硫酸链霉素对豚鼠耳蜗外毛细胞细胞膜钙内流的影响
作者：李树华 韩东一 杨伟炎 姜泗长
单位：100853 北京 解放军总医院耳鼻咽喉-头颈外科
关键词：
中华耳鼻咽喉科杂志000522 已经证明细胞内钙离子参与广泛的细胞生物学过程，氨基糖甙类抗生素可以阻断外毛细胞(outer hair cells, OHC)胞膜上的电压依赖性钙通道，并认为这与其急性耳毒性作用有关，本实验就硫酸链霉素浓度及不同部位OHC的来源与急性耳毒性的关系进行研究。
一、材料与方法
材料与方法和既往的报道大体相同[1]，选体重在200～300 g的花色豚鼠15只。全身麻醉后断头活杀，解剖出双侧听泡，酶-机械分离法获得单离外毛细胞，加入终浓度为10 μmol/L的Fluo-3/AM(Molecular Probe公司, 美国)在37℃下避光孵育约30 min，完成Fluo-3负载。采用ACAS Ultima 型激光扫描共聚焦显微镜(Meridian公司，美国)观察各种刺激条件下用Fluo-3/AM负载后的外毛细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的变化。正常细胞外液和无钙细胞外液的组成与既往相同，高钾细胞外液的组成(单位为mmol/L)：NaCl 55；KCl 100，其余成分和正常细胞外液相同。硫酸链霉素(Sigma公司，美国)等试剂均于实验前加入正常细胞外液中备用，各溶液的渗透浓度均调至300 Osm mol/L左右。整个实验过程约需5 min，第2～3 min灌流含一定浓度所用药物的细胞外液，其他时间灌流正常细胞外液。
, http://www.100md.com
二、结果
1. 静息状态下正常OHC[Ca2+]i的动态变化：观察了11个单离OHC在标准细胞外液灌流过程中[Ca2+]i的动态变化。结果表明在细胞外液灌流的整个时间内其[Ca2+]i保持稳定，均示无波动的平滑曲线。
2.高钾细胞外液灌流对OHC[Ca2+]i的影响：细胞外液中钾离子的浓度为100 mmol/L，共灌流2 min，观察14个细胞，其中12个细胞表现为明显的OHC[Ca2+]i升高，2个细胞无明显变化；在高钾无钙细胞外液中观察7个细胞，OHC[Ca2+]i均无明显变化。经卡方检验(直接概率法)P=0.000 31，2组间差异有极显著性。说明高钾细胞外液灌流所致的细胞内游离钙离子的增加的来源主要是细胞外液钙离子的内流所致。
, http://www.100md.com
3.不同浓度硫酸链霉素对高钾所致的OHC内钙升高效应的影响：预先在2组细胞的细胞外液中分别加入1.0 mmol/L和0.1 mmol/L的硫酸链霉素放置1 h，然后观察高钾细胞外液灌流时OHC[Ca2+]i的变化。结果：1.0 mmol/L硫酸链霉素组共观察15个细胞，其中13个细胞OHC[Ca2+]i无明显变化，2个细胞OHC[Ca2+]i升高；0.1 mmol/L硫酸链霉素组共观察12个细胞，其中3个细胞OHC[Ca2+]i无明显变化，9个细胞OHC[Ca2+]i升高。经卡方检验(直接概率法)，P=0.002 0，<0.01，2组间差异有极显著性，说明硫酸链霉素对OHC的急性毒性作用具有浓度依赖性。
4.硫酸链霉素对不同部位的OHC的影响:分别分离耳蜗顶回和底回的基底膜，置于不同的培养皿中，分离各自的OHC，2组细胞外液中均加入0.02 mmol/L的硫酸链霉素放置1 h，然后观察高钾细胞外液灌流时OHC[Ca2+]i的变化。结果：顶回组共观察12个细胞，其中3个细胞OHC[Ca2+]i无明显变化，9个细胞OHC[Ca2+]i升高；底回组共观察5个细胞，OHC[Ca2+]i均无明显变化。经卡方检验(直接概率法)，P=0.009 1，<0.01，2组间差异有极显著性，说明不同部位的OHC对硫酸链霉素的敏感性不同，即底回的细胞更易于受到链霉素的损害。
