应用原位多原酶链反应检测喉癌及喉上皮增生性病变中HPV DNA
作者：林昶 姜泗长 杨伟炎 韩东一 易自翔
单位：350005 福州 福建医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科 林昶 易自翔；解放军总医院耳鼻咽喉科 姜泗长 杨伟炎 韩东一
关键词：
中华耳鼻咽喉科杂志990623 人乳头状瘤病毒(human papillomavirus ,HPV)被认为是引起喉乳头状瘤的主要原因,而HPV与喉的其他增生性病变及喉癌的关系还有争议。原位PCR(polymerase chain reaction， in situ hybridization, ISH，PCR-ISH)是最近发展的一种新技术，综合了PCR敏感性和ISH特异性[1]。我们对21例HPV阳性喉良、恶性增生性病变,应用PCR-ISH及ISH进行HPV DNA检测，对比观察两种方法的结果，探讨HPV感染的生物学特性,与喉组织病理学的关系及临床意义。
, 百拇医药
一、材料和方法
1.材料:21例经HPV6、11、16、18型特异引物PCR检测为阳性的喉良性及恶性肿瘤病理蜡块(表1):鳞癌3例、原位癌2例、乳头状瘤11例、不典型增生4例、角化症1例。每个标本作3个连续切片,分别进行HE、ISH、PCR-ISH检测。阳性对照为HPV6、11、18阳性的尖锐湿疣和宫颈癌。阴性对照为HPV阴性的喉癌及乳头状瘤。
表1 喉癌及喉上皮增生病变病理学类型与HPV类型 病理类型
HPV6
HPV11
HPV18
总计
, 百拇医药
鳞癌
2
1
0
3
原位癌
0
2
0
2
乳头状瘤
10
1
0
, 百拇医药
11
不典型增生
4
0
0
4
角化症
0
0
1
1
合计
16
4
, http://www.100md.com
1
21
表2 PCR-ISH、ISH检测结果对比 组织学类型
PCR
ISH
PCR-ISH
HPV6
HPV11
HPV18
HPV6
HPV11
, 百拇医药
HPV18
HPV6
HPV11
HPV18
鳞癌
2
1
0
0
1
0
2
, 百拇医药 1
0
原位癌
0
2
0
0
1
0
0
1
0
乳头状瘤
10
, 百拇医药
1
0
7
1
0
10
1
0
不典型增生
4
0
0
2
0
, 百拇医药
0
4
0
0
角化症
0
0
1
0
0
1
0
0
1
, 百拇医药
合计
16
4
1
9
3
1
16
3
1
2.主要试剂:HPV6、11、18型E6区引物[2],合成于赛百盛公司；Taq-DNA聚合酶及缓冲液购自军事医学科学院;dNTPs购于岳泰公司;地高辛DNA标记及检测试剂盒购自Boehringer Mannheim公司(德国)。
, 百拇医药
3.原位杂交:探针利用6、11、18型HPVE6区引物PCR扩增产物,长度分别为134、157、183 bp,低熔点琼脂糖凝胶电泳回收纯化,按试剂盒说明采用随机引物法标记地高辛,醋酸纤维膜杂交检测标计效率。
阴性对照:阴性对照标本,阳性对照标本不加探针。
4.原位PCR:应用热启动PCR方法,减少引物错配和引物多聚体形成[2]。
二、结果
两种方法检测结果总结见表2,阳性信号均位于细胞核内,呈紫蓝色。
原位杂交:61.9%(13/21)标本HPV DNA阳性,在多数良性病变中,仅在表层的空泡样变细胞检出阳性信号;1例不典型增生和1例角化症,从基底层至表层细胞均可检出病毒序列;1例鳞癌仅在部分基底细胞检出HPV11病毒序列。
, http://www.100md.com
原位PCR:95.2%(20/21)标本HPV DNA阳性,在所有ISH阳性的地方也呈阳性,阳性细胞数及阳性强度均有增强,2例乳头状瘤,从基底层至表层细胞均可检出病毒序列。2例ISH检测阴性的鳞癌原位PCR检测细胞核呈阳性,其中1例癌旁的不典型增生也呈阳性,1例喉癌深处的腺体细胞核也呈阳性。
阴性对照:包括已知阴性标本,ISH阴性标本未加引物及未扩增及应用不同型的探针均未检出HPV DNA。
三、讨论
