鼻息肉流式细胞术和增殖细胞核抗原免疫组化检测
作者：张志钢 程慰北 郑秀玲 焦粤农
单位：510150 广州市第二人民医院耳鼻咽喉科 张志钢、程慰北、焦粤农病理科 郑秀玲
关键词：
中华耳鼻咽喉科杂志990625 运用流式细胞术和免疫组化法增殖细胞核抗原测定对鼻息肉上皮细胞增殖状况进行定量观察，初步探讨细胞增殖在鼻息肉发病中的意义。
一、材料和方法
1.临床资料：26例鼻息肉组织和16例下鼻甲粘膜均取自内窥镜鼻窦外科手术患者。鼻息肉组中男21例，女5例；年龄12～76岁，平均43岁。所有标本均石蜡包埋，常规HE染色光镜观察证实诊断无误。
2. DNA流式细胞术测试方法：将石蜡组织块在切片机上切取40 μm厚组织片，按文献[1]的方法进行DNA检测样品制备，然后所制备的样品用FACS-420 型流式细胞仪(美国BD公司)进行检测，结果在ND-64多道(512道)脉冲分析仪(美国BD公司)上单参数组方图显示，并在计算机上进行数据处理。测定前以鸡红细胞作为标准样品调整仪器，使变异系数(CV值，为标准差s与均数
之比)控制在5% 以内。细胞核DNA含量以DNA指数(DNA index，DI)衡量，即：
, 百拇医药
如DI= 1.0±2CV 为二倍体细胞，DI≠1.0±2CV 为非整倍体细胞。有丝分裂期(S期)的百分数按照细胞周期各期细胞分布频数确定。
3.免疫组化法增殖细胞核抗原(PCNA)测定：PCNA染色SLAB法按DAKO公司(丹麦)提供鼠系SLAB药盒中介绍方法常规操作，第一抗体鼠抗人PCNA单克隆抗体PC-10，也为DAKO公司提供。
结果判断及统计：细胞核染色成棕黄色者为PCNA阳性细胞(图1，2)， 细胞核染色成蓝色者为PCNA阴性细胞，随机选取背景清晰、对比度良好的区域高倍镜在网格计数器下计数1 000个细胞中PCNA阳性细胞数。PCNA指数(PI)=(PCNA阳性细胞数/1 000个细胞)×100%
4.炎症细胞浸润程度的判断：以淋巴细胞、浆细胞和嗜酸性细胞等炎性细胞多少代表浸润程度，炎性细胞数<20%为(+)，25%～50%为(++)，50%～75%为(+++)，>75%为(++++)。观察26张切片，每张切片10个高倍视野。
, 百拇医药
5.统计学处理：所有资料采用配对t检验。
二、结果
1.DNA流式细胞术检测结果：所有检测样品DNA指数在0.9～1.10之间，平均(±s，下同)0.96±0.10，说明为二倍体组织；鼻息肉及下鼻甲粘膜S期细胞百分数分别为(12.63±3.96)%及(8.67±1.26)%，t=3.38，P<0.005。
2.免疫组化PCNA检测结果：鼻息肉与下鼻甲粘膜上皮层PCNA指数分别为(7.51±1.79)和(4.5±1.13)，t=5.82，P<0.001；鼻息肉组织中炎症细胞浸润(++)16例PCNA指数为(6.79±1.06)，炎症细胞浸润(+++)10例PCNA指数为(8.66±2.17)，t=3.01，P<0.01。
, http://www.100md.com
三、讨论
增殖细胞核抗原(PCNA)是一种仅在增殖细胞中合成和表达、相对分子质量36 000的酸性核蛋白，为DNA合成复制所必需，与细胞增殖周期密切相关，主要在S期表达[2]。本研究结果显示所有检测样品均为二倍体，符合正常及炎症组织；S 期细胞百分数在鼻息肉组织中明显高于下鼻甲粘膜组织；PCNA阳性细胞表达在鼻息肉上皮组织中明显高于下鼻甲粘膜上皮组织， 说明鼻息肉组织中上皮细胞增生明显活跃，与国外学者[3]研究结果一致。Norlander等[4]在鼻息肉形成的动物模型上证实了上皮细胞增生是鼻息肉形成和发展的重要因素。进一步研究发现[5],鼻息肉组织中炎症细胞能分泌多种生长因子,刺激鼻息肉上皮细胞增生,使鼻息肉持续发生发展。本结果中所有息肉组织均有炎症细胞浸润，炎症细胞浸润多的息肉组织PCNA 细胞阳性表达数明显高于炎症细胞浸润少的息肉组织，说明炎症反应是鼻息肉上皮细胞增生的主要原因。
, 百拇医药
