中耳细菌感染对内耳及机体免疫功能长期影响的实验观察
作者：邹静 毕爱芳 杨伟炎 周永清 丁卫东 郝晓东
单位：邹静 毕爱芳 周永清(050082 石家庄 白求恩国际和平医院耳鼻咽喉科 全军耳鼻咽喉疾病中心)；丁卫东 郝晓东(050082 石家庄 白求恩国际和平医院临床实验科)；杨伟炎(解放军总医院耳鼻咽喉科解放军耳鼻咽喉科研究所)
关键词：中耳炎；细菌感染；迷路；热休克蛋白质类
中华耳鼻咽喉科杂志000310 【摘要】 目的 探讨中耳细菌感染后内耳热休克反应是否会长期存在，及其对内耳功能的潜在影响。方法 60只BALB/c鼠随机分为肺炎克雷白杆菌、金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)、绿脓杆菌、大肠杆菌、变形杆菌和生理盐水对照6个组，每组10只。中耳注射致病菌135 d后测试畸变产物耳声发射并取材进行光镜与电镜观察，检测内耳热休克蛋白(heat shock protein，HSP)70相关表位分子的表达，行单个核细胞核因子κ Bp65和抗肺炎克雷白杆菌抗体、抗膜迷路蛋白抗体的测试。结果 所有标本核因子κ Bp65未发生明显核内转移。金葡菌感染组3只、肺炎克雷白杆菌组和变形杆菌组2只、绿脓杆菌组3只以及对照组1只动物的抗肺炎克雷白杆菌抗体阳性。经外加电场固定液相分子快速斑点免疫分析筛选，金葡菌感染组2只、肺炎克雷白杆菌组2只、绿脓杆菌组和生理盐水对照组各1只抗膜迷路蛋白抗体阳性，其中金葡菌组和肺炎克雷白杆菌组抗膜迷路蛋白和抗肺炎克雷白杆菌双阳性。经免疫转印分析，其阳性条带除1例相对分子质量为68 000以外，其余均为小分子，以26 000～30 000为主，38 000～41 000次之，46 000～50 000有微弱反应。除变形杆菌组右耳和绿脓杆菌组左耳1 625 Hz畸变产物耳声发射检测显著异常外，其余各组各频率均无显著变化。所有动物内耳光镜及电镜观察无异常发现，未见HSP70表达。结论 中耳细菌感染后，内耳无长期存在的与HSP70相关的热休克蛋白反应，内耳免疫损伤是多因素作用的结果。
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An observation on long-term influence of middle ear bacterial infection on inner ear function and systemic immune reaction
ZOU Jing，BI Aifang，Yang Weiyan
(Bethune International Peace Hospital，Shijiazhuang 050082, China)
【Abstract】 Objective To understand whether long-term inner ear heat shock response related to heat shock protein(HSP70) caused by middle ear bacterial infection and the potential influence on inner ear function. Methods Sixty BALB/c mice were randomly classified into 6 groups including Klebsiella pneumoniae(KP), Staphylococcus aureus, Bacillus pyocyaneus, Bacillus coli, Bacillus proteus and physiological saline control groups. On 135 days after injection, distortion product otoacoustic emissions(DPOAE) was tested and all the samples were collected, which were examined with light and electronic microscopes. HSP70 related molecule expression in inner ear, nuclear factor (NF)κ Bp65 characterization in mononuclear cell, anti-KP antibody and anti-membranous labyrinth proteins (MLP) were examined. Results No nuclear transfer of NF κ Bp65 was observed in any animal. Anti- KP antibody was detected in 30% (3/10) of Staphylococcus aureus group, 29% (2/7) of KP group, 33% (3/9) of Bacillus pyocyaneus group and 10% (1/10) of control group. Anti-MLP antibody was created in 20% (2/10) of Staphylococcus aureus group, 20% (2/10) of KP group, one each in Bacillus pyocyaneus group and control group respectively. Double positive antibody against KP and MLP were found in Staphylococcus aureus group and KP group. When analyzed with Western blot, all the positive bands were small molecules including strongest 26 000～30 000,medium degree 38 000～41 000 and weak 46 000～50 000 except for 68 000 in one case. There was only one significant DPOAE amplification decrease at 1 625 Hz (2f1-f2) in left ear of Bacillus pyocyaneus group and right ear of Bacillus proteus group. No abnormal phenomenon was found in inner ear both under light microscope and electronic microscope. No significant expression of HSP70 was observed in inner ears. Conclusion No long-term heat shock response related to HSP70 existed in the inner ear and the immune inner ear damage may be caused by multiplefactors.
