内淋巴囊上皮细胞透明质酸合成酶mRNA的表达
作者：牟忠林 刘兆华 陈剑 万瑛
单位：牟忠林(重庆 第三军医大学大坪医院耳鼻咽喉-头颈外科 400042)；刘兆华(重庆 第三军医大学大坪医院耳鼻咽喉-头颈外科 400042)；陈剑(重庆 第三军医大学大坪医院耳鼻咽喉-头颈外科 400042) 万瑛(第三军医大学分子生物学教研室)
关键词：内淋巴囊；透明质酸；原位杂交；RNA；信使
中华耳鼻咽喉科杂志000104 摘 要：目的 研究内淋巴囊上皮细胞透明质酸合成酶(hyaluronan synthase)mRNA的表达及其意义。方法 在查阅核酸序列数据库基础上，采用Motif程序分析各物种(大鼠、小鼠、爪蟾、人类)透明质酸合成酶的保守序列，应用原位杂交技术检测透明质酸合成酶mRNA在内淋巴囊上皮细胞的表达。结果 内淋巴囊近侧端、中间部均有部分上皮细胞胞浆显示透明质酸合成酶mRNA的阳性表达。结论 在分子生物学水平证实了内淋巴囊上皮细胞能合成透明质酸。
, http://www.100md.com
mRNA expression of hyaluronan synthase in the
endolymphatic sac cells of guinea pigs
MOU Zhonglin
(Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China)
LIU Zhaohua
(Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China)
, 百拇医药
CHEN Jian
(Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China)
Abstract：Objective To detect the mRNA expression of hyaluronan synthase in the endolymphatic sac cells of guinea pigs. Methods After consulting gene bankTM, we analyzed conservative sequence of hyaluronan synthases in different species, detected the mRNA expression of hyaluronan synthase in the endolymphatic sac cells of guinea pigs with oligonucleotide probe by hybridization in situ. Results mRNA of hyaluronan synthase was strongly expressed in some epithelial cells of endolymphatic sac, coupled with negative expression in negative control groups. Conclusion It confirms that endolymphatic sac cells can synthesize hyaluronan.
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Key words：Endolymphatic sac；Hyaluronic acid；In situ hybridization；RNA，messenger▲
研究表明内淋巴囊上皮细胞能通过合成透明质酸来调节内淋巴的平衡。为深入研究内淋巴囊上皮细胞合成透明质酸的过程及作用，我们用原位杂交的方法检测了透明质酸合成酶(hyaluronan synthase)在内淋巴囊上皮细胞的表达，并对其意义进行了讨论。
材料与方法
1. 实验动物的选取：健康红目白色豚鼠6只， 听性脑干反应(美国Nicolet CompassⅡ)示Ⅲ、Ⅴ波反应阈和潜伏期正常，体重250～400 g，雌雄不限，由第三军医大学动物所提供。
2. 内淋巴囊的剥取: 断头处死豚鼠后修剪枕颞骨，解剖显微镜下在后、上半规管延长线的交点，乙状窦之前分离、剥取内淋巴囊， 4%多聚甲醛固定3 h，30%蔗糖脱水24 h。
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3. 探针的设计和制备: 查阅核酸序列数据库， 采用Motif程序， 分析各物种(大鼠、小鼠、爪蟾、人类)透明质酸合成酶的保守序列，设计的寡聚核苷酸探针为[1，2]: 5＇ RAA RTA NSW YTT NGT CCA NCK NGT YTG YTG 3＇
R指A 或G；N指A、C、G 或T；W指A或T；Y指C或T；K指G或T；S指C或 G。 该寡聚核苷酸探针委托上海生物制品研究所合成。
