婴幼儿咽喉乳头瘤组织人乳头瘤病毒感染的探讨
作者：陈波蓓 包其郁 张洪勤
单位：陈波蓓(325027浙江温州医学院附属第二医院耳鼻咽喉科)；包其郁 张洪勤(温州医学院分子生物学研究中心)
关键词：乳头状瘤；聚合酶链反应；DNA探针；HPV；婴幼儿咽喉乳头状瘤
中华耳鼻咽喉科杂志000413 【摘要】 目的 探讨温州地区人乳头瘤病毒感染和婴幼儿咽喉乳头状瘤的关系。方法 应用聚合酶链反应和核酸斑点杂交技术检测35例婴幼儿咽喉乳头瘤组织和10例对照组组织(小儿声带小结)HPV6、11、16、18、33 5个型别的DNA。结果 乳头瘤组织HPV感染率为91.4%(30/35)，其中HPV6型检出率为54.2%(19/35)，HPV11型感染率为25.7%(9/35)，多重型别HPV6+11感染率为11.4%(4/35)；HPV16、18、33型，均为阴性。对照组各型检测结果均为阴性，两者对比差异有高度显著性(P<0.001)。结论 温州地区婴幼儿咽喉乳头瘤的发生与HPV感染密切相关，尤以HPV6感染为主。PCR结合核酸斑点杂交技术检测HPV具有敏感性高、特异性强的优点，值得推广。
, 百拇医药
The study of human papilloma viruses infection in juvenile pharynlaryngeal papillomatosis by PCR and dot blot hybridization
CHEN Bobei，BAO Qiyu，ZHANG Hongqin
(Departrment of Otorhinolaryngology, The Second Affiliated Hospital of Wenzhou College of Medical Science, Wenzhou，Zhejiang 325027, China)
【Abstract】 Objective To study the relationship between infection of human papillomavirus and juvenile pharynlaryngeal papilloma. Methods Polymerase chain reaction (PCR) and dot blot hybridization were used to detect HPV6,11,16,18,33 DNA of 35 samples of pharynlaryngeal papilloma and 10 samples of vocal nodule. Results The positive rate of HPV in pharynlaryngeal papilloma was 91.4%(30/35). Among them the positive rates of HPV6 and HPV11 were 54.2%(19/35) and 25.7%(9/35), the positive rate of multiple types of HPV6+11 was 11.4%(4/35). The positive rate of HPV16,18,33 was negative. The positive rate of HPV in vocal nodule was negative and were significantly different from that of the pharynlaryngeal papilloma group. Conclusion The results suggest that infection with HPV, especially with HPV6, is closely associated with the development of juvenile pharynlaryngeal papilloma in Wenzhou area. HPV-DNA detected by PCR and dot blot hybridization has highly specificity and sensitivity.
, 百拇医药
【Key words】 Popilloma; Polymerase chain reaction; DNA probes,HPV; Juvenilet pharynlaryngeal popilloma
近年来研究表明：人类多种肿瘤的发生与人类乳头状瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染有密切关系。婴幼儿咽喉乳头状瘤(juvenile onset pharynlaryngeal papillomatosis, JOP)是儿童咽喉的良性肿瘤之一，目前认为其发病与HPV6、11型感染有关。由于该病毒感染存在较明显的地区差异。因此在温州地区患儿组织中进行HPV-DNA检测及分型，了解本地区的人乳头瘤病毒感染率十分必要。我们采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)结合核酸斑点杂交技术对35份婴幼儿咽喉乳头瘤组织进行HPV6、11、16、18、33 5个型别的检测。