PCR-ISH综合了PCR高敏感性和ISH的准确形态学定位,因其步骤复杂,仍处于摸索阶段,还没有一个标准的方法,我们首先建立了PCR-ISH用于喉部HPV感染的检测方法,应用该方法在ISH阴性的标本可以检出HPV DNA。 阴性对照:包括已知阴性标本、ISH阴性标本未加引物、未扩增及应用不同型的探针均未检出HPV DNA,证实了阳性信号的特异性,也未见到弥散现象。从阳性率对比、信号增强及在深层腺体细胞、基底细胞中检出HPV DNA,都说明PCR-ISH较ISH敏感,可检出拷贝数较少的基因。
, http://www.100md.com
HPV目前已发现有90余种亚型,因缺乏体外培养系统,其感染的生物学特性还不清楚。HPV感染喉粘膜的机制还不太清楚,有人认为喉粘膜鳞状上皮与假复层柱状纤毛上皮交界处为易感部位。上呼吸道上皮当受到反复挤压、擦伤、射线等作用,纤毛上皮发生鳞状化生,这种化生上皮处于鳞状上皮与纤毛上皮间,在该处形成的粘液涡流而聚集感染病毒[3]。一般认为HPV先感染基底细胞,随细胞分化成熟,病毒也进行复制和相关基因表达,因而在浅层细胞HPV DNA较多,也易检出。以往文献报道ISH检测结果,均只在喉的良性病变浅层细胞检出HPV DNA；本组ISH在2例、PCR-ISH在4例良性病变从基底层至表层细胞均可检出病毒序列,从组织学上证实了上述假说;同时也说明HPV感染的细胞并不都表现出空泡样变。提示我们在手术清除喉乳头状瘤等与HPV感染有关的病变时,应尽量切除病变,否则残留的感染HPV基底细胞易引起病变的复发。
喉乳头状瘤已较肯定与乳头状瘤病毒感染有关,喉乳头状瘤的治疗主要采用肉眼或手术显微镜下切除或激光气化,手术的范围主要根据术者的肉眼观察来判定。但术后易复发,复发的原因是术中残留病灶或临近区域的外观正常但感染HPV的上皮所致[4，5]。目前尚无一个敏感而客观的指标来判断手术的效果及预后。我们建立的PCR-ISH方法则能较好的解决这个问题,可将其用于手术边缘区域检测来判定有无HPV感染的上皮残留,从而对患者的预后作出判断,为术后的进一步治疗方案提供客观依据。
, 百拇医药
本文结果提示应用PCR-ISH可以结合形态学检测喉癌中的拷贝数较少的基因,PCR-ISH为耳鼻咽喉的分子病理学研究提供了一种新方法。
第一作者：在解放军总医院耳鼻咽喉科博士研究生课题
参考文献
1 Nuovo GJ, Gallery F, Madomull R. An improved technique for detection of DNA by in situ hybridization after polymerase chain reaction.Am J pathol, 1991,139:1239-1244.
2 Erlicht HA, Gelfand D, Sninsky JJ. Recent advances in the polymerase chain reaction. Science,1991,282:1643-1651.
, 百拇医药
3 Kashima H,Mounts P, Leventhal B, et al. Sites of predilection in reccurrent respiratory papillomatosis. Ann Otol Rhinol Laryngol, 1993,102:580-583.
4 Smith EM, Gray SD, Shive C, et al. Detection of human papillomavirus infection in diseased and nondiseased sites of the respiratory tract in recurrent respiratory papillomatosis patients by DNA hybridization.&127;Ann &127;Otol Rhinol Laryngol, 1992,101:408-412.
5 Rihkanen H, Aaltonen L-M, Sysjanen S. Human papillomavirus in laryngeal papillomas and in adjacent normal epithelium.Clin Otolaryngol, 1993,18:470-474.