4. 3＇-末端寡聚核苷酸探针标记: 将探针溶于100 μL重蒸水中，按照地高辛3＇-末端寡聚核苷酸探针标记试剂盒所示步骤加入反应物(该试剂盒及以下有关试剂均由德国宝灵曼公司提供)，短暂离心后置37℃水浴15 h，70℃终止反应后迅速置于冰上。倍比稀释，点膜，80℃烤膜3 h。洗膜，检测所标记的探针浓度为25 pmol/L。
5. 原位杂交：载玻片经焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate, DEPC)水处理后烤干，涂布多聚赖氨酸。15 μm冰冻切片备用，蛋白酶K消化5 min，预杂交30 min， 加入探针杂交16 h。每组中一张切片不加探针作为阴性对照，周围硬脑膜纤维细胞作为阳性对照。4%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100) 加入SSC(氯化钠+含水枸橼酸钠+DEPC)漂洗，封阻45 min，加抗体置37 ℃水浴3 h，NBT-BCIP[四唑氮蓝(Nitro -Blue-Tetrazolium)+ 5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)]显色16 h，Tris盐酸+乙二胺四乙酸(edathamil)终止。无水酒精脱水，二甲苯透明，DPX[聚苯乙烯(distrene)+酞酸丁二酯(dibutyl phthalate) +二甲苯(xylene)]封片，Olympus光镜下观察并照像。
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结果
光镜下内淋巴囊上皮细胞近侧端为单层立方上皮，中间部为单层柱状上皮， 远侧端呈扁平状，腔内可见浮游细胞和碎片。在内淋巴囊的近侧端和中间部均有部分上皮细胞胞浆显示透明质酸合成酶mRNA的阳性颗粒(图1)。上皮下组织亦见透明质酸合成酶mRNA的阳性颗粒。阴性对照均无表达。阳性对照的表达较强。
图1肉淋巴囊的部分单层立方和柱状上皮细胞胞浆显示透明质酸合成酶mRNA的阳性表达,黑箭头示透明合成酶mRNA的阳性细胞,空心箭头示透明质合成酶mRNA的阴性细胞。NBP-BCIP染色×400
讨论
有学者[3]认为内淋巴囊上皮细胞具有合成和降解透明质酸的双重功能，调节透明质酸合成速度的是透明质酸合成酶，降解透明质酸的是透明质酸酶和经细胞侧间隙进入内淋巴囊腔的巨噬细胞。近来发现的位于单核巨噬系统细胞表面的透明质酸受体(CD44)能与透明质酸结合，有助于巨噬细胞清除内淋巴囊腔内的透明质酸[4]。透明质酸是一种由重复的葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺组成的高分子糖胺聚糖，能结合水构成凝胶状，其流体动力学体积比干燥分子的体积大1 000倍[5] 。内淋巴囊腔内透明质酸强的吸水性可能是促使内淋巴流向内淋巴囊的动力因素之一。透射电镜下豚鼠内淋巴囊中间部上皮细胞为单层柱状上皮，分亮、暗两型细胞。亮细胞富含线粒体、核糖体和粗面内质网。迷路切除[6]、静脉注射高渗性脱水剂(如甘油)[7]和利尿酸[8]内淋巴容量减少至渗透压升高时，大部分亮细胞变得具有分泌潜力，粗面内质网、高尔基体发达，并有管状结构连接其间，由粗面内质网和高尔基体合成的透明质酸通过管状结构进入内淋巴囊腔内，吸取水分和电解质，直至平衡。内淋巴容量增加又可反射性抑制透明质酸的分泌， 并刺激透明质酸酶的产生，因此透明质酸对维持内淋巴的平衡起着重要作用[3]。有学者认为透明质酸/透明质酸酶调节的失衡可导致透明质酸在内淋巴囊腔的积聚而产生膜迷路积水[3]。值得注意的是透明质酸/透明质酸酶的双重调节作用还存在水和离子转运活跃的肾小管上皮细胞，透明质酸酶不仅能消化肾小管腔内的透明质酸，还能增加肾小管上皮对水的通透性[9]。由于亮细胞有合成透明质酸的功能，因此，本实验结果中显示透明质酸合成酶mRNA阳性颗粒的内淋巴囊上皮细胞可能为电镜下的亮细胞。
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寡聚核苷酸探针能根据需要人工用DNA合成仪合成，其长度及分子大小比较一致，且短的探针比长探针杂交速度快。本实验设计的探针为30 bp，大小居中，特异性强，杂交结果可靠，在分子生物学水平上进一步证实了内淋巴囊上皮细胞能合成透明质酸。
基金项目：重庆市应用基础研究项目(渝科委计1999年33号)
参考文献：
[1]Shyjan AM, Heldin P, Butcher EC, et al. Functional cloning of the cDNA for a human hyaluronan synthase.J Biol Chem, 1996, 271:23395-23399.