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材料与方法
1. 标本来源：温州医学院附属第二医院婴幼儿咽喉乳头状瘤手术新鲜标本及门诊活体组织检查标本共35例，男21例，女14例，年龄最小6个月，最大6岁。其中1岁以内10例，2～4周岁18例，5～6岁7例。另取小儿声带小结手术标本10例作为对照组(男6例，女4例，年龄5～10岁)。全部病例均经病理学证实，标本取材后置入-70℃冰箱存放。
2.标本处理：所取标本组织用磷酸盐缓冲液洗涤，组织匀浆后常规蛋白酶K消化，苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后溶于TE溶液。
3.PCR 扩增：HPV6引物(扩增280 bp)序列为5′TAGTGGGCCTATGGCTCGTC3′和5′TCCATTAGCCTCCACGGGTG3′, HPV11引物 (扩增360 bp)序列为5′GGAATACATGCGCCATGTGG3′和5′CGAGCAGACGTCCGTCCT CG 3′,HPV16引物(扩增152 bp)序列为5′TGC TAGTGCTTATGCAGCAA3′和5′ ATTTACTGCAACATTGGTAC3′, HPV18引物(扩增216 bp)序列为5′AAGGATGCTGCACCGGCTGA3′和5′CACGCACACGCTTGGCAGGT3 ′, HPV33引物(扩增455 bp)序列为5′ ATGATAGATGATGTAACG CC 3′和5′GCACACTCCATGCGTATCAG3′,由中国科学院上海细胞生物学研究室合成(PCR扩增引物设计参考文献[1])。试剂用量为每50 μL反应体系中，含分型引物50 μmo1/L，四种脱氧三磷酸核苷各200 μmo1/L，TaqDNA聚合酶1.5 U，模板用量5 μL，反应步骤为92℃ 30 s变性，55℃30 s复性,72℃60 s引物延伸，共进行35个循环。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，在紫外光下观察结果并照相记录。
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4.斑点杂交：地高辛标记的寡核苷酸探针序列：HPV6为5′Dig-CATTAACG CAGGGCCGCCTGAAATTGTGCC3′,HPV11为5′Dig-CGCCTCCACCAAATGGTACACTGGAGGATA 3′，HPV16为5′Dig-GCAAACCACCTATAGGGGAACACTGGGGCA 3′，HPV18为5′Dig-TGGTTCAGGCTG GATTGC GTCGCAAGCCCA3′，HP33为5′Dig-CAAATGCAGGCACAGACTCTA-GATGGCCAT3′,由上海生物工程公司合成。试剂盒用贝灵曼公司(德国)产品(Dig DNA Labeling and Detection Kit，Cat No. 1093657)，按说明书操作。主要步骤：①乳头瘤组织DNA提取物经PCR扩增为产物经变性后点样于经10×SSC溶液浸湿的硝酸纤维膜上，80℃烘烤2 h；②预杂交30 min；③37℃杂交过夜(5×SSC，1%阻断试剂，0.1%十二烷基肌酸钠，0.02%SDS，50%甲酰胺，Dig标记的寡核苷酸探针10 ng/ml)；④2 ×SSC，0.1%SDS洗膜2次，0.1×SSC, 0.1%SDS，68℃洗膜2次；⑤抗Dig抗体-碱性磷酸复合物作用30 min；⑥BCIP和NBT显色，阳性标本可见紫色或蓝色斑点出现。
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数据统计学处理采用χ2检验。
结果
PCR扩增产物斑点杂交检测婴幼儿咽喉乳头瘤组织35例，HPV及其型别阳性检出率见表1和图1。HPV阳性检出率为91.4%(32/35)，对照组为0%(0/10)，差异有极显著性(P<0.001)，HPV型别检出以HPV6型为高，占54.2%(19/35)，其次为HPV11型，达25.7%(9/35)，多重型别阳性检出率为11.4%(4/35)，均为HPV6+11，HPV16、18、33三型结果阴性。
表1 各组标本HPV及其型别检出结果(阳性例数，%) 组别
例数
HPV检出率
, 百拇医药
总检出率
HPV6
HPV11
HPV6+11
乳头瘤组
35
32(91.4)
19(54.2)
9(25.7)
4(11.4)
对照组
10
, 百拇医药
0
0
0
0
注：HPV16、18、35检出结果均为阴性
A-1、A-4分别为HPV6、11阳性对照；A-2、A-5分别为HPV6、11阴性对照；1～3其余各项分别为HPV6型PCR产物；4～6其余各项分别为HPV11型PCR产物
图1 PCR产物斑点杂交：有紫色斑点为阳性，无色为阴性
讨论
