水杨酸钠抗庆大霉素耳毒性作用机理研究
作者：王锦玲 黄维国 陈阳 刘顺利 查定军
单位：王锦玲(西安 第四军医大学附属西京医院耳鼻咽喉科 710032)；黄维国(西安 第四军医大学附属西京医院耳鼻咽喉科 710032)；陈阳(西安 第四军医大学附属西京医院耳鼻咽喉科10032)；刘顺利(西安 第四军医大学附属西京医院耳鼻咽喉科 710032)；查定军(西安 第四医大学附属西京医院耳鼻咽喉科 710032)
关键词：
中华耳鼻咽喉科杂志000120 观察水杨酸钠预防庆大霉素(gentamicin，GM)耳毒性作用。
一、材料及方法
1. 实验动物：耳廓反射正常的杂色豚鼠36只，体重250～350 g，分为4组，每组9只。GM组：硫酸庆大霉素120 mg/kg体重皮下注射，每日1次；水杨酸组：水杨酸钠116 mg/kg体重皮下注射，每日2次；GM+水杨酸组：GM和第一次水杨酸钠同时注射，剂量同上。对照组：生理盐水等量皮下注射，每日1次。4组均连续注射19 d。
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2. 实验程序：用药前及用药后9、19、28和42 d检测ABR。
19 d检测听性脑干反应(auditory brainstem response，ABR)后各组随机取4只动物断头处死，各取1耳铀铅染色制备透射电镜标本，另1耳硝酸银染色法常规制备耳蜗铺片标本。9和19 d各组取3只动物断头活杀，迅速取出耳蜗，双耳合为1份标本制成2%匀浆，采用南京建成生物工程研究所的丙二醛(methane dicarboxylic aldehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒检测耳蜗组织匀浆相应项目；采用北京东亚免疫技术研究所的放射免疫药盒测定耳蜗组织匀浆的6-Keto-PGF1α水平；原子吸收分光光度计检测铁的含量。GM组和GM+水杨酸组动物9和19 d注射庆大霉素后1 h剪爪取血，取血清-20℃冻存测定血清尿素氮、肌苷和庆大霉素含量。
二、结果
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实验动物GM组死亡2只，GM+水杨酸组死亡1只，各组体重与对照组比较，GM组体重增长最慢(P<0.01)，水杨酸组次之(P<0.05)，GM+水杨酸组与对照组差异无显著性(P>0.05)。
1. ABR检测：GM组豚鼠1和8 kHz的ABR平均反应阈(
±s，下同)28 d达最高阈移分别为(22±16)dB和(55±37)dB，而GM+水杨酸组对应的阈移分别为(10±18)dB和(23±15)dB，方差分析差异有显著性(P<0.05)。高频听力损失比低频重，差异有显著性(P<0.01)。对照组和水杨酸组的反应阈没有明显变化(P>0.05)。
2. 形态学观察：GM组病变广泛，遍于耳蜗的1～4回，最严重的病变在底回，内、外毛细胞近于消失或完全消失(图1)。病变严重者第二回的内、外毛细胞也消失大半。GM+水杨酸组损伤相对较轻(图2)，第二、三排外毛细胞基本保留，但排列紊乱。水杨酸组内、外毛细胞排列整齐，偶有缺失(图3)。GM组超微结构改变可见毛细胞线粒体数目减少，次级溶酶多泡体增多，重者胞浆稀疏，出现大空泡(图4)，甚至细胞破碎。GM+水杨酸组超微结构改变主要是次级溶酶多泡体增多(图5)。
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图1 第19日GM组第二回外毛细胞消失大半。×400
图2 第19日GM+水杨酸组第二回损伤相对较轻，但排列紊乱。×400
图3 第19日水杨酸组第二回毛细胞排列整齐，偶有缺失。×400
图4 第4周GM组第二回外毛细胞胞浆稀疏，出现大空泡，胞膜不平。×4 000
图5 第4周GM+水杨酸组第二回毛细胞次级溶酶多泡体增多。×6 000