[2]Spicer AP, Augustine ML, McDonald JA. Molecular cloning and characterization of a putative mouse hyaluronan synthase. J Biol Chem, 1996,271:23400-23406.
, 百拇医药
[3]Amoils CP, Schindler RA, Parker DA, et al. Hyaluronan synthesis by in vitro cultured endolymphatic sac cells. Am J Otol, 1992，13：303-307.
[4]Naot D, Sionov RV, Ish-Shalom D. CD44: structure, function, and association with the malignant process. Adv Cancer Res, 1997, 71: 241-319.
[5]Bothner H, Wik O. Rheology of hyalruonate. Acta Otolaryngol, 1987, Suppl. 442:25-30.
[6]牟忠林, 刘兆华. 迷路切除后豚鼠内淋巴囊及腔内容物的超微结构观察. 临床耳鼻咽喉科杂志, 1995, 9增刊: 68-70.
, 百拇医药
[7]Erwall C. General effects of hyperosmolar agents on the endolymphatic sac. Hear Res，1988,36:277-286.
[8]Takumida M, Bagger-Sjoback D, Rask-Andersen H. Cytochemical identification of secreted carbohydrates in the endolymphatic sac. Acta Otolaryngol, 1988, 106:417-427.
[9]Varma R, Varma RS. Mucopolysaccharides-glycosaminoglycans of body fluids in health and disease. New York: Walter de Gruyten, 1983. 95-99.
收稿日期：1999-07-08, 百拇医药
单位：牟忠林(重庆 第三军医大学大坪医院耳鼻咽喉-头颈外科 400042)；刘兆华(重庆 第三军医大学大坪医院耳鼻咽喉-头颈外科 400042)；陈剑(重庆 第三军医大学大坪医院耳鼻咽喉-头颈外科 400042) 万瑛(第三军医大学分子生物学教研室)
关键词：内淋巴囊；透明质酸；原位杂交；RNA；信使
中华耳鼻咽喉科杂志000104 摘 要：目的 研究内淋巴囊上皮细胞透明质酸合成酶(hyaluronan synthase)mRNA的表达及其意义。方法 在查阅核酸序列数据库基础上，采用Motif程序分析各物种(大鼠、小鼠、爪蟾、人类)透明质酸合成酶的保守序列，应用原位杂交技术检测透明质酸合成酶mRNA在内淋巴囊上皮细胞的表达。结果 内淋巴囊近侧端、中间部均有部分上皮细胞胞浆显示透明质酸合成酶mRNA的阳性表达。结论 在分子生物学水平证实了内淋巴囊上皮细胞能合成透明质酸。
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mRNA expression of hyaluronan synthase in the
endolymphatic sac cells of guinea pigs
MOU Zhonglin
(Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China)
LIU Zhaohua
(Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China)
, 百拇医药
CHEN Jian
(Department of Otorhinolaryngology Head and Neck Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400042, China)
Abstract：Objective To detect the mRNA expression of hyaluronan synthase in the endolymphatic sac cells of guinea pigs. Methods After consulting gene bankTM, we analyzed conservative sequence of hyaluronan synthases in different species, detected the mRNA expression of hyaluronan synthase in the endolymphatic sac cells of guinea pigs with oligonucleotide probe by hybridization in situ. Results mRNA of hyaluronan synthase was strongly expressed in some epithelial cells of endolymphatic sac, coupled with negative expression in negative control groups. Conclusion It confirms that endolymphatic sac cells can synthesize hyaluronan.
