新生小鼠Corti器的培养及新霉素耳毒性作用的体外观察
作者：王小路 段玉贞 谷京城 王保华 孙连玉
单位：王小路 谷京城 孙连玉(121001 辽宁省 锦州医学院附属第一医院耳鼻咽喉科)；段玉贞(沈阳市电机股份有限公司卫生所)；王保华(中国医科大学第二临床医院耳鼻咽喉科)
关键词：
中华耳鼻咽喉科杂志000419 Corti器组织培养最常用的方法是费时费力的Maximow玻片装置培养技术，1997年报道将新生沙鼠的Corti器放入有盖培养皿底部培养[1]，正常存活至少14 d。我们用相似方法培养新生小鼠的Corti器，观察其正常结构及新霉素耳毒作用。
一、材料和方法
1.材料来源：生后2 d的昆明系小白鼠(中国医科大学第二临床医院动物中心提供)21只，分为正常组 (A组)9只、新霉素作用1 d的B组和2 d的C组各6只动物。Dulbecco改良Eagle培养基 (Dulbecco′s modification of Eagle′s medium，DMEM)和4-(2hydroxyethl)-1-peperazine ethanesulphonic acid (HEPES)培养液(Gibco，美国),小牛血清(大连)，硫酸新霉素(Serva，德国)。
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2.取材：小鼠在-20℃下冷冻麻醉5 min后，全身浸入75%酒精5 min，取出断头，沿矢状缝切成两部分，放入盛有冷的(4℃)Hank液+10 mmol/L Hepes液(pH 7.2)的培养皿中。体视显微镜下暴露左侧耳蜗,取出基底回,仔细剔除软骨壁,剥离前庭膜及血管纹。
3.培养方法：将基底回平铺于六孔培养板底部, 加入正常培养液(25 mmol/L HEPES的DMEM，加10%小牛血清组成，pH值7.35), 放入37℃的5% CO2孵育箱。培养板底部铺有鼠尾胶原以利于移植物贴壁生长，培养液2 d换1次。实验组的标本经正常体外培养1 d后，在加入含1 mmol/L新霉素培养液中培养1～2 d。
4.观察：培养期间在配有微分干涉相衬(differential interference contrast，DIC)装置的倒置显微镜(OLYMPUS，日本)下观察，标本用2.5%戊二醛固定。固定后的标本经1%锇酸后固定，脱水，临界点干燥，喷金，扫描电镜(日立S-450，日本)观察。
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5.统计方法：在每个标本的中部取与10个内毛细胞的位置相对的30个相邻外毛细胞，扫描电镜下应用积分法对静纤毛束破坏程度进行评价，静纤毛束完整无损的记3分，损伤程度小于或达到2/3的记2分，损伤超过2/3的记1分，静纤毛束消失记0分，相加总和代表标本的得分。A、B、C组各统计6个标本，数据用方差分析和q检验进行统计分析，P<0.05认为具有统计意义,差异有显著性。
二、结果
培养物8 h贴壁，周围有成纤维细胞生长。用DIC观察，正常组标本培养的前4 d外毛细胞(outer hair cell，OHC)的听毛呈“V”形，3排OHC均清晰可见，4 d后光镜下就不易观察。实验组的移植物在正常培养液存活1 d后，DIC观察OHC听毛呈“V”形，3排均清晰可见，证实毛细胞生存良好，新霉素作用1 d后，OHC听毛排列可辨认，但“V”形出现残缺。新霉素作用2 d后，DIC无法观察 “V”形的OHC听毛，更无法辨认OHC听毛的3排排列，听毛全部破坏。
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扫描电镜下A组培养3 和7 d的标本可见OHC听毛呈“V”形，排列3排，高倍放大可见多根静纤毛，中间位置远离静纤毛可见1根动纤毛(图1，2)。B组可见OHC听毛部分缺失、融合、消失(图3)。C组可见OHC听毛全部被破坏，大部分纤毛消失，少数融合成山峰样残留物(图4)。与光镜观察结果一致，未见正常OHC听毛存在。统计结果显示：F=584.968 > F0.05(2,15)=3.68 , P<0.05，3组差异具有显著性意义；每两组比较，P值均<0.05。
三、讨论
毛细胞表皮板上的“V”形静纤毛束可在DIC下观察到，并作为识别毛细胞和判别其活性的手段[2]。移植物体外生长的前4 d观察静纤毛束并不困难，不同组织成分的生长和增殖可产生移位，Corti器的标准结构发生改变，4 d以后观察静纤毛束比较困难。本实验观察表明体外培养的3、7 d的标本中毛细胞存活良好，但OHC保留有胚胎特征，如动纤毛的存在，表明新生鼠的毛细胞发育不成熟。
