快速原位杂交技术检测EB病毒在鼻咽癌诊断中的应用
作者：刘明 朴彰洙
单位：刘明(518000 广东省 深圳市人民医院耳鼻咽喉科)；朴彰洙(韩国全南大学校病院病理科)
关键词：
中华耳鼻咽喉科杂志000331 快速原位杂交技术是近年来发展起来的新技术。它在原有原位杂交技术的基础上，采用新技术，在1 h内可完成全部检测过程[1]，敏感性高，结果可靠，工作效率大大提高，是鼻咽癌病因学研究的有效手段。本文应用此方法对鼻咽癌标本中和非癌鼻咽粘膜组织中的EBV的表达进行了比较研究。
一、材料和方法
1. 标本:本实验使用的标本均为常规10%中性福尔马林固定、石蜡包埋的组织标本，取自1995年9月～1997年5月深圳市人民医院108例鼻咽癌组织标本和20例正常鼻咽粘膜组织。所有组织标本均经HE染色确诊。鼻咽癌标本组织学诊断按照WHO推荐的分类标准分成Ⅰ型(鳞状细胞癌)、Ⅱ型(未角化细胞癌)和Ⅲ型(未分化癌)。对其中6例HE染色诊断有争议的标本，经抗角蛋白单克隆抗体复染以明确诊断。本组标本中Ⅰ型2例(2/108, 1.9%)，Ⅱ型43例(43/108, 39.8%)，Ⅲ型63例(63/108, 58.3%)。有关标本的临床特征见表1。
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表1 各组标本临床特征 组织来源
标本
数目
性别
(男∶女)
平均
年龄
鼻咽癌Ⅰ型
2
2∶ 0
51.50
Ⅱ型
43
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46∶17
52.33
Ⅲ型
63
33∶10
46.28
正常鼻咽粘膜
20
15∶ 5
42.56
2. 快速原位杂交技术: 组织切片厚5 μm。置于特制的四角贴有薄纸片的载玻片上，将2块同样的载玻片对放，由于四角有小纸片，使得载玻片之间有一小缝隙，各种液体试剂基于毛细虹吸原理自动充填其中。将载玻片放入MicroProbe (美国 Fisher公司)装置中进行下列操作：使用hemolene:二甲苯为3∶1的混合脱蜡液浸洗，110℃ 2次，室温2次；无水乙醇室温浸洗6次；核糖核酸酶溶液(美国 Sigma公司)45℃孵育1 min；胃蛋白酶45℃孵育5 min；甲酰胺溶液45℃孵育2 min；Epstain-Barr病毒(EBV)寡聚核苷酸探针(EBV EBER 1 RNA probe, 5′-CCCTAGCAAAACCTCTAGGGCAGC-3′, 美国Huntsville公司)，45℃孵育约15 min；2×SSC缓冲液浸洗3次；生物素-碱性磷酸酶溶液(美国Biomeda公司)45℃孵育6 min；磷酸酶增强因子(美国Biomeda公司)浸洗1次；显色液 45℃孵育10 min，2次；室温下蒸馏水浸洗1次； 苏木素染色0.5 min；蒸馏水浸洗2次；自动缓冲液浸洗1次；蒸馏水浸洗1次；树胶封片；光学显微镜观察。
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二、结果
1.免疫细胞化学染色：本实验免疫细胞化学染色清晰均匀，标记位置准确，特异性强，没有出现明显的背景染色和人为现象(图1)。整个实验过程从脱蜡到染色结束可在1 h内完成。特殊的载玻片可有效的粘附福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片，不需使用表面粘附剂。一旦组织切片经充分空气干燥后，即可开始脱蜡和免疫细胞化学染色而不需预先加热固位。尽管经过胃蛋白酶消化和多种溶液多次的浸洗过程，组织始终保存完整，不会发生脱片或免疫成分的丢失。与单一使用一种脱蜡剂或使用传统的脱蜡方法相比，本实验使用复合脱蜡剂，明显地缩短了脱蜡时间，同时免疫细胞化学染色信号更强，更均匀，效果满意。
2.EB病毒感染观察：鼻咽癌组织组108例标本中EBV阳性102例(94.5%)，阴性6例(5.5%)。其中Ⅰ型2例均为阴性；Ⅱ型39例阳性(90.7%),4例阴性(9.3%)；Ⅲ型63例均为阳性。阳性者绝大多数为未角化上皮癌(39/102, 38.2%)或未分化癌(63/102, 61.8%)。正常鼻咽粘膜组20例标本均为阴性。
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三、讨论