, http://www.100md.com
三、讨论
氨基糖甙类抗生素阻断神经肌肉接头传导的能力与其阻断神经末梢的钙通道有关[2]，Dulon等[3]报告，当预先以氨基糖甙类抗生素处理耳蜗外毛细胞后，外毛细胞则失去对高钾刺激时细胞内钙升高的反应能力，并认为这和氨基糖甙类抗生素的急性耳毒性作用有关，但该研究没有回答氨基糖甙类药物的浓度及不同部位外毛细胞与急性耳毒性的关系。本实验证实，不同浓度的硫酸链霉素对高钾细胞外液灌流所致的OHC[Ca2+]i升高效应的阻断作用差异明显，表现为典型的浓度依赖性；相同浓度的硫酸链霉素对来源于顶回和底回的外毛细胞的阻断作用差异也具有极显著性，即后者较前者对硫酸链霉素的耳毒性更敏感。这一结果提示，氨基糖甙类药物的耳毒性先表现为高频听力损害及其与用药剂量的依赖性有其内在的分子生物学基础。
基金项目: 国家自然科学基金资助课题(39670778), 军队杰出青年人才基金资助课题
, 百拇医药
参考文献
1，李树华，韩东一，杨伟炎，等. 水杨酸钠对豚鼠耳蜗单离外毛细胞游离钙离子浓度的影响及其调控机制研究.中华耳鼻咽喉科杂志, 2000, 35:263-266.
2，Atchison WD, Adgate L, Beaman CM. Effects of antibiotics on uptake of calcium into isolated nerve terminals. J Pharmacol Exp Ther, 1988,245:394-401.
3，Dulon D, Zajic G, Aran JM, et al. Aminoglycoside antibiotics impair calcium entry but not viability and motility in isolated cochlear outer hair cells. J Neurosci Res, 1989,24:338-346.
(收稿日期：2000-01-26), 百拇医药
单位：100853 北京 解放军总医院耳鼻咽喉-头颈外科
关键词：
中华耳鼻咽喉科杂志000522 已经证明细胞内钙离子参与广泛的细胞生物学过程，氨基糖甙类抗生素可以阻断外毛细胞(outer hair cells, OHC)胞膜上的电压依赖性钙通道，并认为这与其急性耳毒性作用有关，本实验就硫酸链霉素浓度及不同部位OHC的来源与急性耳毒性的关系进行研究。
一、材料与方法
材料与方法和既往的报道大体相同[1]，选体重在200～300 g的花色豚鼠15只。全身麻醉后断头活杀，解剖出双侧听泡，酶-机械分离法获得单离外毛细胞，加入终浓度为10 μmol/L的Fluo-3/AM(Molecular Probe公司, 美国)在37℃下避光孵育约30 min，完成Fluo-3负载。采用ACAS Ultima 型激光扫描共聚焦显微镜(Meridian公司，美国)观察各种刺激条件下用Fluo-3/AM负载后的外毛细胞内游离钙离子浓度([Ca2+]i)的变化。正常细胞外液和无钙细胞外液的组成与既往相同，高钾细胞外液的组成(单位为mmol/L)：NaCl 55；KCl 100，其余成分和正常细胞外液相同。硫酸链霉素(Sigma公司，美国)等试剂均于实验前加入正常细胞外液中备用，各溶液的渗透浓度均调至300 Osm mol/L左右。整个实验过程约需5 min，第2～3 min灌流含一定浓度所用药物的细胞外液，其他时间灌流正常细胞外液。
, http://www.100md.com
二、结果
1. 静息状态下正常OHC[Ca2+]i的动态变化：观察了11个单离OHC在标准细胞外液灌流过程中[Ca2+]i的动态变化。结果表明在细胞外液灌流的整个时间内其[Ca2+]i保持稳定，均示无波动的平滑曲线。
