豚鼠内淋巴囊黑色素和酪氨酸酶的分布及其超微结构
作者：钟时勋 刘兆华
单位：
关键词：
中华耳鼻咽喉科杂志000320 有学者观察到人和杂色动物内淋巴囊中分布有数量不等的黑色素[1,2]，但对于其功能意义，目前尚不清楚。我们观察了豚鼠内淋巴囊中黑色素的分布及其超微结构，并探讨了其功能意义。
一、材料与方法
1. 动物分组：健康杂色豚鼠12只，雌雄不拘，体重约300～400 g，耳廓反射灵敏，随机分为A、B2组，每组各6只，分别在光镜和电镜下观察内淋巴囊黑色素(A组)和酪氨酸酶(B组)。
2. 内淋巴囊黑色素的光镜及电镜观察：A组豚鼠腹腔注射戊巴比妥钠40 mg/kg，麻醉后开胸，心内灌注混合固定液2%多聚甲醛+0.1%戊二醛+0.1 mol/L二甲砷酸钠缓冲液(pH 7.4)。断头取出颞骨，双侧耳蜗局部灌注固定液3～5 ml，再浸泡固定24 h(4℃)，剥离出内淋巴囊。光镜组6个内淋巴囊经梯度酒精脱水，常规石蜡包埋，切片(片厚5 μm)。每个内淋巴囊切片均分两组染色：铵银染色和漂白法[3]染色，HE复染。电镜组6个内淋巴囊以1%锇酸后固定，丙酮梯度脱水，环氧树脂618包埋，常规透射电镜超薄切片，双铅染色，JEM-2000EX透射电镜下观察并照相。
, 百拇医药
3. 内淋巴囊酪氨酸酶的光镜及电镜观察：B组动物麻醉、固定方法同前，固定液为2%多聚甲醛+2%戊二醛+0.1 mol/L 二甲砷酸钠缓冲液(pH 7.4)。剥离出双侧内淋巴囊，其中一侧内淋巴囊在0.1% 左旋多巴(L-3，4-Dihydroxyphenylalanine, L-DOPA)液(Sigma公司，美国)中孵育18～24 h(37℃水浴)，对侧内淋巴囊的孵育液中不加L-DOPA作为阴性对照。光镜组3只豚鼠内淋巴囊行常规石蜡包埋、切片，HE复染；电镜组3只豚鼠内淋巴囊以1%锇酸后固定，常规透射电镜超薄切片同前，JEM-2000EX透射电镜下观察并照相。
二、结果
1. 内淋巴囊中黑色素的分布及其超微结构：光镜下豚鼠内淋巴囊上皮及上皮下结缔组织中均可见到黑色颗粒状或成簇分布的黑色素(图1)，高锰酸钾漂白后这些黑色颗粒均消失。透射电镜下，内淋巴囊上皮细胞胞质中可见到处于不同发育期的黑素体，以III、IV期黑素体较多，I期和II期黑素体较少。I期黑素体为球形膜性空泡，电子密度较低，II 期黑素体呈椭圆形，内含纤维样基质及板层结构，III期和IV期黑素体基质致密，内部结构已看不清(图2)。黑素细胞胞体多位于上皮下，部分则位于上皮细胞间隙内。胞体伸出许多树枝状突，分布于上皮细胞间及上皮下结缔组织中。胞质及树枝状突内可见到各期黑素体，其超微结构与上皮细胞内的黑素体相同(图3)。
, 百拇医药
2. 内淋巴囊中酪氨酸酶的分布及其超微结构：光镜下可见内淋巴囊上皮细胞间隙和上皮下结缔组织中均分布有棕黑色的酪氨酸酶反应产物颗粒，但在上皮细胞内未见有酪氨酸酶反应产物(图4)。阴性对照切片的内淋巴囊中未见有酪氨酸酶反应颗粒。透射电镜下，内淋巴囊上皮下黑素细胞中高尔基体分泌面和紧邻的GERL (Golgi-associated endoplasmic reticulum and lysosomal system)囊泡上有酪氨酸酶活性反应产物分布，为电子密度很高的黑色颗粒状沉淀。上皮细胞内未见有酶活性反应产物分布(图5)，阴性对照内淋巴囊的上皮细胞及黑素细胞内均未见有酪氨酸酶反应产物分布。
三、讨论
本研究采用光镜及透射电镜观察显示，杂色豚鼠内淋巴囊上皮细胞中分布有各期黑素体，而黑素细胞则主要分布于上皮下结缔组织中，亦含各期黑素体。上皮细胞与黑素细胞的胞体及树枝状突间紧密相邻，表明二者间存在着密切联系，这或许有利于二者间相互交换物质或细胞信息，但其具体作用机制尚有待于进一步研究。
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黑色素是由酪氨酸酶催化酪氨酸形成多巴，再经一系列化学反应逐步合成的[4]。本实验采用多巴组织化学反应显示，豚鼠内淋巴囊上皮细胞内无酪氨酸酶反应产物，而上皮下黑素细胞内的酪氨酸酶表达呈阳性。电镜下，酶反应产物颗粒分布于黑素细胞内高尔基体分泌面及紧邻的GERL囊泡，而上皮细胞内无酪氨酸酶分布，显示出成熟黑素细胞的黑素合成活动活跃。同时表明，内淋巴囊上皮细胞本身不能合成黑色素，其内的黑色素可能是通过上皮细胞的吞噬作用从上皮下黑素细胞进入上皮细胞的。