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【Key words】 Otitis media； Bacterial infections； Labyrinth； Heat-shok proteins
1990年Harris等[1]，用免疫转印方法测试双侧进行性感音神经性聋患者血清，可以与牛内耳提取物中相对分子质量为68 000的抗原发生反应。我们[2]观察到拟诊为自身免疫性感音神经性聋患者血清可以与豚鼠内耳提取物中多种抗原发生反应，包括分子量接近68 000的抗原。Billings等[3]报道，用离子交换和三磷酸腺苷纯化的该抗原可以和抗热休克蛋白(heat shock protein，HSP)70单克隆抗体反应，从而将该抗原与HSP70联系起来，认为该抗体即为抗HSP70抗体，并由此提出自身免疫性内耳病患者可能因曾患化脓性中耳炎,细菌HSP经圆窗膜进入内耳诱导机体产生抗HSP抗体，导致一系列内耳损伤。Bloch等[4,5]观察到双侧进行性感音神经性聋和梅尼埃病患者血清可以与重组的人和牛HSP70的C末端区427-461氨基酸片段反应，由此推测该表位可能是重要的病原。 我们[6]曾经通过动物模型观察到中耳急性细菌感染后可以诱导内耳HSP70相关表位分子的表达，以小分子为主。如果中耳细菌感染诱发的内耳热休克反应在内耳免疫损伤中起着重要作用的话，至少必须具备以下条件：即中耳细菌感染后机体持续产生抗HSP70抗体，且内耳持续高表达HSP70相关表位分子。我们分别用金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)、变形杆菌、肺炎克雷白杆菌、大肠杆菌和绿脓杆菌感染BALB/c鼠，观察其对机体全身及内耳局部产生的长期影响。
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材料与方法
一、材料
1.动物：一级BALB/c鼠80只，体重25～28 g，雌雄不拘；二级杂色豚鼠20只，体重300～400 g，雌雄不拘。以上动物均购自中国药品生物制品检定所实验动物繁育场(北京)。
2.致病菌：绿脓杆菌(产品号ATCC-27853)、变形杆菌(ATCC-49027)、大肠杆菌(ATCC-25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC-25923)、肺炎克雷白杆菌(ATCC-26114-7)均购自中国生物制品鉴定所(北京)。
3.试剂：HRP-羊抗鼠IgG和HRP-羊抗兔IgG为进口分装，兔抗核因子κ B(p65)多克隆抗体、鼠抗哺乳类HSP70和鼠抗成纤维细胞生长因子受体单克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品(SC-1060)，SP试剂盒为美国Zymed公司产品。
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4.主要仪器： 77000X Easy-TiterTM ELIFA System为美国Pierce公司生产，将其改造后用于进行外加电场固定液相分子快速斑点免疫(以下简称快速斑点免疫)分析，详细情况见另文报道。
二、方法
1.实验设计与动物分组：所有动物均经畸变产物耳声发射筛选，引出正常反应者饲养1周后实验。将合格的18只豚鼠按文献[6]报道方法制备膜迷路蛋白。将合格的60只BALB/c鼠随机分为6组，即肺炎克雷白杆菌组、金葡菌组、绿脓杆菌组、大肠杆菌组、变形杆菌组和生理盐水对照组，每组10只。
2.中耳感染模型建立：细菌培养及中耳感染模型的建立见文献[6]。注射致病菌后的动物在层流架上分笼饲养，观察135 d后取材。
3.畸变产物耳声发射测试：乙醚麻醉动物，在标准隔声室进行测试，分别于注射细菌前和处死动物前各测试1次。F1频率选取2 000、2 500、3 187、4 000、5 062、6 375 Hz，刺激声压级为65 dB SPL，F2频率为1.2倍F1，刺激声压级为55 dB SPL。计算各频率2F1-F2 DP振幅前后差值进行统计分析。
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4.普通病理与电镜观察：用戊巴比妥钠腹腔注射(44 mg/kg)麻醉，心脏穿刺采血，分离单个核细胞及血浆。透射电镜组每组2只动物快速断头取双侧颞骨后刺破圆窗、卵圆窗，蜗尖钻孔用2.5%戊二醛固定(4℃)，10% 乙二胺四乙酸脱钙，锇酸后固定，常规树脂包埋、超薄切 buffer saline,PBS)洗涤，甲醇双氧水室温孵育20 min。PBS洗涤，1∶20正常羊血清室温孵育30 min，1∶100兔抗核因子κ B(p65)抗体37℃孵育30 min。PBS洗涤，1∶100羊抗兔IgG同上孵育。PBS洗涤，二氨基联苯胺(diaminobenzidine tetrahydrochloride,DAB)显色。
7.抗肺炎克雷白杆菌抗体测试：用本实验室保存的应激后的肺炎克雷白杆菌抗原进行测试[6]。浓度为4.0 mg/ml，用快速斑点免疫分析检测鼠血中抗肺炎克雷白杆菌抗体，即先通过外加电场在10 min内将粗制细菌抗原快速吸附于硝酸纤维素膜，用含吐温20的PBS洗涤5 min，用含正常羊血清的1% BSA牛血清白蛋白封闭5 min，各孔加入1∶10稀释的待测鼠血浆50 μL，设空白对照，37℃摇浴10 min。取出硝酸纤维素膜，在PBS-吐温中高速摇洗2次，加入1∶1 000 HRP-羊抗鼠IgG，37℃高速摇浴10 min，同上摇洗2次，DAB显色(高速摇浴10 min)。