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近年来，越来越多的研究表明，HPVs尤其是HPV6和HPV11是导致幼儿咽喉乳头瘤(JOP)发病的主要致病因素[2]。由于不同地区、不同种族HPV基因组型分布有差异，目前检测病毒的方法较多，国内外对JOP 组织HPV的检出率报道不一。Gabbott等[3]用PCR方法检测47例199个连续切片的HPV DNA，24例HPV11阳性，19例HPV6阳性，1例HPV6、11均阳性，总计有183个切片HPV阳性。Abramson等[4]报道JOP患者病毒感染以HPV11为主，而生殖器乳头状瘤则以HPV6为主。国内对JOP感染的HPV型别分析，多采用HPV6、11，HPV16、18通用引物进行PCR检测，检出率在70.4%～93.7%[5]。本实验采用PCR和核酸斑点杂交技术对JOP组织进行HPV6、11、16、18、33 5个型别检测，总检出率为91%(30/35)其中HPV6、11型的检出率分别为54.2%，25.7%而HPV16、18、33型均为阴性结果。表明本地区的JOP组织HPV6型感染为主。本组HPV多重型别检出率为11.4%，主要为HPV6、11型，提示在同一患儿中存在多重型别HPV感染。有学者把HPV分为“高危”和“低危”两大类，通常认为HPV16、18、31、33等属于“高危”病毒，易引起恶性肿瘤，而HPV6、11属于“低危”病毒，通常只引起良性病变。 因此喉上皮组织中的“低危”HPV持续感染是导致喉乳头瘤复发和恶性转化的主要原因。
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追问本组患儿病史，其母亲在怀孕及分娩时产道均有湿疣病史，其中6例来我院检查时仍有尖锐湿疣存在。流行病学已有有关JOP与生殖道HPV6、11同源感染的报告[6]。我们曾对温州地区女性尖锐湿疣组织进行HPV检测及分型[7]。结果阳性检出率为85.7%，并以HPV6型为高，占73.8%。其结果和本组结果相近，提示二者具有相关性。
目前，用于检测HPV的方法较多， 但在实际应用时各有其优缺点，虽然PCR 方法与核酸杂交技术均具有敏感性高等优点，但却难以检出基因复制低于104的病原。HPV型别多，不同型的HPV引起不同部位的组织病变，故为研究某一病变组织的HPV型别分布， 经常对同一组织标本进行多型别HPV分析，如果标本量少，或病毒基因复制低， 必将影响结果的准确性。Shibate等[8] 在对石蜡切片标本进行的HPV16和HPV18的检测中发现，使用PCR 扩增后的杂交检测能使检测敏感性达到可检出20个病毒基因复制的水平，使敏感性提高近1 000倍。我们采用PCR结合核酸斑点杂交的方法对所采集的新鲜标本检测，避免了单纯PCR 方法可能出现的假阳性和假阴性结果，使PCR扩增结果得到了验证。因此，PCR扩增产物斑点杂交法不仅在HPV检测中，而且在其他病原的检测中应于以推广应用。
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基金项目：温州市科委科技发展基金资助项目(S999306A)
通信作者：陈波蓓(Email:yxx@dmrc.com.cn)
参考文献
1，林方明. PCR技术操作和应用指南. 北京：人民军医出版社，1993. 7-8.
2，费声重，吴正虎. 喉癌与人乳头状瘤病毒相关性研究的进展. 中华耳鼻咽喉科杂志， 1995,30:115-117.
3，Gabbott M，Cossart YE, Kan Ai, et al. Human papillomavirus and hoset Vari ab/es as predictors of clincol course. in patients with juvenile -onset recurrent respirtory papillomatosis. J Clin Micobiol, 1997,35: 3098-3103.
, 百拇医药
4，Abramson AL, Steinberg BM, Winkler B. Laryngeal papillomatosis: clinical histopathologic and molecular studies. Laryngoscope, 1987,97:678-685.
5，吴正虎，陈怀芳. 上呼吸道乳头状病HPV-DNA的检测. 耳鼻咽喉-头颈外科杂志,1996,3:141.
6，崔顺九. 幼年型复发性呼吸道乳头瘤相关基础和临床研究现状. 耳鼻咽喉-头颈外科杂志，1999：6：188-190.
7，张丽芳,包其郁. 温州地区尖锐湿疣组织人乳头瘤病毒检测. 中国皮肤性病学杂志, 1998，12:71.
8，Shibate DK, Arnheim N, MartinWJ. Detection of human papilloma virus in paraffinembedded tissue using the polymerase chain reaction. J Exper Med，1988，167:225-230.