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本实验观察证实新霉素对体外培养的毛细胞有破坏作用，随作用时间延长而破坏程度加重，静纤毛束残缺，消失与Lwenheim等[3]观察结果相似。
新生小鼠Corti器体外培养模型是内耳研究的重要手段，新霉素对Corti器破坏的药物模型也成为毛细胞保护和毛细胞再生研究的基础。
图1 正常培养3 d的Corti器。静纤毛中间有1根动纤毛。×12 000
图2 正常培养7 d的Corti器。外听毛呈“V”形(3分)，排列3排。×5 000
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图3 新霉素作用1 d后的Corti器。外听毛部分残缺(2分)、融合和消失(0分)。×2 000
图4 新霉素作用2 d后Corti器。融合成山峰样残留物(1分)或消失(0分)。×5 000
(本实验完成于中国医科大学第二临床医院小儿外科卫生部小儿先天畸形重点实验室)
通信作者：王小路(Email：wbaohua@mail.sy.ln.cn)
参考文献
1，Liu TC,He DZ,Lin X.A novel,simple organotypic culture method to study the organ of Corti from the neonatal gerbil. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec,1997,59:243-247.
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2，Sobkowicz HM,Loftus JM,Slapnick SM. Tissue culture of the organ of Corti. Acta Otolaryngol, 1993, Suppl 502:3-36.
3，Lwenheim H,Kil J,Gültig K, et al. Determination of hair cell degeneration and hair cell death in neomycin treated cultures of the neonatal rat cochlea. Hear Res ,1999,128:16-26.
(收稿日期：1999-12-13), http://www.100md.com
单位：王小路 谷京城 孙连玉(121001 辽宁省 锦州医学院附属第一医院耳鼻咽喉科)；段玉贞(沈阳市电机股份有限公司卫生所)；王保华(中国医科大学第二临床医院耳鼻咽喉科)
关键词：
中华耳鼻咽喉科杂志000419 Corti器组织培养最常用的方法是费时费力的Maximow玻片装置培养技术，1997年报道将新生沙鼠的Corti器放入有盖培养皿底部培养[1]，正常存活至少14 d。我们用相似方法培养新生小鼠的Corti器，观察其正常结构及新霉素耳毒作用。
一、材料和方法
1.材料来源：生后2 d的昆明系小白鼠(中国医科大学第二临床医院动物中心提供)21只，分为正常组 (A组)9只、新霉素作用1 d的B组和2 d的C组各6只动物。Dulbecco改良Eagle培养基 (Dulbecco′s modification of Eagle′s medium，DMEM)和4-(2hydroxyethl)-1-peperazine ethanesulphonic acid (HEPES)培养液(Gibco，美国),小牛血清(大连)，硫酸新霉素(Serva，德国)。
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2.取材：小鼠在-20℃下冷冻麻醉5 min后，全身浸入75%酒精5 min，取出断头，沿矢状缝切成两部分，放入盛有冷的(4℃)Hank液+10 mmol/L Hepes液(pH 7.2)的培养皿中。体视显微镜下暴露左侧耳蜗,取出基底回,仔细剔除软骨壁,剥离前庭膜及血管纹。
3.培养方法：将基底回平铺于六孔培养板底部, 加入正常培养液(25 mmol/L HEPES的DMEM，加10%小牛血清组成，pH值7.35), 放入37℃的5% CO2孵育箱。培养板底部铺有鼠尾胶原以利于移植物贴壁生长，培养液2 d换1次。实验组的标本经正常体外培养1 d后，在加入含1 mmol/L新霉素培养液中培养1～2 d。
4.观察：培养期间在配有微分干涉相衬(differential interference contrast，DIC)装置的倒置显微镜(OLYMPUS，日本)下观察，标本用2.5%戊二醛固定。固定后的标本经1%锇酸后固定，脱水，临界点干燥，喷金，扫描电镜(日立S-450，日本)观察。