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8.抗膜迷路蛋白抗体的测试：快速斑点免疫方法筛选用0.9 mg/ml粗制豚鼠膜迷路蛋白为抗原，同上在电场作用下吸附于硝酸纤维素膜，并用1∶10待测鼠血浆进行免疫分析。阳性血浆再进行免疫转印分析，血浆稀释倍数仍为1∶10，按照我们先前报道[7]的改良免疫转印方法进行测试。用Eagle Eye TMⅡ型电泳图像分析系统测试相对分子质量。
结果
大肠杆菌组10只动物于注射后80 d全部死亡，经心脏取血培养证实均为变形杆菌感染所致[8]。绿脓杆菌组死亡1只，变形杆菌组和肺炎克雷白杆菌组各3只死亡，原因未调查。
一、核因子κ B(p65)测试结果
所有标本核因子κ B(p65)阳性着色均位于细胞浆，胞核无明显着色。表明核因子κ B(p65)未发生明显核内转移。
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二、抗体测试结果
1.抗肺炎克雷白杆菌抗体：金葡菌感染组3只、肺炎克雷白杆菌组2只、绿脓杆菌组3只、变形杆菌组2只、生理盐水对照组1只抗体阳性。
2.抗膜迷路蛋白抗体：经快速斑点免疫筛选，抗膜迷路蛋白抗体阳性者，金葡菌感染组2只，肺炎克雷白杆菌组2只，绿脓杆菌组和生理盐水对照组各1只。其中金葡菌组和肺炎克雷白杆菌组为抗膜迷路蛋白和抗肺炎克雷白杆菌双阳性。经免疫转印分析(图1)，其阳性条带相对分子质量除1例为68 000以外，其余均为小分子，以26 000～30 000为主，38 000～41 000次之，46 000～50 000有微弱反应。1例金葡菌感染动物在40 000处为强阳性反应。
三、畸变产物耳声发射测试结果
首先根据生理盐水对照组计算各频率DP振幅变化值，通过t检验计算总体均数的95%可信区间，实验组动物DP振幅降低超过其下限者为异常。再计算各组动物各频率DP振幅变化异常的百分率。除变形杆菌组右耳和绿脓杆菌组左耳1 625 Hz显著异常外，其余各组各频率均无显著变化。所有抗膜迷路蛋白抗体阳性的动物均存在部分频率DP振幅显著下降，其中，2 000 Hz和4 062 Hz各1耳，2 562 Hz和5 125 Hz 各3耳，3 187 Hz 2耳。
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四、组织病理学结果
光镜下见畸变产物耳声发射异常的实验动物中耳粘膜上皮细胞损伤，粘膜下有少许炎细胞浸润。但是，内耳未见任何炎性渗出及炎细胞浸润。螺旋神经节细胞、血管纹及Corti器细胞无任何水肿或萎缩。电镜下见各组动物螺旋神经节细胞、血管纹及基底膜均无明显变化。
五、内耳热休克蛋白表达
抗体阴性对照标本除毛细血管处有棕色颗粒外，其它各处均无阳性着色，抗成纤维细胞生长因子抗体阳性对照标本存在广泛的阳性着色，尤其是Corti器和螺旋神经节细胞有高水平表达。所有动物内耳除毛细血管处有棕色颗粒外(与阴性对照相同)，其它各部位均无HSP70表达(图2～5)，粘膜有炎细胞浸润的动物中耳粘膜HSP70阳性(图5)。
讨论
本组实验用多种化脓性中耳炎常见致病菌注射BALB/c鼠，部分动物听力障碍并伴有粘膜损伤及HSP70相关分子表达升高，内耳颞骨普通病理和超微病理均无显著异常。说明本组动物听力障碍由中耳粘膜炎症引起，而并非内耳损伤所致，可见单纯细菌感染诱导内耳免疫损伤的机率不高。按照Billings等[3]的推论，如果自身免疫性内耳病患者的主要病因为化脓性中耳炎诱导的热休克反应，则至少用中耳炎常见致病菌注射中耳后应该诱导出持续高水平的抗细菌抗体及抗内耳抗体，且注射后动物内耳应出现HSP70高水平表达。本组实验中，包括生理盐水对照组在内的各组动物均有部分产生了抗肺炎克雷白杆菌抗体和抗内耳抗体，可见该抗体的出现与中耳感染无相关性，反而证明该细菌感染的普遍性。我们过去的研究[6]发现抗正常豚鼠膜迷路蛋白抗体可识别肺炎克雷白杆菌抗原，本组结果进一步证实抗肺炎克雷白杆菌抗体可以识别正常状态膜迷路蛋白。说明肺炎克雷白杆菌与膜迷路蛋白之间有共同表位，为内耳免疫损伤的分子模拟机制提供了参考；或者细菌的某种超抗原发挥了作用，使机体淋巴细胞克隆被广泛激活，产生了能够识别膜迷路蛋白的抗体。虽然在本实验中抗膜迷路蛋白抗体阳性的动物均有部分频率畸变产物耳声发射异常，但是，其听力障碍并非内耳免疫损伤所致。因此，循环中的抗体如何穿过血迷路屏障到达内耳是产生免疫损伤的关键。