(收稿日期：2000-01-10), 百拇医药
单位：陈波蓓(325027浙江温州医学院附属第二医院耳鼻咽喉科)；包其郁 张洪勤(温州医学院分子生物学研究中心)
关键词：乳头状瘤；聚合酶链反应；DNA探针；HPV；婴幼儿咽喉乳头状瘤
中华耳鼻咽喉科杂志000413 【摘要】 目的 探讨温州地区人乳头瘤病毒感染和婴幼儿咽喉乳头状瘤的关系。方法 应用聚合酶链反应和核酸斑点杂交技术检测35例婴幼儿咽喉乳头瘤组织和10例对照组组织(小儿声带小结)HPV6、11、16、18、33 5个型别的DNA。结果 乳头瘤组织HPV感染率为91.4%(30/35)，其中HPV6型检出率为54.2%(19/35)，HPV11型感染率为25.7%(9/35)，多重型别HPV6+11感染率为11.4%(4/35)；HPV16、18、33型，均为阴性。对照组各型检测结果均为阴性，两者对比差异有高度显著性(P<0.001)。结论 温州地区婴幼儿咽喉乳头瘤的发生与HPV感染密切相关，尤以HPV6感染为主。PCR结合核酸斑点杂交技术检测HPV具有敏感性高、特异性强的优点，值得推广。
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The study of human papilloma viruses infection in juvenile pharynlaryngeal papillomatosis by PCR and dot blot hybridization
CHEN Bobei，BAO Qiyu，ZHANG Hongqin
(Departrment of Otorhinolaryngology, The Second Affiliated Hospital of Wenzhou College of Medical Science, Wenzhou，Zhejiang 325027, China)
【Abstract】 Objective To study the relationship between infection of human papillomavirus and juvenile pharynlaryngeal papilloma. Methods Polymerase chain reaction (PCR) and dot blot hybridization were used to detect HPV6,11,16,18,33 DNA of 35 samples of pharynlaryngeal papilloma and 10 samples of vocal nodule. Results The positive rate of HPV in pharynlaryngeal papilloma was 91.4%(30/35). Among them the positive rates of HPV6 and HPV11 were 54.2%(19/35) and 25.7%(9/35), the positive rate of multiple types of HPV6+11 was 11.4%(4/35). The positive rate of HPV16,18,33 was negative. The positive rate of HPV in vocal nodule was negative and were significantly different from that of the pharynlaryngeal papilloma group. Conclusion The results suggest that infection with HPV, especially with HPV6, is closely associated with the development of juvenile pharynlaryngeal papilloma in Wenzhou area. HPV-DNA detected by PCR and dot blot hybridization has highly specificity and sensitivity.
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【Key words】 Popilloma; Polymerase chain reaction; DNA probes,HPV; Juvenilet pharynlaryngeal popilloma
近年来研究表明：人类多种肿瘤的发生与人类乳头状瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染有密切关系。婴幼儿咽喉乳头状瘤(juvenile onset pharynlaryngeal papillomatosis, JOP)是儿童咽喉的良性肿瘤之一，目前认为其发病与HPV6、11型感染有关。由于该病毒感染存在较明显的地区差异。因此在温州地区患儿组织中进行HPV-DNA检测及分型，了解本地区的人乳头瘤病毒感染率十分必要。我们采用聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR)结合核酸斑点杂交技术对35份婴幼儿咽喉乳头瘤组织进行HPV6、11、16、18、33 5个型别的检测。