(收稿：1999-03-19 修回：1999-07-18), 百拇医药
单位：350005 福州 福建医科大学附属第一医院耳鼻咽喉科 林昶 易自翔；解放军总医院耳鼻咽喉科 姜泗长 杨伟炎 韩东一
关键词：
中华耳鼻咽喉科杂志990623 人乳头状瘤病毒(human papillomavirus ,HPV)被认为是引起喉乳头状瘤的主要原因,而HPV与喉的其他增生性病变及喉癌的关系还有争议。原位PCR(polymerase chain reaction， in situ hybridization, ISH，PCR-ISH)是最近发展的一种新技术，综合了PCR敏感性和ISH特异性[1]。我们对21例HPV阳性喉良、恶性增生性病变,应用PCR-ISH及ISH进行HPV DNA检测，对比观察两种方法的结果，探讨HPV感染的生物学特性,与喉组织病理学的关系及临床意义。
, 百拇医药
一、材料和方法
1.材料:21例经HPV6、11、16、18型特异引物PCR检测为阳性的喉良性及恶性肿瘤病理蜡块(表1):鳞癌3例、原位癌2例、乳头状瘤11例、不典型增生4例、角化症1例。每个标本作3个连续切片,分别进行HE、ISH、PCR-ISH检测。阳性对照为HPV6、11、18阳性的尖锐湿疣和宫颈癌。阴性对照为HPV阴性的喉癌及乳头状瘤。
表1 喉癌及喉上皮增生病变病理学类型与HPV类型 病理类型
HPV6
HPV11
HPV18
总计
, 百拇医药
鳞癌
2
1
0
3
原位癌
0
2
0
2
乳头状瘤
10
1
0
, 百拇医药
11
不典型增生
4
0
0
4
角化症
0
0
1
1
合计
16
4
, http://www.100md.com
1
21
表2 PCR-ISH、ISH检测结果对比 组织学类型
PCR
ISH
PCR-ISH
HPV6
HPV11
HPV18
HPV6
HPV11
, 百拇医药
HPV18
HPV6
HPV11
HPV18
鳞癌
2
1
0
0
1
0
2
, 百拇医药 1
0
原位癌
0
2
0
0
1
0
0
1
0
乳头状瘤
10
, 百拇医药
1
0
7
1
0
10
1
0
不典型增生
4
0
0
2
0
, 百拇医药
0
4
0
0
角化症
0
0
1
0
0
1
0
0
1
, 百拇医药
合计
16
4
1
9
3
1
16
3
1
2.主要试剂:HPV6、11、18型E6区引物[2],合成于赛百盛公司；Taq-DNA聚合酶及缓冲液购自军事医学科学院;dNTPs购于岳泰公司;地高辛DNA标记及检测试剂盒购自Boehringer Mannheim公司(德国)。
, 百拇医药
3.原位杂交:探针利用6、11、18型HPVE6区引物PCR扩增产物,长度分别为134、157、183 bp,低熔点琼脂糖凝胶电泳回收纯化,按试剂盒说明采用随机引物法标记地高辛,醋酸纤维膜杂交检测标计效率。
阴性对照:阴性对照标本,阳性对照标本不加探针。
4.原位PCR:应用热启动PCR方法,减少引物错配和引物多聚体形成[2]。
二、结果
两种方法检测结果总结见表2,阳性信号均位于细胞核内,呈紫蓝色。
原位杂交:61.9%(13/21)标本HPV DNA阳性,在多数良性病变中,仅在表层的空泡样变细胞检出阳性信号;1例不典型增生和1例角化症,从基底层至表层细胞均可检出病毒序列;1例鳞癌仅在部分基底细胞检出HPV11病毒序列。
, http://www.100md.com
原位PCR:95.2%(20/21)标本HPV DNA阳性,在所有ISH阳性的地方也呈阳性,阳性细胞数及阳性强度均有增强,2例乳头状瘤,从基底层至表层细胞均可检出病毒序列。2例ISH检测阴性的鳞癌原位PCR检测细胞核呈阳性,其中1例癌旁的不典型增生也呈阳性,1例喉癌深处的腺体细胞核也呈阳性。
阴性对照:包括已知阴性标本,ISH阴性标本未加引物及未扩增及应用不同型的探针均未检出HPV DNA。
三、讨论