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在免疫反应过程中，核因子κB(p65)被激活从而发生核内转移，使淋巴细胞增殖。但在本实验中未观察到该核内转移现象，表明此时并非免疫反应活动期。我们过去的实验[6]观察到实验性中耳细菌感染的急性期，内耳血管纹、Corti器毛细胞高表达HSP70相关表位分子。然而，本组实验发现中耳细菌感染后内耳及螺旋神经节均无HSP70相关表位分子长期表达。表明单纯中耳炎不足以引起免疫介导的内耳损伤，即使抗HSP70抗体已经进入内耳也不能发挥作用。为了确定抗HSP70 抗体能否导致耳蜗功能障碍，Trune等[9]通过腹腔内长期注射牛HSP70(10 μg)免疫BALB/c鼠和CBA/J鼠，注射期间ABR 阈值在4、8、16和32 kHz频率均无变化，血清中的循环免疫复合物和抗核抗体也无增加，实验结果不支持抗HSP70抗体升高是自身免疫性内耳病主要病因的理论。Lim等[10]发现噪声暴露组动物在相对分子质量72 000处有强阳性带，而无噪声暴露的对照动物该处条带很弱。免疫组化显示噪声诱导的HSP72表达主要位于外毛细胞，仅少部分内毛细胞和螺旋神经节细胞表达，由此推测, HSP72可能作为细胞应急的标志并有潜在的损伤及保护作用。Myers等[11]观察了单侧耳蜗缺血和再灌流以后不同时期大鼠外周听觉系统HSP72的变化情况发现，全耳蜗匀浆的免疫转印分析在耳蜗缺血后5 min即表达HSP72，耳蜗免疫组化在缺血10 min可显示，缺血后2 h开始至6 h表达明显，12 h下降至正常水平。在上述情况下HSP70抗体能否诱导自身免疫性内耳损伤有待进一步研究。
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图1 小鼠阳性血清识别豚鼠膜迷路蛋白 的相对分子质量。1，6为肺炎克雷白杆菌组；2，4为金葡菌组；3，5为生理盐水组；8为绿脓杆菌组；8为空白对照
图2 中耳细菌感染小鼠耳蜗HSP70相关表位分子表达。螺旋神经节，Corti器等处均无阳性着色，血管纹处为非特异着色。SP法×100
图3 中耳细菌感染小鼠Corti器HSP70相关表位分子表达。Corti器内外毛细胞，支持细胞，基底膜及盖膜等处均无阳性着色，毛细血管处为非特异着色。SP法×400
图4 中耳细菌感染小鼠螺旋神经节HSP70相关表位分子表达。除曙旋神经节内毛细血管处散在非特异着色外，螺旋神经节细胞无任何阳性着色。SP法×400
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图5 中耳细菌感染小鼠中耳粘膜HSP70相关表位分子表达。粘膜全层有HSP70相关表位分子强阳性表达。SP法×400
通信作者：邹静(Email：zouj@126.com)
参考文献
1，Harris JP,Sharp PA. Inner ear autoantibodies in patients with rapidly progressive sensorineural hearing loss. Laryngoscope, 1990,100:516-524.
2，邹静,姜泗长,顾瑞, 等. 自身免疫感音神经性聋血清抗膜迷路蛋白抗体的检测. 中华耳鼻咽喉科杂志,1995,30:154-156.
3，Billings PB,Keithley EM,Harris JP. Evidence linking the 68 kilodalton antigen identified in progressive sensorineural hearing loss patient sera with heat shock protein 70. Ann Otol Rhinol Laryngol, 1995,104:181-188.
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4，Bloch DB,San Martin JE,Rauch SD,et al. Serum antibodies to heat shock protein 70 in sensorineural hearing loss. Arch Otolaryngol Head Neck Surg, 1995,121:1167-1171.
5，Bloch DB,Gutierrez JA,Guerriero V Jr,et al. Recognition of a dominant epitope in bovine heat-shock protein 70 in inner ear disease. Laryngoscope,1999,109:621-625.
6，邹静,姜泗长,周永清, 等. 实验性中耳细菌感染诱发的热休克反应. 中华耳鼻咽喉科杂志,1998,33:282-284.
, 百拇医药 7，邹静,翟所强,姜泗长, 等. 豚鼠膜迷路蛋白抗原性分析. 中华耳鼻咽喉科杂志,1995,30:13.
8，毕爱芳,邹静,周永清, 等. 变形杆菌引起实验小鼠菌血症成批死亡报告. 实验动物科学与管理, 1999,16:27-29.
9，Trune DR, Kempton JB, Mitchell CR, et al. Failure of elevated heat shock protein 70 antibodies to alter cochlear function in mice. Hear Res,1998,116:65-70.
10，Lim HH, Jenkins OH, Myers MW, et al. Detection of HSP 72 synthesis after acoustic overstimulation in rat cochlea. Hear Res,1993,69:146-150.