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3. 生化检测：GM+水杨酸组耳蜗组织9和19 d的MDA平均含量为2.6、2.3 nmol/mg蛋白，低于GM组4.3、4.5 nmol/mg蛋白；MDA含量与ABR阈移呈显著相关(R2=0.9088，P<0.01)。GM组和GM+水杨酸组耳蜗组织的SOD分别为151.2、120.3 U/mg蛋白，明显高于另外2组(4.9、5.8 U/mg蛋白，P<0.01)。GM+水杨酸组耳蜗组织9 d和19 d的铁离子平均含量为37.56、32.83 nmol/mg蛋白，明显低于GM组(65.25、62.51 nmol/mg蛋白，P<0.05)。水杨酸组和GM+水杨酸组耳蜗组织6-Keto-PGF1α(187.6、220.7 pg/mg蛋白)明显低于GM组和对照组(1 245、1 240 pg/mg蛋白)。GM组19 d的血清尿素氮和肌苷分别为(38.1±6.3)和(85.2±11.3) mmol/L，GM+水杨酸组分别为(17.4±6.5) mmol/L和(54.3±17.8)mmol/L，组间差异有显著性(P<0.01)。GM组和GM+水杨酸组血清GM浓度差异无显著性(P>0.05)。
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三、讨论
我们的实验[1]证实铁螯合剂甲磺酸去铁胺可能通过清除铁离子拮抗GM的耳毒作用。多名学者用不同方法都证实自由基，尤其是羟自由基在庆大霉素耳毒性中起关键作用。自由基反应涉及最多的金属离子是铁离子，Fe2+参与Fenton型Harber-Weiss反应产生羟自由基。
水杨酸即邻羟基苯甲酸，遇氧自由基可氧化生成2，3-二羟基苯甲酸，后者已证实为有效GM耳毒性拮抗剂。水杨酸可通过直接和间接的双重作用清除GM催化产生的自由基，而且作用部位准确。一般认为超大剂量的水杨酸药物可引起听力下降和耳鸣，但其听力损害是可逆的，2～3周后多恢复正常。本实验大剂量水杨酸钠皮下注射，未见听阈上升和耳蜗毛细胞损害。Sha等[2]注射相同剂量的水杨酸使庆大霉素引起的ABR阈移减少了40 dB，而未见耳毒副作用。由于实验中庆大霉素用量大于临床约20倍，水杨酸钠的用量仅相当于抗风湿剂量的4倍左右，推测水杨酸制剂可能在安全范围内有效预防庆大霉素的耳毒性和肾毒性。
参考文献：
[1]陈阳，王锦玲，黄维国，等.甲磺酸去铁胺抗庆大霉素耳毒性作用及机理研究.中华耳鼻咽喉科杂志，1999,34:154-156.
[2]Sha SH, Schacht J.Salicylate attenuates gentamicin-induced ototoxicity. Lab Invest, 1999, 79: 807-813.
收稿日期：1999-07-24, 百拇医药
单位：王锦玲(西安 第四军医大学附属西京医院耳鼻咽喉科 710032)；黄维国(西安 第四军医大学附属西京医院耳鼻咽喉科 710032)；陈阳(西安 第四军医大学附属西京医院耳鼻咽喉科10032)；刘顺利(西安 第四军医大学附属西京医院耳鼻咽喉科 710032)；查定军(西安 第四医大学附属西京医院耳鼻咽喉科 710032)
关键词：
中华耳鼻咽喉科杂志000120 观察水杨酸钠预防庆大霉素(gentamicin，GM)耳毒性作用。
一、材料及方法
1. 实验动物：耳廓反射正常的杂色豚鼠36只，体重250～350 g，分为4组，每组9只。GM组：硫酸庆大霉素120 mg/kg体重皮下注射，每日1次；水杨酸组：水杨酸钠116 mg/kg体重皮下注射，每日2次；GM+水杨酸组：GM和第一次水杨酸钠同时注射，剂量同上。对照组：生理盐水等量皮下注射，每日1次。4组均连续注射19 d。
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2. 实验程序：用药前及用药后9、19、28和42 d检测ABR。
19 d检测听性脑干反应(auditory brainstem response，ABR)后各组随机取4只动物断头处死，各取1耳铀铅染色制备透射电镜标本，另1耳硝酸银染色法常规制备耳蜗铺片标本。9和19 d各组取3只动物断头活杀，迅速取出耳蜗，双耳合为1份标本制成2%匀浆，采用南京建成生物工程研究所的丙二醛(methane dicarboxylic aldehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)和考马斯亮蓝蛋白测定试剂盒检测耳蜗组织匀浆相应项目；采用北京东亚免疫技术研究所的放射免疫药盒测定耳蜗组织匀浆的6-Keto-PGF1α水平；原子吸收分光光度计检测铁的含量。GM组和GM+水杨酸组动物9和19 d注射庆大霉素后1 h剪爪取血，取血清-20℃冻存测定血清尿素氮、肌苷和庆大霉素含量。
二、结果
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实验动物GM组死亡2只，GM+水杨酸组死亡1只，各组体重与对照组比较，GM组体重增长最慢(P<0.01)，水杨酸组次之(P<0.05)，GM+水杨酸组与对照组差异无显著性(P>0.05)。