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5.统计方法：在每个标本的中部取与10个内毛细胞的位置相对的30个相邻外毛细胞，扫描电镜下应用积分法对静纤毛束破坏程度进行评价，静纤毛束完整无损的记3分，损伤程度小于或达到2/3的记2分，损伤超过2/3的记1分，静纤毛束消失记0分，相加总和代表标本的得分。A、B、C组各统计6个标本，数据用方差分析和q检验进行统计分析，P<0.05认为具有统计意义,差异有显著性。
二、结果
培养物8 h贴壁，周围有成纤维细胞生长。用DIC观察，正常组标本培养的前4 d外毛细胞(outer hair cell，OHC)的听毛呈“V”形，3排OHC均清晰可见，4 d后光镜下就不易观察。实验组的移植物在正常培养液存活1 d后，DIC观察OHC听毛呈“V”形，3排均清晰可见，证实毛细胞生存良好，新霉素作用1 d后，OHC听毛排列可辨认，但“V”形出现残缺。新霉素作用2 d后，DIC无法观察 “V”形的OHC听毛，更无法辨认OHC听毛的3排排列，听毛全部破坏。
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扫描电镜下A组培养3 和7 d的标本可见OHC听毛呈“V”形，排列3排，高倍放大可见多根静纤毛，中间位置远离静纤毛可见1根动纤毛(图1，2)。B组可见OHC听毛部分缺失、融合、消失(图3)。C组可见OHC听毛全部被破坏，大部分纤毛消失，少数融合成山峰样残留物(图4)。与光镜观察结果一致，未见正常OHC听毛存在。统计结果显示：F=584.968 > F0.05(2,15)=3.68 , P<0.05，3组差异具有显著性意义；每两组比较，P值均<0.05。
三、讨论
毛细胞表皮板上的“V”形静纤毛束可在DIC下观察到，并作为识别毛细胞和判别其活性的手段[2]。移植物体外生长的前4 d观察静纤毛束并不困难，不同组织成分的生长和增殖可产生移位，Corti器的标准结构发生改变，4 d以后观察静纤毛束比较困难。本实验观察表明体外培养的3、7 d的标本中毛细胞存活良好，但OHC保留有胚胎特征，如动纤毛的存在，表明新生鼠的毛细胞发育不成熟。
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本实验观察证实新霉素对体外培养的毛细胞有破坏作用，随作用时间延长而破坏程度加重，静纤毛束残缺，消失与Lwenheim等[3]观察结果相似。
新生小鼠Corti器体外培养模型是内耳研究的重要手段，新霉素对Corti器破坏的药物模型也成为毛细胞保护和毛细胞再生研究的基础。
图1 正常培养3 d的Corti器。静纤毛中间有1根动纤毛。×12 000
图2 正常培养7 d的Corti器。外听毛呈“V”形(3分)，排列3排。×5 000
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图3 新霉素作用1 d后的Corti器。外听毛部分残缺(2分)、融合和消失(0分)。×2 000
图4 新霉素作用2 d后Corti器。融合成山峰样残留物(1分)或消失(0分)。×5 000
(本实验完成于中国医科大学第二临床医院小儿外科卫生部小儿先天畸形重点实验室)
通信作者：王小路(Email：wbaohua@mail.sy.ln.cn)
参考文献
1，Liu TC,He DZ,Lin X.A novel,simple organotypic culture method to study the organ of Corti from the neonatal gerbil. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec,1997,59:243-247.
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2，Sobkowicz HM,Loftus JM,Slapnick SM. Tissue culture of the organ of Corti. Acta Otolaryngol, 1993, Suppl 502:3-36.
3，Lwenheim H,Kil J,Gültig K, et al. Determination of hair cell degeneration and hair cell death in neomycin treated cultures of the neonatal rat cochlea. Hear Res ,1999,128:16-26.
(收稿日期：1999-12-13), http://www.100md.com