11，Myers MW, Quirk WS, Rizk SS, et al. Expression of the major mammalian stress protein in the rat cochlea following transient ischemia. Laryngoscope,1992,102:981-987.
(收稿日期：1999-10-18), 百拇医药
单位：邹静 毕爱芳 周永清(050082 石家庄 白求恩国际和平医院耳鼻咽喉科 全军耳鼻咽喉疾病中心)；丁卫东 郝晓东(050082 石家庄 白求恩国际和平医院临床实验科)；杨伟炎(解放军总医院耳鼻咽喉科解放军耳鼻咽喉科研究所)
关键词：中耳炎；细菌感染；迷路；热休克蛋白质类
中华耳鼻咽喉科杂志000310 【摘要】 目的 探讨中耳细菌感染后内耳热休克反应是否会长期存在，及其对内耳功能的潜在影响。方法 60只BALB/c鼠随机分为肺炎克雷白杆菌、金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)、绿脓杆菌、大肠杆菌、变形杆菌和生理盐水对照6个组，每组10只。中耳注射致病菌135 d后测试畸变产物耳声发射并取材进行光镜与电镜观察，检测内耳热休克蛋白(heat shock protein，HSP)70相关表位分子的表达，行单个核细胞核因子κ Bp65和抗肺炎克雷白杆菌抗体、抗膜迷路蛋白抗体的测试。结果 所有标本核因子κ Bp65未发生明显核内转移。金葡菌感染组3只、肺炎克雷白杆菌组和变形杆菌组2只、绿脓杆菌组3只以及对照组1只动物的抗肺炎克雷白杆菌抗体阳性。经外加电场固定液相分子快速斑点免疫分析筛选，金葡菌感染组2只、肺炎克雷白杆菌组2只、绿脓杆菌组和生理盐水对照组各1只抗膜迷路蛋白抗体阳性，其中金葡菌组和肺炎克雷白杆菌组抗膜迷路蛋白和抗肺炎克雷白杆菌双阳性。经免疫转印分析，其阳性条带除1例相对分子质量为68 000以外，其余均为小分子，以26 000～30 000为主，38 000～41 000次之，46 000～50 000有微弱反应。除变形杆菌组右耳和绿脓杆菌组左耳1 625 Hz畸变产物耳声发射检测显著异常外，其余各组各频率均无显著变化。所有动物内耳光镜及电镜观察无异常发现，未见HSP70表达。结论 中耳细菌感染后，内耳无长期存在的与HSP70相关的热休克蛋白反应，内耳免疫损伤是多因素作用的结果。
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An observation on long-term influence of middle ear bacterial infection on inner ear function and systemic immune reaction
ZOU Jing，BI Aifang，Yang Weiyan
(Bethune International Peace Hospital，Shijiazhuang 050082, China)
【Abstract】 Objective To understand whether long-term inner ear heat shock response related to heat shock protein(HSP70) caused by middle ear bacterial infection and the potential influence on inner ear function. Methods Sixty BALB/c mice were randomly classified into 6 groups including Klebsiella pneumoniae(KP), Staphylococcus aureus, Bacillus pyocyaneus, Bacillus coli, Bacillus proteus and physiological saline control groups. On 135 days after injection, distortion product otoacoustic emissions(DPOAE) was tested and all the samples were collected, which were examined with light and electronic microscopes. HSP70 related molecule expression in inner ear, nuclear factor (NF)κ Bp65 characterization in mononuclear cell, anti-KP antibody and anti-membranous labyrinth proteins (MLP) were examined. Results No nuclear transfer of NF κ Bp65 was observed in any animal. Anti- KP antibody was detected in 30% (3/10) of Staphylococcus aureus group, 29% (2/7) of KP group, 33% (3/9) of Bacillus pyocyaneus group and 10% (1/10) of control group. Anti-MLP antibody was created in 20% (2/10) of Staphylococcus aureus group, 20% (2/10) of KP group, one each in Bacillus pyocyaneus group and control group respectively. Double positive antibody against KP and MLP were found in Staphylococcus aureus group and KP group. When analyzed with Western blot, all the positive bands were small molecules including strongest 26 000～30 000,medium degree 38 000～41 000 and weak 46 000～50 000 except for 68 000 in one case. There was only one significant DPOAE amplification decrease at 1 625 Hz (2f1-f2) in left ear of Bacillus pyocyaneus group and right ear of Bacillus proteus group. No abnormal phenomenon was found in inner ear both under light microscope and electronic microscope. No significant expression of HSP70 was observed in inner ears. Conclusion No long-term heat shock response related to HSP70 existed in the inner ear and the immune inner ear damage may be caused by multiplefactors.