1. ABR检测：GM组豚鼠1和8 kHz的ABR平均反应阈(
±s，下同)28 d达最高阈移分别为(22±16)dB和(55±37)dB，而GM+水杨酸组对应的阈移分别为(10±18)dB和(23±15)dB，方差分析差异有显著性(P<0.05)。高频听力损失比低频重，差异有显著性(P<0.01)。对照组和水杨酸组的反应阈没有明显变化(P>0.05)。2. 形态学观察：GM组病变广泛，遍于耳蜗的1～4回，最严重的病变在底回，内、外毛细胞近于消失或完全消失(图1)。病变严重者第二回的内、外毛细胞也消失大半。GM+水杨酸组损伤相对较轻(图2)，第二、三排外毛细胞基本保留，但排列紊乱。水杨酸组内、外毛细胞排列整齐，偶有缺失(图3)。GM组超微结构改变可见毛细胞线粒体数目减少，次级溶酶多泡体增多，重者胞浆稀疏，出现大空泡(图4)，甚至细胞破碎。GM+水杨酸组超微结构改变主要是次级溶酶多泡体增多(图5)。
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图1 第19日GM组第二回外毛细胞消失大半。×400
图2 第19日GM+水杨酸组第二回损伤相对较轻，但排列紊乱。×400
图3 第19日水杨酸组第二回毛细胞排列整齐，偶有缺失。×400
图4 第4周GM组第二回外毛细胞胞浆稀疏，出现大空泡，胞膜不平。×4 000
图5 第4周GM+水杨酸组第二回毛细胞次级溶酶多泡体增多。×6 000
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3. 生化检测：GM+水杨酸组耳蜗组织9和19 d的MDA平均含量为2.6、2.3 nmol/mg蛋白，低于GM组4.3、4.5 nmol/mg蛋白；MDA含量与ABR阈移呈显著相关(R2=0.9088，P<0.01)。GM组和GM+水杨酸组耳蜗组织的SOD分别为151.2、120.3 U/mg蛋白，明显高于另外2组(4.9、5.8 U/mg蛋白，P<0.01)。GM+水杨酸组耳蜗组织9 d和19 d的铁离子平均含量为37.56、32.83 nmol/mg蛋白，明显低于GM组(65.25、62.51 nmol/mg蛋白，P<0.05)。水杨酸组和GM+水杨酸组耳蜗组织6-Keto-PGF1α(187.6、220.7 pg/mg蛋白)明显低于GM组和对照组(1 245、1 240 pg/mg蛋白)。GM组19 d的血清尿素氮和肌苷分别为(38.1±6.3)和(85.2±11.3) mmol/L，GM+水杨酸组分别为(17.4±6.5) mmol/L和(54.3±17.8)mmol/L，组间差异有显著性(P<0.01)。GM组和GM+水杨酸组血清GM浓度差异无显著性(P>0.05)。
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三、讨论
我们的实验[1]证实铁螯合剂甲磺酸去铁胺可能通过清除铁离子拮抗GM的耳毒作用。多名学者用不同方法都证实自由基，尤其是羟自由基在庆大霉素耳毒性中起关键作用。自由基反应涉及最多的金属离子是铁离子，Fe2+参与Fenton型Harber-Weiss反应产生羟自由基。
水杨酸即邻羟基苯甲酸，遇氧自由基可氧化生成2，3-二羟基苯甲酸，后者已证实为有效GM耳毒性拮抗剂。水杨酸可通过直接和间接的双重作用清除GM催化产生的自由基，而且作用部位准确。一般认为超大剂量的水杨酸药物可引起听力下降和耳鸣，但其听力损害是可逆的，2～3周后多恢复正常。本实验大剂量水杨酸钠皮下注射，未见听阈上升和耳蜗毛细胞损害。Sha等[2]注射相同剂量的水杨酸使庆大霉素引起的ABR阈移减少了40 dB，而未见耳毒副作用。由于实验中庆大霉素用量大于临床约20倍，水杨酸钠的用量仅相当于抗风湿剂量的4倍左右，推测水杨酸制剂可能在安全范围内有效预防庆大霉素的耳毒性和肾毒性。
参考文献：
[1]陈阳，王锦玲，黄维国，等.甲磺酸去铁胺抗庆大霉素耳毒性作用及机理研究.中华耳鼻咽喉科杂志，1999,34:154-156.
[2]Sha SH, Schacht J.Salicylate attenuates gentamicin-induced ototoxicity. Lab Invest, 1999, 79: 807-813.
收稿日期：1999-07-24, 百拇医药