我们认为上皮细胞增殖活跃在鼻息肉发病机理中起重要作用，而浸润的炎性细胞分泌多种生长因子能使上皮细胞持续增生，导致鼻息肉发生发展。因此，有效地预防鼻息肉发生和发展，类固醇药物抗炎治疗是最基本、最重要的。
图1 下鼻甲粘膜。上皮的基底层可见棕色的阳性细胞。SLAB染色 ×400
图2 鼻息肉粘膜上皮。在上皮层的全层可见棕色的阳性细胞。SLAB染色 ×400
广东省卫生厅科学基金资助项目(A1998-521)
参考文献
1 左连富， 主编.流式细胞样品制备技术.北京:华夏出版社，1991.14-19.
, 百拇医药
2 Baserga R.Growth regulation of the PCNA gene. J Cell Sci. 1991;98:433-436.
3 Coste A，Rateau JG，Bernaudin JF，et al. Nasal polyposis pathogenesis:a flow cytometric and immunohistochemical study of epithelical cell proliferation.Acta Otolaryngol，1996，116:755-761.
4 Norlander T，Fukami M，Westrin KM，et al. Formation of mucosal polpso in the nasal and maxillary sinus cavities by infection.Otolaryngol Head Neck Surg，1993，109:522-529.
5 Jetten AM. Growth and differentiation factors in tracheobronchial epithelium.Am J Physiol，1991，260(6 Pt1):L361-373.
(收稿：1999-04-15 修回：1999-09-12), http://www.100md.com
单位：510150 广州市第二人民医院耳鼻咽喉科 张志钢、程慰北、焦粤农病理科 郑秀玲
关键词：
中华耳鼻咽喉科杂志990625 运用流式细胞术和免疫组化法增殖细胞核抗原测定对鼻息肉上皮细胞增殖状况进行定量观察，初步探讨细胞增殖在鼻息肉发病中的意义。
一、材料和方法
1.临床资料：26例鼻息肉组织和16例下鼻甲粘膜均取自内窥镜鼻窦外科手术患者。鼻息肉组中男21例，女5例；年龄12～76岁，平均43岁。所有标本均石蜡包埋，常规HE染色光镜观察证实诊断无误。
2. DNA流式细胞术测试方法：将石蜡组织块在切片机上切取40 μm厚组织片，按文献[1]的方法进行DNA检测样品制备，然后所制备的样品用FACS-420 型流式细胞仪(美国BD公司)进行检测，结果在ND-64多道(512道)脉冲分析仪(美国BD公司)上单参数组方图显示，并在计算机上进行数据处理。测定前以鸡红细胞作为标准样品调整仪器，使变异系数(CV值，为标准差s与均数
之比)控制在5% 以内。细胞核DNA含量以DNA指数(DNA index，DI)衡量，即：, 百拇医药
如DI= 1.0±2CV 为二倍体细胞，DI≠1.0±2CV 为非整倍体细胞。有丝分裂期(S期)的百分数按照细胞周期各期细胞分布频数确定。
3.免疫组化法增殖细胞核抗原(PCNA)测定：PCNA染色SLAB法按DAKO公司(丹麦)提供鼠系SLAB药盒中介绍方法常规操作，第一抗体鼠抗人PCNA单克隆抗体PC-10，也为DAKO公司提供。
结果判断及统计：细胞核染色成棕黄色者为PCNA阳性细胞(图1，2)， 细胞核染色成蓝色者为PCNA阴性细胞，随机选取背景清晰、对比度良好的区域高倍镜在网格计数器下计数1 000个细胞中PCNA阳性细胞数。PCNA指数(PI)=(PCNA阳性细胞数/1 000个细胞)×100%