2.高钾细胞外液灌流对OHC[Ca2+]i的影响：细胞外液中钾离子的浓度为100 mmol/L，共灌流2 min，观察14个细胞，其中12个细胞表现为明显的OHC[Ca2+]i升高，2个细胞无明显变化；在高钾无钙细胞外液中观察7个细胞，OHC[Ca2+]i均无明显变化。经卡方检验(直接概率法)P=0.000 31，2组间差异有极显著性。说明高钾细胞外液灌流所致的细胞内游离钙离子的增加的来源主要是细胞外液钙离子的内流所致。
, http://www.100md.com
3.不同浓度硫酸链霉素对高钾所致的OHC内钙升高效应的影响：预先在2组细胞的细胞外液中分别加入1.0 mmol/L和0.1 mmol/L的硫酸链霉素放置1 h，然后观察高钾细胞外液灌流时OHC[Ca2+]i的变化。结果：1.0 mmol/L硫酸链霉素组共观察15个细胞，其中13个细胞OHC[Ca2+]i无明显变化，2个细胞OHC[Ca2+]i升高；0.1 mmol/L硫酸链霉素组共观察12个细胞，其中3个细胞OHC[Ca2+]i无明显变化，9个细胞OHC[Ca2+]i升高。经卡方检验(直接概率法)，P=0.002 0，<0.01，2组间差异有极显著性，说明硫酸链霉素对OHC的急性毒性作用具有浓度依赖性。
4.硫酸链霉素对不同部位的OHC的影响:分别分离耳蜗顶回和底回的基底膜，置于不同的培养皿中，分离各自的OHC，2组细胞外液中均加入0.02 mmol/L的硫酸链霉素放置1 h，然后观察高钾细胞外液灌流时OHC[Ca2+]i的变化。结果：顶回组共观察12个细胞，其中3个细胞OHC[Ca2+]i无明显变化，9个细胞OHC[Ca2+]i升高；底回组共观察5个细胞，OHC[Ca2+]i均无明显变化。经卡方检验(直接概率法)，P=0.009 1，<0.01，2组间差异有极显著性，说明不同部位的OHC对硫酸链霉素的敏感性不同，即底回的细胞更易于受到链霉素的损害。
, http://www.100md.com
三、讨论
氨基糖甙类抗生素阻断神经肌肉接头传导的能力与其阻断神经末梢的钙通道有关[2]，Dulon等[3]报告，当预先以氨基糖甙类抗生素处理耳蜗外毛细胞后，外毛细胞则失去对高钾刺激时细胞内钙升高的反应能力，并认为这和氨基糖甙类抗生素的急性耳毒性作用有关，但该研究没有回答氨基糖甙类药物的浓度及不同部位外毛细胞与急性耳毒性的关系。本实验证实，不同浓度的硫酸链霉素对高钾细胞外液灌流所致的OHC[Ca2+]i升高效应的阻断作用差异明显，表现为典型的浓度依赖性；相同浓度的硫酸链霉素对来源于顶回和底回的外毛细胞的阻断作用差异也具有极显著性，即后者较前者对硫酸链霉素的耳毒性更敏感。这一结果提示，氨基糖甙类药物的耳毒性先表现为高频听力损害及其与用药剂量的依赖性有其内在的分子生物学基础。
基金项目: 国家自然科学基金资助课题(39670778), 军队杰出青年人才基金资助课题
, 百拇医药
参考文献
1，李树华，韩东一，杨伟炎，等. 水杨酸钠对豚鼠耳蜗单离外毛细胞游离钙离子浓度的影响及其调控机制研究.中华耳鼻咽喉科杂志, 2000, 35:263-266.
2，Atchison WD, Adgate L, Beaman CM. Effects of antibiotics on uptake of calcium into isolated nerve terminals. J Pharmacol Exp Ther, 1988,245:394-401.
3，Dulon D, Zajic G, Aran JM, et al. Aminoglycoside antibiotics impair calcium entry but not viability and motility in isolated cochlear outer hair cells. J Neurosci Res, 1989,24:338-346.
(收稿日期：2000-01-26), 百拇医药