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Key words：Endolymphatic sac；Hyaluronic acid；In situ hybridization；RNA，messenger▲
研究表明内淋巴囊上皮细胞能通过合成透明质酸来调节内淋巴的平衡。为深入研究内淋巴囊上皮细胞合成透明质酸的过程及作用，我们用原位杂交的方法检测了透明质酸合成酶(hyaluronan synthase)在内淋巴囊上皮细胞的表达，并对其意义进行了讨论。
材料与方法
1. 实验动物的选取：健康红目白色豚鼠6只， 听性脑干反应(美国Nicolet CompassⅡ)示Ⅲ、Ⅴ波反应阈和潜伏期正常，体重250～400 g，雌雄不限，由第三军医大学动物所提供。
2. 内淋巴囊的剥取: 断头处死豚鼠后修剪枕颞骨，解剖显微镜下在后、上半规管延长线的交点，乙状窦之前分离、剥取内淋巴囊， 4%多聚甲醛固定3 h，30%蔗糖脱水24 h。
, 百拇医药
3. 探针的设计和制备: 查阅核酸序列数据库， 采用Motif程序， 分析各物种(大鼠、小鼠、爪蟾、人类)透明质酸合成酶的保守序列，设计的寡聚核苷酸探针为[1，2]: 5＇ RAA RTA NSW YTT NGT CCA NCK NGT YTG YTG 3＇
R指A 或G；N指A、C、G 或T；W指A或T；Y指C或T；K指G或T；S指C或 G。 该寡聚核苷酸探针委托上海生物制品研究所合成。
4. 3＇-末端寡聚核苷酸探针标记: 将探针溶于100 μL重蒸水中，按照地高辛3＇-末端寡聚核苷酸探针标记试剂盒所示步骤加入反应物(该试剂盒及以下有关试剂均由德国宝灵曼公司提供)，短暂离心后置37℃水浴15 h，70℃终止反应后迅速置于冰上。倍比稀释，点膜，80℃烤膜3 h。洗膜，检测所标记的探针浓度为25 pmol/L。
5. 原位杂交：载玻片经焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate, DEPC)水处理后烤干，涂布多聚赖氨酸。15 μm冰冻切片备用，蛋白酶K消化5 min，预杂交30 min， 加入探针杂交16 h。每组中一张切片不加探针作为阴性对照，周围硬脑膜纤维细胞作为阳性对照。4%聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100) 加入SSC(氯化钠+含水枸橼酸钠+DEPC)漂洗，封阻45 min，加抗体置37 ℃水浴3 h，NBT-BCIP[四唑氮蓝(Nitro -Blue-Tetrazolium)+ 5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸盐(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate)]显色16 h，Tris盐酸+乙二胺四乙酸(edathamil)终止。无水酒精脱水，二甲苯透明，DPX[聚苯乙烯(distrene)+酞酸丁二酯(dibutyl phthalate) +二甲苯(xylene)]封片，Olympus光镜下观察并照像。
, http://www.100md.com
结果
光镜下内淋巴囊上皮细胞近侧端为单层立方上皮，中间部为单层柱状上皮， 远侧端呈扁平状，腔内可见浮游细胞和碎片。在内淋巴囊的近侧端和中间部均有部分上皮细胞胞浆显示透明质酸合成酶mRNA的阳性颗粒(图1)。上皮下组织亦见透明质酸合成酶mRNA的阳性颗粒。阴性对照均无表达。阳性对照的表达较强。
图1肉淋巴囊的部分单层立方和柱状上皮细胞胞浆显示透明质酸合成酶mRNA的阳性表达,黑箭头示透明合成酶mRNA的阳性细胞,空心箭头示透明质合成酶mRNA的阴性细胞。NBP-BCIP染色×400
讨论