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材料与方法
1. 标本来源：温州医学院附属第二医院婴幼儿咽喉乳头状瘤手术新鲜标本及门诊活体组织检查标本共35例，男21例，女14例，年龄最小6个月，最大6岁。其中1岁以内10例，2～4周岁18例，5～6岁7例。另取小儿声带小结手术标本10例作为对照组(男6例，女4例，年龄5～10岁)。全部病例均经病理学证实，标本取材后置入-70℃冰箱存放。
2.标本处理：所取标本组织用磷酸盐缓冲液洗涤，组织匀浆后常规蛋白酶K消化，苯酚/氯仿抽提，乙醇沉淀后溶于TE溶液。
3.PCR 扩增：HPV6引物(扩增280 bp)序列为5′TAGTGGGCCTATGGCTCGTC3′和5′TCCATTAGCCTCCACGGGTG3′, HPV11引物 (扩增360 bp)序列为5′GGAATACATGCGCCATGTGG3′和5′CGAGCAGACGTCCGTCCT CG 3′,HPV16引物(扩增152 bp)序列为5′TGC TAGTGCTTATGCAGCAA3′和5′ ATTTACTGCAACATTGGTAC3′, HPV18引物(扩增216 bp)序列为5′AAGGATGCTGCACCGGCTGA3′和5′CACGCACACGCTTGGCAGGT3 ′, HPV33引物(扩增455 bp)序列为5′ ATGATAGATGATGTAACG CC 3′和5′GCACACTCCATGCGTATCAG3′,由中国科学院上海细胞生物学研究室合成(PCR扩增引物设计参考文献[1])。试剂用量为每50 μL反应体系中，含分型引物50 μmo1/L，四种脱氧三磷酸核苷各200 μmo1/L，TaqDNA聚合酶1.5 U，模板用量5 μL，反应步骤为92℃ 30 s变性，55℃30 s复性,72℃60 s引物延伸，共进行35个循环。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭染色，在紫外光下观察结果并照相记录。
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4.斑点杂交：地高辛标记的寡核苷酸探针序列：HPV6为5′Dig-CATTAACG CAGGGCCGCCTGAAATTGTGCC3′,HPV11为5′Dig-CGCCTCCACCAAATGGTACACTGGAGGATA 3′，HPV16为5′Dig-GCAAACCACCTATAGGGGAACACTGGGGCA 3′，HPV18为5′Dig-TGGTTCAGGCTG GATTGC GTCGCAAGCCCA3′，HP33为5′Dig-CAAATGCAGGCACAGACTCTA-GATGGCCAT3′,由上海生物工程公司合成。试剂盒用贝灵曼公司(德国)产品(Dig DNA Labeling and Detection Kit，Cat No. 1093657)，按说明书操作。主要步骤：①乳头瘤组织DNA提取物经PCR扩增为产物经变性后点样于经10×SSC溶液浸湿的硝酸纤维膜上，80℃烘烤2 h；②预杂交30 min；③37℃杂交过夜(5×SSC，1%阻断试剂，0.1%十二烷基肌酸钠，0.02%SDS，50%甲酰胺，Dig标记的寡核苷酸探针10 ng/ml)；④2 ×SSC，0.1%SDS洗膜2次，0.1×SSC, 0.1%SDS，68℃洗膜2次；⑤抗Dig抗体-碱性磷酸复合物作用30 min；⑥BCIP和NBT显色，阳性标本可见紫色或蓝色斑点出现。
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数据统计学处理采用χ2检验。
结果
PCR扩增产物斑点杂交检测婴幼儿咽喉乳头瘤组织35例，HPV及其型别阳性检出率见表1和图1。HPV阳性检出率为91.4%(32/35)，对照组为0%(0/10)，差异有极显著性(P<0.001)，HPV型别检出以HPV6型为高，占54.2%(19/35)，其次为HPV11型，达25.7%(9/35)，多重型别阳性检出率为11.4%(4/35)，均为HPV6+11，HPV16、18、33三型结果阴性。
表1 各组标本HPV及其型别检出结果(阳性例数，%) 组别
例数
HPV检出率
, 百拇医药
总检出率
HPV6
HPV11
HPV6+11
乳头瘤组
35
32(91.4)
19(54.2)
9(25.7)
4(11.4)
对照组
10
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0
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0
注：HPV16、18、35检出结果均为阴性
A-1、A-4分别为HPV6、11阳性对照；A-2、A-5分别为HPV6、11阴性对照；1～3其余各项分别为HPV6型PCR产物；4～6其余各项分别为HPV11型PCR产物
图1 PCR产物斑点杂交：有紫色斑点为阳性，无色为阴性