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【Key words】 Otitis media； Bacterial infections； Labyrinth； Heat-shok proteins
1990年Harris等[1]，用免疫转印方法测试双侧进行性感音神经性聋患者血清，可以与牛内耳提取物中相对分子质量为68 000的抗原发生反应。我们[2]观察到拟诊为自身免疫性感音神经性聋患者血清可以与豚鼠内耳提取物中多种抗原发生反应，包括分子量接近68 000的抗原。Billings等[3]报道，用离子交换和三磷酸腺苷纯化的该抗原可以和抗热休克蛋白(heat shock protein，HSP)70单克隆抗体反应，从而将该抗原与HSP70联系起来，认为该抗体即为抗HSP70抗体，并由此提出自身免疫性内耳病患者可能因曾患化脓性中耳炎,细菌HSP经圆窗膜进入内耳诱导机体产生抗HSP抗体，导致一系列内耳损伤。Bloch等[4,5]观察到双侧进行性感音神经性聋和梅尼埃病患者血清可以与重组的人和牛HSP70的C末端区427-461氨基酸片段反应，由此推测该表位可能是重要的病原。 我们[6]曾经通过动物模型观察到中耳急性细菌感染后可以诱导内耳HSP70相关表位分子的表达，以小分子为主。如果中耳细菌感染诱发的内耳热休克反应在内耳免疫损伤中起着重要作用的话，至少必须具备以下条件：即中耳细菌感染后机体持续产生抗HSP70抗体，且内耳持续高表达HSP70相关表位分子。我们分别用金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)、变形杆菌、肺炎克雷白杆菌、大肠杆菌和绿脓杆菌感染BALB/c鼠，观察其对机体全身及内耳局部产生的长期影响。
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材料与方法
一、材料
1.动物：一级BALB/c鼠80只，体重25～28 g，雌雄不拘；二级杂色豚鼠20只，体重300～400 g，雌雄不拘。以上动物均购自中国药品生物制品检定所实验动物繁育场(北京)。
2.致病菌：绿脓杆菌(产品号ATCC-27853)、变形杆菌(ATCC-49027)、大肠杆菌(ATCC-25922)、金黄色葡萄球菌(ATCC-25923)、肺炎克雷白杆菌(ATCC-26114-7)均购自中国生物制品鉴定所(北京)。
3.试剂：HRP-羊抗鼠IgG和HRP-羊抗兔IgG为进口分装，兔抗核因子κ B(p65)多克隆抗体、鼠抗哺乳类HSP70和鼠抗成纤维细胞生长因子受体单克隆抗体为美国Santa Cruz公司产品(SC-1060)，SP试剂盒为美国Zymed公司产品。
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4.主要仪器： 77000X Easy-TiterTM ELIFA System为美国Pierce公司生产，将其改造后用于进行外加电场固定液相分子快速斑点免疫(以下简称快速斑点免疫)分析，详细情况见另文报道。
二、方法
1.实验设计与动物分组：所有动物均经畸变产物耳声发射筛选，引出正常反应者饲养1周后实验。将合格的18只豚鼠按文献[6]报道方法制备膜迷路蛋白。将合格的60只BALB/c鼠随机分为6组，即肺炎克雷白杆菌组、金葡菌组、绿脓杆菌组、大肠杆菌组、变形杆菌组和生理盐水对照组，每组10只。
2.中耳感染模型建立：细菌培养及中耳感染模型的建立见文献[6]。注射致病菌后的动物在层流架上分笼饲养，观察135 d后取材。
3.畸变产物耳声发射测试：乙醚麻醉动物，在标准隔声室进行测试，分别于注射细菌前和处死动物前各测试1次。F1频率选取2 000、2 500、3 187、4 000、5 062、6 375 Hz，刺激声压级为65 dB SPL，F2频率为1.2倍F1，刺激声压级为55 dB SPL。计算各频率2F1-F2 DP振幅前后差值进行统计分析。
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4.普通病理与电镜观察：用戊巴比妥钠腹腔注射(44 mg/kg)麻醉，心脏穿刺采血，分离单个核细胞及血浆。透射电镜组每组2只动物快速断头取双侧颞骨后刺破圆窗、卵圆窗，蜗尖钻孔用2.5%戊二醛固定(4℃)，10% 乙二胺四乙酸脱钙，锇酸后固定，常规树脂包埋、超薄切 buffer saline,PBS)洗涤，甲醇双氧水室温孵育20 min。PBS洗涤，1∶20正常羊血清室温孵育30 min，1∶100兔抗核因子κ B(p65)抗体37℃孵育30 min。PBS洗涤，1∶100羊抗兔IgG同上孵育。PBS洗涤，二氨基联苯胺(diaminobenzidine tetrahydrochloride,DAB)显色。
7.抗肺炎克雷白杆菌抗体测试：用本实验室保存的应激后的肺炎克雷白杆菌抗原进行测试[6]。浓度为4.0 mg/ml，用快速斑点免疫分析检测鼠血中抗肺炎克雷白杆菌抗体，即先通过外加电场在10 min内将粗制细菌抗原快速吸附于硝酸纤维素膜，用含吐温20的PBS洗涤5 min，用含正常羊血清的1% BSA牛血清白蛋白封闭5 min，各孔加入1∶10稀释的待测鼠血浆50 μL，设空白对照，37℃摇浴10 min。取出硝酸纤维素膜，在PBS-吐温中高速摇洗2次，加入1∶1 000 HRP-羊抗鼠IgG，37℃高速摇浴10 min，同上摇洗2次，DAB显色(高速摇浴10 min)。