理想的免疫细胞化学检测方法应具有操作简便、检测快速、通用和简单易学的特点。本文所介绍的快速原位杂交技术具备了这些特点。与其他的检测方法相比，快速原位杂交技术具有以下特点：①可将上述复杂的检测过程在短时间内完成。本法自脱蜡到镜下观察仅需1 h，远远短于其他传统的或同类的方法[2] ；②以往的原位杂交技术如斑点杂交(Southen blot analysis)需要新鲜组织来进行检测[2,3]，而临床上较难同时取到大量的可供实验的NPC标本。如可利用福尔马林固定、石蜡包埋的组织作为标本来源，则可进行样本含量很大的回顾性研究，提高实验结果的科学性和可信性。本实验使用的快速原位杂交技术可以实现这一目的；③检出率较高。在本实验鼻咽癌组织组 108例标本中，EBV阳性102例(94.5%)，Ⅱ型39例阳性，4例阴性；Ⅲ型63例均为阳性。与其他检测方法如包括较敏感的血清中抗EB病毒核抗原-1抗体的检测和PCR法相比，阳性率较高[4]；④用途广泛。除可检测EBV外，还可广泛应用于其他感染性致病原如人类乳头瘤病毒、疱疹病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒、巨细胞病毒、肝炎病毒、呼吸道病毒等，亦可用于细菌性、真菌性和原虫性致病原的检测，并可于疾病早期在细胞病理效应仍未表达出来之前测得致病原，还可鉴别细胞病理效应相同的致病原或鉴别近期感染病毒并在复制病毒的细胞。
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图1 实验免疫细胞化学染色清晰均匀，标记位置准确。×400
参考文献
1，Montone KT, Brigati DJ. In situ molecular pathology: Instrumentation,oligonucleotides,and viral nucleic acid detection. J Histotechnol， 1994，11:253-257.
2，宗永生, 杨伟民，张昌卿，等.用原位杂交技术探讨EB病毒在鼻咽癌发生中的作用.中华病理学杂志. 1993，6:330-332.
3，Akao K，Sato Y, Mukai K, et al.Detection of Epstein-Barr virus DNA in formalin-fixed paraffin-embedded tissue of nasopharyngeal carcinoma using polymerase chain reaction and in situ hybridization. Laryngoscope， 1991， 333:279-281.
4，Vasef MA, Ferlito A, Weiss LM, et al. Nasopharyngeal carcinoma, with emphasis on its relationship to Epstein-Barr virus. Ann Otol Rhinol Laryngol,1997，106:348-352.
(收稿日期：1999-08-23), http://www.100md.com
单位：刘明(518000 广东省 深圳市人民医院耳鼻咽喉科)；朴彰洙(韩国全南大学校病院病理科)
关键词：
中华耳鼻咽喉科杂志000331 快速原位杂交技术是近年来发展起来的新技术。它在原有原位杂交技术的基础上，采用新技术，在1 h内可完成全部检测过程[1]，敏感性高，结果可靠，工作效率大大提高，是鼻咽癌病因学研究的有效手段。本文应用此方法对鼻咽癌标本中和非癌鼻咽粘膜组织中的EBV的表达进行了比较研究。
一、材料和方法
1. 标本:本实验使用的标本均为常规10%中性福尔马林固定、石蜡包埋的组织标本，取自1995年9月～1997年5月深圳市人民医院108例鼻咽癌组织标本和20例正常鼻咽粘膜组织。所有组织标本均经HE染色确诊。鼻咽癌标本组织学诊断按照WHO推荐的分类标准分成Ⅰ型(鳞状细胞癌)、Ⅱ型(未角化细胞癌)和Ⅲ型(未分化癌)。对其中6例HE染色诊断有争议的标本，经抗角蛋白单克隆抗体复染以明确诊断。本组标本中Ⅰ型2例(2/108, 1.9%)，Ⅱ型43例(43/108, 39.8%)，Ⅲ型63例(63/108, 58.3%)。有关标本的临床特征见表1。
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表1 各组标本临床特征 组织来源
标本
数目
性别
(男∶女)
平均
年龄
鼻咽癌Ⅰ型
2
2∶ 0
51.50
Ⅱ型
43
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46∶17
52.33
Ⅲ型
63
33∶10
46.28
正常鼻咽粘膜
20
15∶ 5
42.56
2. 快速原位杂交技术: 组织切片厚5 μm。置于特制的四角贴有薄纸片的载玻片上，将2块同样的载玻片对放，由于四角有小纸片，使得载玻片之间有一小缝隙，各种液体试剂基于毛细虹吸原理自动充填其中。将载玻片放入MicroProbe (美国 Fisher公司)装置中进行下列操作：使用hemolene:二甲苯为3∶1的混合脱蜡液浸洗，110℃ 2次，室温2次；无水乙醇室温浸洗6次；核糖核酸酶溶液(美国 Sigma公司)45℃孵育1 min；胃蛋白酶45℃孵育5 min；甲酰胺溶液45℃孵育2 min；Epstain-Barr病毒(EBV)寡聚核苷酸探针(EBV EBER 1 RNA probe, 5′-CCCTAGCAAAACCTCTAGGGCAGC-3′, 美国Huntsville公司)，45℃孵育约15 min；2×SSC缓冲液浸洗3次；生物素-碱性磷酸酶溶液(美国Biomeda公司)45℃孵育6 min；磷酸酶增强因子(美国Biomeda公司)浸洗1次；显色液 45℃孵育10 min，2次；室温下蒸馏水浸洗1次； 苏木素染色0.5 min；蒸馏水浸洗2次；自动缓冲液浸洗1次；蒸馏水浸洗1次；树胶封片；光学显微镜观察。