讨论
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近年来，越来越多的研究表明，HPVs尤其是HPV6和HPV11是导致幼儿咽喉乳头瘤(JOP)发病的主要致病因素[2]。由于不同地区、不同种族HPV基因组型分布有差异，目前检测病毒的方法较多，国内外对JOP 组织HPV的检出率报道不一。Gabbott等[3]用PCR方法检测47例199个连续切片的HPV DNA，24例HPV11阳性，19例HPV6阳性，1例HPV6、11均阳性，总计有183个切片HPV阳性。Abramson等[4]报道JOP患者病毒感染以HPV11为主，而生殖器乳头状瘤则以HPV6为主。国内对JOP感染的HPV型别分析，多采用HPV6、11，HPV16、18通用引物进行PCR检测，检出率在70.4%～93.7%[5]。本实验采用PCR和核酸斑点杂交技术对JOP组织进行HPV6、11、16、18、33 5个型别检测，总检出率为91%(30/35)其中HPV6、11型的检出率分别为54.2%，25.7%而HPV16、18、33型均为阴性结果。表明本地区的JOP组织HPV6型感染为主。本组HPV多重型别检出率为11.4%，主要为HPV6、11型，提示在同一患儿中存在多重型别HPV感染。有学者把HPV分为“高危”和“低危”两大类，通常认为HPV16、18、31、33等属于“高危”病毒，易引起恶性肿瘤，而HPV6、11属于“低危”病毒，通常只引起良性病变。 因此喉上皮组织中的“低危”HPV持续感染是导致喉乳头瘤复发和恶性转化的主要原因。
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追问本组患儿病史，其母亲在怀孕及分娩时产道均有湿疣病史，其中6例来我院检查时仍有尖锐湿疣存在。流行病学已有有关JOP与生殖道HPV6、11同源感染的报告[6]。我们曾对温州地区女性尖锐湿疣组织进行HPV检测及分型[7]。结果阳性检出率为85.7%，并以HPV6型为高，占73.8%。其结果和本组结果相近，提示二者具有相关性。
目前，用于检测HPV的方法较多， 但在实际应用时各有其优缺点，虽然PCR 方法与核酸杂交技术均具有敏感性高等优点，但却难以检出基因复制低于104的病原。HPV型别多，不同型的HPV引起不同部位的组织病变，故为研究某一病变组织的HPV型别分布， 经常对同一组织标本进行多型别HPV分析，如果标本量少，或病毒基因复制低， 必将影响结果的准确性。Shibate等[8] 在对石蜡切片标本进行的HPV16和HPV18的检测中发现，使用PCR 扩增后的杂交检测能使检测敏感性达到可检出20个病毒基因复制的水平，使敏感性提高近1 000倍。我们采用PCR结合核酸斑点杂交的方法对所采集的新鲜标本检测，避免了单纯PCR 方法可能出现的假阳性和假阴性结果，使PCR扩增结果得到了验证。因此，PCR扩增产物斑点杂交法不仅在HPV检测中，而且在其他病原的检测中应于以推广应用。
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基金项目：温州市科委科技发展基金资助项目(S999306A)
通信作者：陈波蓓(Email:yxx@dmrc.com.cn)
参考文献
1，林方明. PCR技术操作和应用指南. 北京：人民军医出版社，1993. 7-8.
2，费声重，吴正虎. 喉癌与人乳头状瘤病毒相关性研究的进展. 中华耳鼻咽喉科杂志， 1995,30:115-117.
3，Gabbott M，Cossart YE, Kan Ai, et al. Human papillomavirus and hoset Vari ab/es as predictors of clincol course. in patients with juvenile -onset recurrent respirtory papillomatosis. J Clin Micobiol, 1997,35: 3098-3103.
, 百拇医药
4，Abramson AL, Steinberg BM, Winkler B. Laryngeal papillomatosis: clinical histopathologic and molecular studies. Laryngoscope, 1987,97:678-685.
5，吴正虎，陈怀芳. 上呼吸道乳头状病HPV-DNA的检测. 耳鼻咽喉-头颈外科杂志,1996,3:141.
6，崔顺九. 幼年型复发性呼吸道乳头瘤相关基础和临床研究现状. 耳鼻咽喉-头颈外科杂志，1999：6：188-190.
7，张丽芳,包其郁. 温州地区尖锐湿疣组织人乳头瘤病毒检测. 中国皮肤性病学杂志, 1998，12:71.
8，Shibate DK, Arnheim N, MartinWJ. Detection of human papilloma virus in paraffinembedded tissue using the polymerase chain reaction. J Exper Med，1988，167:225-230.
(收稿日期：2000-01-10), 百拇医药