PCR-ISH综合了PCR高敏感性和ISH的准确形态学定位,因其步骤复杂,仍处于摸索阶段,还没有一个标准的方法,我们首先建立了PCR-ISH用于喉部HPV感染的检测方法,应用该方法在ISH阴性的标本可以检出HPV DNA。 阴性对照:包括已知阴性标本、ISH阴性标本未加引物、未扩增及应用不同型的探针均未检出HPV DNA,证实了阳性信号的特异性,也未见到弥散现象。从阳性率对比、信号增强及在深层腺体细胞、基底细胞中检出HPV DNA,都说明PCR-ISH较ISH敏感,可检出拷贝数较少的基因。
, http://www.100md.com
HPV目前已发现有90余种亚型,因缺乏体外培养系统,其感染的生物学特性还不清楚。HPV感染喉粘膜的机制还不太清楚,有人认为喉粘膜鳞状上皮与假复层柱状纤毛上皮交界处为易感部位。上呼吸道上皮当受到反复挤压、擦伤、射线等作用,纤毛上皮发生鳞状化生,这种化生上皮处于鳞状上皮与纤毛上皮间,在该处形成的粘液涡流而聚集感染病毒[3]。一般认为HPV先感染基底细胞,随细胞分化成熟,病毒也进行复制和相关基因表达,因而在浅层细胞HPV DNA较多,也易检出。以往文献报道ISH检测结果,均只在喉的良性病变浅层细胞检出HPV DNA；本组ISH在2例、PCR-ISH在4例良性病变从基底层至表层细胞均可检出病毒序列,从组织学上证实了上述假说;同时也说明HPV感染的细胞并不都表现出空泡样变。提示我们在手术清除喉乳头状瘤等与HPV感染有关的病变时,应尽量切除病变,否则残留的感染HPV基底细胞易引起病变的复发。
喉乳头状瘤已较肯定与乳头状瘤病毒感染有关,喉乳头状瘤的治疗主要采用肉眼或手术显微镜下切除或激光气化,手术的范围主要根据术者的肉眼观察来判定。但术后易复发,复发的原因是术中残留病灶或临近区域的外观正常但感染HPV的上皮所致[4，5]。目前尚无一个敏感而客观的指标来判断手术的效果及预后。我们建立的PCR-ISH方法则能较好的解决这个问题,可将其用于手术边缘区域检测来判定有无HPV感染的上皮残留,从而对患者的预后作出判断,为术后的进一步治疗方案提供客观依据。
, 百拇医药
本文结果提示应用PCR-ISH可以结合形态学检测喉癌中的拷贝数较少的基因,PCR-ISH为耳鼻咽喉的分子病理学研究提供了一种新方法。
第一作者：在解放军总医院耳鼻咽喉科博士研究生课题
参考文献
1 Nuovo GJ, Gallery F, Madomull R. An improved technique for detection of DNA by in situ hybridization after polymerase chain reaction.Am J pathol, 1991,139:1239-1244.
2 Erlicht HA, Gelfand D, Sninsky JJ. Recent advances in the polymerase chain reaction. Science,1991,282:1643-1651.
, 百拇医药
3 Kashima H,Mounts P, Leventhal B, et al. Sites of predilection in reccurrent respiratory papillomatosis. Ann Otol Rhinol Laryngol, 1993,102:580-583.
4 Smith EM, Gray SD, Shive C, et al. Detection of human papillomavirus infection in diseased and nondiseased sites of the respiratory tract in recurrent respiratory papillomatosis patients by DNA hybridization.&127;Ann &127;Otol Rhinol Laryngol, 1992,101:408-412.
5 Rihkanen H, Aaltonen L-M, Sysjanen S. Human papillomavirus in laryngeal papillomas and in adjacent normal epithelium.Clin Otolaryngol, 1993,18:470-474.
(收稿：1999-03-19 修回：1999-07-18), 百拇医药