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二、结果
1.免疫细胞化学染色：本实验免疫细胞化学染色清晰均匀，标记位置准确，特异性强，没有出现明显的背景染色和人为现象(图1)。整个实验过程从脱蜡到染色结束可在1 h内完成。特殊的载玻片可有效的粘附福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片，不需使用表面粘附剂。一旦组织切片经充分空气干燥后，即可开始脱蜡和免疫细胞化学染色而不需预先加热固位。尽管经过胃蛋白酶消化和多种溶液多次的浸洗过程，组织始终保存完整，不会发生脱片或免疫成分的丢失。与单一使用一种脱蜡剂或使用传统的脱蜡方法相比，本实验使用复合脱蜡剂，明显地缩短了脱蜡时间，同时免疫细胞化学染色信号更强，更均匀，效果满意。
2.EB病毒感染观察：鼻咽癌组织组108例标本中EBV阳性102例(94.5%)，阴性6例(5.5%)。其中Ⅰ型2例均为阴性；Ⅱ型39例阳性(90.7%),4例阴性(9.3%)；Ⅲ型63例均为阳性。阳性者绝大多数为未角化上皮癌(39/102, 38.2%)或未分化癌(63/102, 61.8%)。正常鼻咽粘膜组20例标本均为阴性。
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三、讨论
理想的免疫细胞化学检测方法应具有操作简便、检测快速、通用和简单易学的特点。本文所介绍的快速原位杂交技术具备了这些特点。与其他的检测方法相比，快速原位杂交技术具有以下特点：①可将上述复杂的检测过程在短时间内完成。本法自脱蜡到镜下观察仅需1 h，远远短于其他传统的或同类的方法[2] ；②以往的原位杂交技术如斑点杂交(Southen blot analysis)需要新鲜组织来进行检测[2,3]，而临床上较难同时取到大量的可供实验的NPC标本。如可利用福尔马林固定、石蜡包埋的组织作为标本来源，则可进行样本含量很大的回顾性研究，提高实验结果的科学性和可信性。本实验使用的快速原位杂交技术可以实现这一目的；③检出率较高。在本实验鼻咽癌组织组 108例标本中，EBV阳性102例(94.5%)，Ⅱ型39例阳性，4例阴性；Ⅲ型63例均为阳性。与其他检测方法如包括较敏感的血清中抗EB病毒核抗原-1抗体的检测和PCR法相比，阳性率较高[4]；④用途广泛。除可检测EBV外，还可广泛应用于其他感染性致病原如人类乳头瘤病毒、疱疹病毒、单纯疱疹病毒、腺病毒、巨细胞病毒、肝炎病毒、呼吸道病毒等，亦可用于细菌性、真菌性和原虫性致病原的检测，并可于疾病早期在细胞病理效应仍未表达出来之前测得致病原，还可鉴别细胞病理效应相同的致病原或鉴别近期感染病毒并在复制病毒的细胞。
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图1 实验免疫细胞化学染色清晰均匀，标记位置准确。×400
参考文献
1，Montone KT, Brigati DJ. In situ molecular pathology: Instrumentation,oligonucleotides,and viral nucleic acid detection. J Histotechnol， 1994，11:253-257.
2，宗永生, 杨伟民，张昌卿，等.用原位杂交技术探讨EB病毒在鼻咽癌发生中的作用.中华病理学杂志. 1993，6:330-332.
3，Akao K，Sato Y, Mukai K, et al.Detection of Epstein-Barr virus DNA in formalin-fixed paraffin-embedded tissue of nasopharyngeal carcinoma using polymerase chain reaction and in situ hybridization. Laryngoscope， 1991， 333:279-281.
4，Vasef MA, Ferlito A, Weiss LM, et al. Nasopharyngeal carcinoma, with emphasis on its relationship to Epstein-Barr virus. Ann Otol Rhinol Laryngol,1997，106:348-352.
(收稿日期：1999-08-23), http://www.100md.com