有学者[3]认为内淋巴囊上皮细胞具有合成和降解透明质酸的双重功能，调节透明质酸合成速度的是透明质酸合成酶，降解透明质酸的是透明质酸酶和经细胞侧间隙进入内淋巴囊腔的巨噬细胞。近来发现的位于单核巨噬系统细胞表面的透明质酸受体(CD44)能与透明质酸结合，有助于巨噬细胞清除内淋巴囊腔内的透明质酸[4]。透明质酸是一种由重复的葡萄糖醛酸和N-乙酰葡萄糖胺组成的高分子糖胺聚糖，能结合水构成凝胶状，其流体动力学体积比干燥分子的体积大1 000倍[5] 。内淋巴囊腔内透明质酸强的吸水性可能是促使内淋巴流向内淋巴囊的动力因素之一。透射电镜下豚鼠内淋巴囊中间部上皮细胞为单层柱状上皮，分亮、暗两型细胞。亮细胞富含线粒体、核糖体和粗面内质网。迷路切除[6]、静脉注射高渗性脱水剂(如甘油)[7]和利尿酸[8]内淋巴容量减少至渗透压升高时，大部分亮细胞变得具有分泌潜力，粗面内质网、高尔基体发达，并有管状结构连接其间，由粗面内质网和高尔基体合成的透明质酸通过管状结构进入内淋巴囊腔内，吸取水分和电解质，直至平衡。内淋巴容量增加又可反射性抑制透明质酸的分泌， 并刺激透明质酸酶的产生，因此透明质酸对维持内淋巴的平衡起着重要作用[3]。有学者认为透明质酸/透明质酸酶调节的失衡可导致透明质酸在内淋巴囊腔的积聚而产生膜迷路积水[3]。值得注意的是透明质酸/透明质酸酶的双重调节作用还存在水和离子转运活跃的肾小管上皮细胞，透明质酸酶不仅能消化肾小管腔内的透明质酸，还能增加肾小管上皮对水的通透性[9]。由于亮细胞有合成透明质酸的功能，因此，本实验结果中显示透明质酸合成酶mRNA阳性颗粒的内淋巴囊上皮细胞可能为电镜下的亮细胞。
, http://www.100md.com
寡聚核苷酸探针能根据需要人工用DNA合成仪合成，其长度及分子大小比较一致，且短的探针比长探针杂交速度快。本实验设计的探针为30 bp，大小居中，特异性强，杂交结果可靠，在分子生物学水平上进一步证实了内淋巴囊上皮细胞能合成透明质酸。
基金项目：重庆市应用基础研究项目(渝科委计1999年33号)
参考文献：
[1]Shyjan AM, Heldin P, Butcher EC, et al. Functional cloning of the cDNA for a human hyaluronan synthase.J Biol Chem, 1996, 271:23395-23399.
[2]Spicer AP, Augustine ML, McDonald JA. Molecular cloning and characterization of a putative mouse hyaluronan synthase. J Biol Chem, 1996,271:23400-23406.
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[3]Amoils CP, Schindler RA, Parker DA, et al. Hyaluronan synthesis by in vitro cultured endolymphatic sac cells. Am J Otol, 1992，13：303-307.
[4]Naot D, Sionov RV, Ish-Shalom D. CD44: structure, function, and association with the malignant process. Adv Cancer Res, 1997, 71: 241-319.
[5]Bothner H, Wik O. Rheology of hyalruonate. Acta Otolaryngol, 1987, Suppl. 442:25-30.
[6]牟忠林, 刘兆华. 迷路切除后豚鼠内淋巴囊及腔内容物的超微结构观察. 临床耳鼻咽喉科杂志, 1995, 9增刊: 68-70.
, 百拇医药
[7]Erwall C. General effects of hyperosmolar agents on the endolymphatic sac. Hear Res，1988,36:277-286.
[8]Takumida M, Bagger-Sjoback D, Rask-Andersen H. Cytochemical identification of secreted carbohydrates in the endolymphatic sac. Acta Otolaryngol, 1988, 106:417-427.
[9]Varma R, Varma RS. Mucopolysaccharides-glycosaminoglycans of body fluids in health and disease. New York: Walter de Gruyten, 1983. 95-99.
收稿日期：1999-07-08, 百拇医药