图1 肉淋巴囊中黑色颗粒状颁的黑色素(↑)。铵银染色，HE复杂×400
图2 内淋巴囊上皮细胞内各期黑素体成簇聚集。×600
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图3 上皮下黑素细胞内黑素体成簇聚集，细胞树枝状突丰富(↑)。×8000
图4 内淋巴囊上皮下组织内酪氨酸酶反应呈阳性(↑)。多巴染色，HE复杂×400
图5 黑素细胞内高尔基体分泌面和GERL囊泡酪氨酸酶反应呈阳性(↑)上皮细胞内(Ep)酪氨酸酶反应呈阴性 。×12000
参考文献
1，Gussen R. Melanocyte system of the endolymphatic duct and sac. Ann Otol Rhinol Laryngol，1978，87(2Pt1)：175-179.
, 百拇医药
2，Fukazawa K, Sakagami M, Umemoto M, et al. Electron microscopical observations of melanin in the endolymphatic sac. Acta Otolaryngol，1993，Suppl 501：72-75.
3，刘介眉，严庆汉，路英杰. 病理组织染色的理论方法和应用.北京: 人民卫生出版社，1983. 116-121.
4，Sanchez-Ferrer A, Rodriguez-Lopez JN, Garcia-Canovas F,et al. Tyrosinase: a comprehensive review of its mechanism. Biochim Biophys Acta， 1995，1247：1-11.
(收稿日期：1999-10-29), 百拇医药
单位：
关键词：
中华耳鼻咽喉科杂志000320 有学者观察到人和杂色动物内淋巴囊中分布有数量不等的黑色素[1,2]，但对于其功能意义，目前尚不清楚。我们观察了豚鼠内淋巴囊中黑色素的分布及其超微结构，并探讨了其功能意义。
一、材料与方法
1. 动物分组：健康杂色豚鼠12只，雌雄不拘，体重约300～400 g，耳廓反射灵敏，随机分为A、B2组，每组各6只，分别在光镜和电镜下观察内淋巴囊黑色素(A组)和酪氨酸酶(B组)。
2. 内淋巴囊黑色素的光镜及电镜观察：A组豚鼠腹腔注射戊巴比妥钠40 mg/kg，麻醉后开胸，心内灌注混合固定液2%多聚甲醛+0.1%戊二醛+0.1 mol/L二甲砷酸钠缓冲液(pH 7.4)。断头取出颞骨，双侧耳蜗局部灌注固定液3～5 ml，再浸泡固定24 h(4℃)，剥离出内淋巴囊。光镜组6个内淋巴囊经梯度酒精脱水，常规石蜡包埋，切片(片厚5 μm)。每个内淋巴囊切片均分两组染色：铵银染色和漂白法[3]染色，HE复染。电镜组6个内淋巴囊以1%锇酸后固定，丙酮梯度脱水，环氧树脂618包埋，常规透射电镜超薄切片，双铅染色，JEM-2000EX透射电镜下观察并照相。
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3. 内淋巴囊酪氨酸酶的光镜及电镜观察：B组动物麻醉、固定方法同前，固定液为2%多聚甲醛+2%戊二醛+0.1 mol/L 二甲砷酸钠缓冲液(pH 7.4)。剥离出双侧内淋巴囊，其中一侧内淋巴囊在0.1% 左旋多巴(L-3，4-Dihydroxyphenylalanine, L-DOPA)液(Sigma公司，美国)中孵育18～24 h(37℃水浴)，对侧内淋巴囊的孵育液中不加L-DOPA作为阴性对照。光镜组3只豚鼠内淋巴囊行常规石蜡包埋、切片，HE复染；电镜组3只豚鼠内淋巴囊以1%锇酸后固定，常规透射电镜超薄切片同前，JEM-2000EX透射电镜下观察并照相。
二、结果