4.炎症细胞浸润程度的判断：以淋巴细胞、浆细胞和嗜酸性细胞等炎性细胞多少代表浸润程度，炎性细胞数<20%为(+)，25%～50%为(++)，50%～75%为(+++)，>75%为(++++)。观察26张切片，每张切片10个高倍视野。
, 百拇医药
5.统计学处理：所有资料采用配对t检验。
二、结果
1.DNA流式细胞术检测结果：所有检测样品DNA指数在0.9～1.10之间，平均(
±s，下同)0.96±0.10，说明为二倍体组织；鼻息肉及下鼻甲粘膜S期细胞百分数分别为(12.63±3.96)%及(8.67±1.26)%，t=3.38，P<0.005。2.免疫组化PCNA检测结果：鼻息肉与下鼻甲粘膜上皮层PCNA指数分别为(7.51±1.79)和(4.5±1.13)，t=5.82，P<0.001；鼻息肉组织中炎症细胞浸润(++)16例PCNA指数为(6.79±1.06)，炎症细胞浸润(+++)10例PCNA指数为(8.66±2.17)，t=3.01，P<0.01。
, http://www.100md.com
三、讨论
增殖细胞核抗原(PCNA)是一种仅在增殖细胞中合成和表达、相对分子质量36 000的酸性核蛋白，为DNA合成复制所必需，与细胞增殖周期密切相关，主要在S期表达[2]。本研究结果显示所有检测样品均为二倍体，符合正常及炎症组织；S 期细胞百分数在鼻息肉组织中明显高于下鼻甲粘膜组织；PCNA阳性细胞表达在鼻息肉上皮组织中明显高于下鼻甲粘膜上皮组织， 说明鼻息肉组织中上皮细胞增生明显活跃，与国外学者[3]研究结果一致。Norlander等[4]在鼻息肉形成的动物模型上证实了上皮细胞增生是鼻息肉形成和发展的重要因素。进一步研究发现[5],鼻息肉组织中炎症细胞能分泌多种生长因子,刺激鼻息肉上皮细胞增生,使鼻息肉持续发生发展。本结果中所有息肉组织均有炎症细胞浸润，炎症细胞浸润多的息肉组织PCNA 细胞阳性表达数明显高于炎症细胞浸润少的息肉组织，说明炎症反应是鼻息肉上皮细胞增生的主要原因。
, 百拇医药
我们认为上皮细胞增殖活跃在鼻息肉发病机理中起重要作用，而浸润的炎性细胞分泌多种生长因子能使上皮细胞持续增生，导致鼻息肉发生发展。因此，有效地预防鼻息肉发生和发展，类固醇药物抗炎治疗是最基本、最重要的。
图1 下鼻甲粘膜。上皮的基底层可见棕色的阳性细胞。SLAB染色 ×400
图2 鼻息肉粘膜上皮。在上皮层的全层可见棕色的阳性细胞。SLAB染色 ×400
广东省卫生厅科学基金资助项目(A1998-521)
参考文献
1 左连富， 主编.流式细胞样品制备技术.北京:华夏出版社，1991.14-19.
, 百拇医药
2 Baserga R.Growth regulation of the PCNA gene. J Cell Sci. 1991;98:433-436.
3 Coste A，Rateau JG，Bernaudin JF，et al. Nasal polyposis pathogenesis:a flow cytometric and immunohistochemical study of epithelical cell proliferation.Acta Otolaryngol，1996，116:755-761.
4 Norlander T，Fukami M，Westrin KM，et al. Formation of mucosal polpso in the nasal and maxillary sinus cavities by infection.Otolaryngol Head Neck Surg，1993，109:522-529.
5 Jetten AM. Growth and differentiation factors in tracheobronchial epithelium.Am J Physiol，1991，260(6 Pt1):L361-373.
(收稿：1999-04-15 修回：1999-09-12), http://www.100md.com