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8.抗膜迷路蛋白抗体的测试：快速斑点免疫方法筛选用0.9 mg/ml粗制豚鼠膜迷路蛋白为抗原，同上在电场作用下吸附于硝酸纤维素膜，并用1∶10待测鼠血浆进行免疫分析。阳性血浆再进行免疫转印分析，血浆稀释倍数仍为1∶10，按照我们先前报道[7]的改良免疫转印方法进行测试。用Eagle Eye TMⅡ型电泳图像分析系统测试相对分子质量。
结果
大肠杆菌组10只动物于注射后80 d全部死亡，经心脏取血培养证实均为变形杆菌感染所致[8]。绿脓杆菌组死亡1只，变形杆菌组和肺炎克雷白杆菌组各3只死亡，原因未调查。
一、核因子κ B(p65)测试结果
所有标本核因子κ B(p65)阳性着色均位于细胞浆，胞核无明显着色。表明核因子κ B(p65)未发生明显核内转移。
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二、抗体测试结果
1.抗肺炎克雷白杆菌抗体：金葡菌感染组3只、肺炎克雷白杆菌组2只、绿脓杆菌组3只、变形杆菌组2只、生理盐水对照组1只抗体阳性。
2.抗膜迷路蛋白抗体：经快速斑点免疫筛选，抗膜迷路蛋白抗体阳性者，金葡菌感染组2只，肺炎克雷白杆菌组2只，绿脓杆菌组和生理盐水对照组各1只。其中金葡菌组和肺炎克雷白杆菌组为抗膜迷路蛋白和抗肺炎克雷白杆菌双阳性。经免疫转印分析(图1)，其阳性条带相对分子质量除1例为68 000以外，其余均为小分子，以26 000～30 000为主，38 000～41 000次之，46 000～50 000有微弱反应。1例金葡菌感染动物在40 000处为强阳性反应。
三、畸变产物耳声发射测试结果
首先根据生理盐水对照组计算各频率DP振幅变化值，通过t检验计算总体均数的95%可信区间，实验组动物DP振幅降低超过其下限者为异常。再计算各组动物各频率DP振幅变化异常的百分率。除变形杆菌组右耳和绿脓杆菌组左耳1 625 Hz显著异常外，其余各组各频率均无显著变化。所有抗膜迷路蛋白抗体阳性的动物均存在部分频率DP振幅显著下降，其中，2 000 Hz和4 062 Hz各1耳，2 562 Hz和5 125 Hz 各3耳，3 187 Hz 2耳。
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四、组织病理学结果
光镜下见畸变产物耳声发射异常的实验动物中耳粘膜上皮细胞损伤，粘膜下有少许炎细胞浸润。但是，内耳未见任何炎性渗出及炎细胞浸润。螺旋神经节细胞、血管纹及Corti器细胞无任何水肿或萎缩。电镜下见各组动物螺旋神经节细胞、血管纹及基底膜均无明显变化。
五、内耳热休克蛋白表达
抗体阴性对照标本除毛细血管处有棕色颗粒外，其它各处均无阳性着色，抗成纤维细胞生长因子抗体阳性对照标本存在广泛的阳性着色，尤其是Corti器和螺旋神经节细胞有高水平表达。所有动物内耳除毛细血管处有棕色颗粒外(与阴性对照相同)，其它各部位均无HSP70表达(图2～5)，粘膜有炎细胞浸润的动物中耳粘膜HSP70阳性(图5)。
讨论
本组实验用多种化脓性中耳炎常见致病菌注射BALB/c鼠，部分动物听力障碍并伴有粘膜损伤及HSP70相关分子表达升高，内耳颞骨普通病理和超微病理均无显著异常。说明本组动物听力障碍由中耳粘膜炎症引起，而并非内耳损伤所致，可见单纯细菌感染诱导内耳免疫损伤的机率不高。按照Billings等[3]的推论，如果自身免疫性内耳病患者的主要病因为化脓性中耳炎诱导的热休克反应，则至少用中耳炎常见致病菌注射中耳后应该诱导出持续高水平的抗细菌抗体及抗内耳抗体，且注射后动物内耳应出现HSP70高水平表达。本组实验中，包括生理盐水对照组在内的各组动物均有部分产生了抗肺炎克雷白杆菌抗体和抗内耳抗体，可见该抗体的出现与中耳感染无相关性，反而证明该细菌感染的普遍性。我们过去的研究[6]发现抗正常豚鼠膜迷路蛋白抗体可识别肺炎克雷白杆菌抗原，本组结果进一步证实抗肺炎克雷白杆菌抗体可以识别正常状态膜迷路蛋白。说明肺炎克雷白杆菌与膜迷路蛋白之间有共同表位，为内耳免疫损伤的分子模拟机制提供了参考；或者细菌的某种超抗原发挥了作用，使机体淋巴细胞克隆被广泛激活，产生了能够识别膜迷路蛋白的抗体。虽然在本实验中抗膜迷路蛋白抗体阳性的动物均有部分频率畸变产物耳声发射异常，但是，其听力障碍并非内耳免疫损伤所致。因此，循环中的抗体如何穿过血迷路屏障到达内耳是产生免疫损伤的关键。