1. 内淋巴囊中黑色素的分布及其超微结构：光镜下豚鼠内淋巴囊上皮及上皮下结缔组织中均可见到黑色颗粒状或成簇分布的黑色素(图1)，高锰酸钾漂白后这些黑色颗粒均消失。透射电镜下，内淋巴囊上皮细胞胞质中可见到处于不同发育期的黑素体，以III、IV期黑素体较多，I期和II期黑素体较少。I期黑素体为球形膜性空泡，电子密度较低，II 期黑素体呈椭圆形，内含纤维样基质及板层结构，III期和IV期黑素体基质致密，内部结构已看不清(图2)。黑素细胞胞体多位于上皮下，部分则位于上皮细胞间隙内。胞体伸出许多树枝状突，分布于上皮细胞间及上皮下结缔组织中。胞质及树枝状突内可见到各期黑素体，其超微结构与上皮细胞内的黑素体相同(图3)。
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2. 内淋巴囊中酪氨酸酶的分布及其超微结构：光镜下可见内淋巴囊上皮细胞间隙和上皮下结缔组织中均分布有棕黑色的酪氨酸酶反应产物颗粒，但在上皮细胞内未见有酪氨酸酶反应产物(图4)。阴性对照切片的内淋巴囊中未见有酪氨酸酶反应颗粒。透射电镜下，内淋巴囊上皮下黑素细胞中高尔基体分泌面和紧邻的GERL (Golgi-associated endoplasmic reticulum and lysosomal system)囊泡上有酪氨酸酶活性反应产物分布，为电子密度很高的黑色颗粒状沉淀。上皮细胞内未见有酶活性反应产物分布(图5)，阴性对照内淋巴囊的上皮细胞及黑素细胞内均未见有酪氨酸酶反应产物分布。
三、讨论
本研究采用光镜及透射电镜观察显示，杂色豚鼠内淋巴囊上皮细胞中分布有各期黑素体，而黑素细胞则主要分布于上皮下结缔组织中，亦含各期黑素体。上皮细胞与黑素细胞的胞体及树枝状突间紧密相邻，表明二者间存在着密切联系，这或许有利于二者间相互交换物质或细胞信息，但其具体作用机制尚有待于进一步研究。
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黑色素是由酪氨酸酶催化酪氨酸形成多巴，再经一系列化学反应逐步合成的[4]。本实验采用多巴组织化学反应显示，豚鼠内淋巴囊上皮细胞内无酪氨酸酶反应产物，而上皮下黑素细胞内的酪氨酸酶表达呈阳性。电镜下，酶反应产物颗粒分布于黑素细胞内高尔基体分泌面及紧邻的GERL囊泡，而上皮细胞内无酪氨酸酶分布，显示出成熟黑素细胞的黑素合成活动活跃。同时表明，内淋巴囊上皮细胞本身不能合成黑色素，其内的黑色素可能是通过上皮细胞的吞噬作用从上皮下黑素细胞进入上皮细胞的。
图1 肉淋巴囊中黑色颗粒状颁的黑色素(↑)。铵银染色，HE复杂×400
图2 内淋巴囊上皮细胞内各期黑素体成簇聚集。×600
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图3 上皮下黑素细胞内黑素体成簇聚集，细胞树枝状突丰富(↑)。×8000
图4 内淋巴囊上皮下组织内酪氨酸酶反应呈阳性(↑)。多巴染色，HE复杂×400
图5 黑素细胞内高尔基体分泌面和GERL囊泡酪氨酸酶反应呈阳性(↑)上皮细胞内(Ep)酪氨酸酶反应呈阴性 。×12000
参考文献
1，Gussen R. Melanocyte system of the endolymphatic duct and sac. Ann Otol Rhinol Laryngol，1978，87(2Pt1)：175-179.
, 百拇医药
2，Fukazawa K, Sakagami M, Umemoto M, et al. Electron microscopical observations of melanin in the endolymphatic sac. Acta Otolaryngol，1993，Suppl 501：72-75.
3，刘介眉，严庆汉，路英杰. 病理组织染色的理论方法和应用.北京: 人民卫生出版社，1983. 116-121.
4，Sanchez-Ferrer A, Rodriguez-Lopez JN, Garcia-Canovas F,et al. Tyrosinase: a comprehensive review of its mechanism. Biochim Biophys Acta， 1995，1247：1-11.
(收稿日期：1999-10-29), 百拇医药