神经组织CNTF阳性反应产物呈黄色、棕黄色位于有髓神经纤维周边的雪旺细胞内，与杂交信号相似呈晕状或瘦月牙形环绕髓鞘，髓鞘呈阴性反应。部分轴突也着色，但反应弱、面积小(图5)。神经修复后2周，远段神经纤维降解，代之以散在点状反应物。术后3周散在反应物增多，可见少量呈晕状的反应物环绕着色较浅的轴突。术后6周，纵切面显示较多反应产物呈长细丝状包绕着色浅淡的轴突及未着色的髓鞘，此外可见散在片状反应物。术后12周，反应物形态与正常相似呈晕状、瘦月牙状，但轴突区内及神经纤维外仍可见较多阳性反应物质(图6)。术后18及24周，除轴突区阳性反应物质减少外，其余与12周相似。近段神经干在神经再生时也出现类似远段的改变，但术后2周即出现较多的阳性反应物质，6周时情形与远段12周相似。
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图5 正常喉返神经CNTF免疫组化观察。CNTF阳性反应物呈黄色、棕黄色位于有髓神经纤维周边呈晕状或瘦月牙形的雪旺细胞内，髓鞘及轴突无反应物。 ×528 图6 术后12周远段神经干CNTF免疫组化观察。雪旺细胞内CNTF阳性反应物与正常神经相似呈晕状、瘦月牙状，但轴突区内及神经纤维外可见阳性反应物质。 ×528
3. 神经再生过程中CNTF mRNA原位杂交和CNTF免疫组化反应产物灰度值和面积百分率(图7,8)：远段神经干术后6周前各亚组间杂交信号灰度及面积百分率差异有非常显著性(P<0.01)。12周后各亚组间无显著差异性(P>0.05)，但均明显低于健侧及其近段神经干(P<0.01)。近段神经干6周前灰度和面积百分率各亚组间相差有显著性(P<0.05)，12周后各亚组间差异均无显著性意义(P>0.05)。但仍明显低于健侧(P<0.05)。
图7 神经再生过程中CNTF mRNA原位杂交和CNTF免疫组化反应产物灰度值
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图8 神经再生过程中CNTF mRNA原位杂交和CNTF免疫组化反应产物面积百分率
4. 对照试验: CNTF mRNA原位杂交及CNTF免疫组织化学对照试验, 显色反应均呈阴性。
讨论
CNTF是近年来发现的新的神经营养因子，其能保护神经元细胞，营养肌细胞，促进外周神经生长[2]。正常周围神经的雪旺细胞表达CNTF，运动神经元及其靶器官肌细胞表面CNTF受体具有很高水平的表达[3]，但是正常状态下内源性CNTF是否对神经元细胞及肌细胞有营养保护作用尚有争议。有学者在轴突内未发现CNTF，认为正常状态下CNTF仅贮存于雪旺细胞内并不释放，对神经元细胞及肌细胞并无作用[4]。Rende等[5]发现正常轴突内存在CNTF免疫反应产物，认为是由雪旺细胞内的CNTF转入轴突所致。本实验结果显示正常神经雪旺细胞具有较高水平的CNTF mRNA表达，其表达虽集中在雪旺细胞内，但轴突也有轻微的阳性反应，支持Rende的观点，提示正常状态下内源性CNTF即可通过轴突运输,对神经元及靶器官具有营养及保护作用。
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神经修复过程中，远段神经雪旺细胞增生活跃，但神经修复早期其合成CNTF mRNA及其蛋白的功能迅速下降，CNTF极其微量。由于神经损伤CNTF从崩解的髓鞘、雪旺细胞释放，尽管其含量甚微，损伤的轴突可直接吸收CNTF[3-5]。本实验显示不仅神经再生前存在弥散的CNTF阳性反应物，而且神经再生过程中轴突内及神经纤维外也有较强的阳性反应产物，提示神经损伤再生时CNTF从雪旺细胞转入轴突内，为保护神经元、营养肌肉及促进神经修复、再生提供合适环境。
周围神经再生时CNTF表达机理目前尚不清楚，有研究发现当雪旺细胞脱离轴突接触，其内CNTF的表达迅速下降，相反当雪旺细胞重新形成髓鞘包绕轴突时CNTF表达重新出现[4]。
本实验结果显示神经修复2周时，神经纤维尚未再生，CNTF mRNA及其蛋白表达迅速下降。 神经修复3周后，出现再生神经纤维，其周围的雪旺细胞重新表达CNTF，无轴突长入的雪旺细胞尽管增生活跃，均不表达CNTF。随着再生神经纤维增多，CNTF表达也增多。提示雪旺细胞表达CNTF与轴突生长及神经再生程度有关。有关周围神经再生时CNTF的表达程度目前尚有争议。多数学者的结果显示CNTF mRNA及其蛋白表达与NGF相反，呈下降型[3-5]。少数学者的实验结果显示CNTF免疫活性物质增加面积增大[6]。本实验结果显示CNTF mRNA及其蛋白表达也呈下降型，提示补充外源性CNTF能克服内源性CNTF的不足，促进周围神经再生，提高神经修复效果。
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本实验结果显示CNTF mRNA及其蛋白表达程度、表达时间与文献报道有所不同，这可能与选用动物及神经修复方式不同有关。文献选用鼠的坐骨神经，以钳夹损伤神经再生为模型[3-5]，本实验采用大动物犬为研究对象，并以临床神经修复最普遍、效果最佳的神经缝合术为模型[7]，因此更接近临床。实验结果显示神经吻合术后12周以前为神经再生期，内源性CNTF尤为不足，12周后神经再生完成，内源性CNTF相对稳定，提示外源性CNTF在神经缝合术后12周内使用为佳。
参考文献
1 Sebert ME, Shooter EM. Expression of mRNA for neurotrophic factors and their receptors in the rat dorsal root ganglion and sciatic nerve following nerve injury. J Neurosci Res, 1993, 36:357-367.
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(收稿:1999-02-29 修回:1999-05-10), 百拇医药