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在免疫反应过程中，核因子κB(p65)被激活从而发生核内转移，使淋巴细胞增殖。但在本实验中未观察到该核内转移现象，表明此时并非免疫反应活动期。我们过去的实验[6]观察到实验性中耳细菌感染的急性期，内耳血管纹、Corti器毛细胞高表达HSP70相关表位分子。然而，本组实验发现中耳细菌感染后内耳及螺旋神经节均无HSP70相关表位分子长期表达。表明单纯中耳炎不足以引起免疫介导的内耳损伤，即使抗HSP70抗体已经进入内耳也不能发挥作用。为了确定抗HSP70 抗体能否导致耳蜗功能障碍，Trune等[9]通过腹腔内长期注射牛HSP70(10 μg)免疫BALB/c鼠和CBA/J鼠，注射期间ABR 阈值在4、8、16和32 kHz频率均无变化，血清中的循环免疫复合物和抗核抗体也无增加，实验结果不支持抗HSP70抗体升高是自身免疫性内耳病主要病因的理论。Lim等[10]发现噪声暴露组动物在相对分子质量72 000处有强阳性带，而无噪声暴露的对照动物该处条带很弱。免疫组化显示噪声诱导的HSP72表达主要位于外毛细胞，仅少部分内毛细胞和螺旋神经节细胞表达，由此推测, HSP72可能作为细胞应急的标志并有潜在的损伤及保护作用。Myers等[11]观察了单侧耳蜗缺血和再灌流以后不同时期大鼠外周听觉系统HSP72的变化情况发现，全耳蜗匀浆的免疫转印分析在耳蜗缺血后5 min即表达HSP72，耳蜗免疫组化在缺血10 min可显示，缺血后2 h开始至6 h表达明显，12 h下降至正常水平。在上述情况下HSP70抗体能否诱导自身免疫性内耳损伤有待进一步研究。
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图1 小鼠阳性血清识别豚鼠膜迷路蛋白 的相对分子质量。1，6为肺炎克雷白杆菌组；2，4为金葡菌组；3，5为生理盐水组；8为绿脓杆菌组；8为空白对照
图2 中耳细菌感染小鼠耳蜗HSP70相关表位分子表达。螺旋神经节，Corti器等处均无阳性着色，血管纹处为非特异着色。SP法×100
图3 中耳细菌感染小鼠Corti器HSP70相关表位分子表达。Corti器内外毛细胞，支持细胞，基底膜及盖膜等处均无阳性着色，毛细血管处为非特异着色。SP法×400
图4 中耳细菌感染小鼠螺旋神经节HSP70相关表位分子表达。除曙旋神经节内毛细血管处散在非特异着色外，螺旋神经节细胞无任何阳性着色。SP法×400
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图5 中耳细菌感染小鼠中耳粘膜HSP70相关表位分子表达。粘膜全层有HSP70相关表位分子强阳性表达。SP法×400
通信作者：邹静(Email：zouj@126.com)
参考文献
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2，邹静,姜泗长,顾瑞, 等. 自身免疫感音神经性聋血清抗膜迷路蛋白抗体的检测. 中华耳鼻咽喉科杂志,1995,30:154-156.
3，Billings PB,Keithley EM,Harris JP. Evidence linking the 68 kilodalton antigen identified in progressive sensorineural hearing loss patient sera with heat shock protein 70. Ann Otol Rhinol Laryngol, 1995,104:181-188.
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5，Bloch DB,Gutierrez JA,Guerriero V Jr,et al. Recognition of a dominant epitope in bovine heat-shock protein 70 in inner ear disease. Laryngoscope,1999,109:621-625.
6，邹静,姜泗长,周永清, 等. 实验性中耳细菌感染诱发的热休克反应. 中华耳鼻咽喉科杂志,1998,33:282-284.
, 百拇医药 7，邹静,翟所强,姜泗长, 等. 豚鼠膜迷路蛋白抗原性分析. 中华耳鼻咽喉科杂志,1995,30:13.
8，毕爱芳,邹静,周永清, 等. 变形杆菌引起实验小鼠菌血症成批死亡报告. 实验动物科学与管理, 1999,16:27-29.
9，Trune DR, Kempton JB, Mitchell CR, et al. Failure of elevated heat shock protein 70 antibodies to alter cochlear function in mice. Hear Res,1998,116:65-70.
10，Lim HH, Jenkins OH, Myers MW, et al. Detection of HSP 72 synthesis after acoustic overstimulation in rat cochlea. Hear Res,1993,69:146-150.
11，Myers MW, Quirk WS, Rizk SS, et al. Expression of the major mammalian stress protein in the rat cochlea following transient ischemia. Laryngoscope,1992,102:981-987.
(收稿日期：1999-10-18), 百拇医药