猴病毒40T抗原和P53蛋白在毛丝鼠中耳上皮细胞系的表达及其意义
作者：金顺吉 金永德 崔哲洙
单位：133000 吉林省延吉市 延边大学医学院附属医院耳鼻咽喉科
关键词：多瘤病毒；猕猴；抗原；多瘤病毒转化；蛋白质P53；细胞；培养的；细胞系
中华耳鼻咽喉科杂志000506 【摘要】 目的 证实猴病毒40(simian virus40，SV40)T抗原(large T-antigen, TAg)和P53蛋白在毛丝鼠(chinchilla)中耳上皮细胞系细胞核内的表达,初步探讨它们在细胞无限增殖(immortalization)过程中的作用。方法 应用免疫荧光组织化学原理，分别检测SV40TAg和P53蛋白在培养液内注入腺病毒12-猴病毒40混合病毒(实验组)及未在培养液内注入上述病毒(对照组)的体外培养毛丝鼠中耳上皮细胞核内的表达。结果 实验组的8个培养皿中，1个培养皿内的细胞核内表达SV40TAg和P53蛋白，且已持续培养46代以上，形成细胞系；其余7个培养皿内的细胞和对照组细胞核内均不表达SV40TAg和P53蛋白，且培养到6～8代时均自行凋亡。结论 SV40TAg和P53蛋白在细胞无限增殖过程中起重要的作用；它们在细胞核内的表达对毛丝鼠中耳上皮细胞系的建立可能具有密切的相关性。
, 百拇医药
Expression of simian virus 40 large T-antigen and p53 protein in chinchilla middle ear epithelial cell line and its significance
JIN Shunji JIN Yongde CUI Zhezhu
(Department of Otorhynolaryngology, Medical College Hospital, Yanbian University. Yanji, Jilin 133000, China)
【Abstract】 Objective To identify the expression of simian virus 40 large T-antigen (SV40TAg) and p53 protein in the cell nuclei of chinchilla middle ear epithelial cell line and explore the significance of the expression. Method To examine the expression of SV40TAg and p53 protein in cell nuclei of chinchilla middle ear epithelial cell which had been infected and had not been infected with Ad 12-SV40 hybrid virus by immunocytochemistry method. Results All of the cell nuclei in 1 of 8 culturing dishes which infected with the Ad12-SV40 virus expressed the SV40TAg and p53 protein and had cultured over 46 passages. They have become a cell line. All of the cells in rest 7 culturing dishes and the control cells did not express the SV40TAg and p53 protein in their nuclei and died after culturing 6 - 8 passages. Conclusion The SV40TAg and p53 protein play some important role in process of cell immortalization. The expression of SV40TAg and p53 protein in cell nuclei of CMEE - 1 cell line has close interrelations with establishing the CMEE - 1 cell line.
, 百拇医药
【Key words】 Polyomavirus macacae； Antigens, polyomavirus transforming； Protein p53；Cells,cultured； Cell line
毛丝鼠(chinchilla)中耳上皮细胞在体外培养并应用于中耳炎病因和病理的细胞生物学和分子生物学方面的研究时与其他的体细胞一样，由于其有限的寿命、有限的繁殖能力和成纤维细胞的污染，受到很多的限制。1996年我们利用腺病毒12(adenovirus 12，Ad12)和 猴病毒40(simian virus40，SV40)混合病毒建立的毛丝鼠中耳上皮细胞系，在很大程度上克服了毛丝鼠中耳上皮细胞在体外培养和应用时的种种缺陷，为中耳炎病因学和病理学的研究开辟了一条经济、简便的研究途径。目前，使细胞能够无限增殖(immortalization)而建立细胞系的最常用生物制剂是SV40，而SV40的T抗原(large T-antigen, TAg)是否已转染到细胞核内是建立细胞系成败的关键。我们利用免疫荧光组织化学方法检验出了利用Ad12-SV40混合病毒建立的毛丝鼠中耳上皮细胞系细胞核中存在的SV40TAg和P53蛋白。
, 百拇医药
材料和方法
1.材料来源：使用16只健康毛丝鼠鼓室粘膜的碎片进行细胞培养，7 d后在显微镜下刮除梭状细胞，12 d后筛选出生长初代上皮细胞而无梭状成纤维细胞的14个培养皿，淘汰其余50余个有污染而不易取净的培养皿。
2.分组：实验组在有初代毛丝鼠中耳上皮细胞生长的8个培养皿的培养液内分别注入0.3 ml Ad12-SV40混合病毒液体(1∶10稀释液)，保持3 d，然后按常规体外细胞培养方法培养4周的毛丝鼠中耳上皮细胞；对照组6个培养皿内生长的初代毛丝鼠中耳上皮细胞的培养液内未注入Ad12-SV40混合病毒。
3.培养液成分：达尔克必需基本培养基(Dulbecco′s modified eagle medium,DMEM)培养液300 ml、 Ham′s F12营养液 100 ml、10% 小牛血清(Gibco公司，美国)，氢化可的松0.4 mg/L、异丙肾上腺素10-6 mol/L、青霉素100 U/ml、链霉素100 U/ml、两性霉素0.25 mg/L(Sigma公司，美国)。
, 百拇医药
4.细胞培养：实验组培养皿内注入病毒4周后，将生长有实验组和对照组毛丝鼠中耳上皮细胞的培养皿内的培养液吸除后，用磷酸缓冲液(phosphatic buffer saline，PBS)洗一次，加入0.25%胰蛋白酶液1 ml，放入培养箱5 min(36.5℃)，待细胞完全胰酶化，既轻轻晃动培养皿时细胞层分散成单个的圆形细胞，然后离心并去掉上清液。加入培养液成1×103/ml细胞悬浮液。将0.5 ml细胞悬浮液注于放在细胞培养皿内的培养玻片上，并向细胞培养皿内注入培养液，放入5%二氧化碳培养箱内(37℃)，培养5 d。
5.抗体：一抗采用鼠SV40TAg单克隆抗体和鼠P53蛋白单克隆抗体(Oncogene Research Products,Cambrige,MA,美国)。二抗采用了附有荧光素的山羊抗鼠IgG(Sigma公司，美国)。
6.免疫组化反应及观察：将培养皿内的附着有实验组和对照组细胞的培养玻片取出，用10%甲醇固定细胞(-20℃)，自然干燥后用PBS洗一次。加入10% 山羊血清,放入恒温箱30 min(37℃)，以封闭非特异性抗原。再用PBS洗净多余血清后加入一抗，放在恒温箱内(37℃)1 h。取出后用PBS洗2次，加入二抗，放入恒温箱内(37℃)1 h。用PBS洗净多余抗体，将培养玻片固定于一般载玻片上。24 h后待固定胶干燥，在暗室用免疫荧光显微镜(Zeiss, Axiovert 135)观察，并拍摄照片。
, 百拇医药
结果
培养4周后，实验组的8个培养皿中的1个培养皿内的细胞繁殖迅速，细胞密度明显高于其他7个培养皿和对照组培养皿，且细胞核内均表达SV40TAg (图1a)和 P53蛋白(图1b)。此细胞株已持续培养46代以上,仍具有旺盛的繁殖能力，可持续培养，成为毛丝鼠中耳上皮细胞系。但其余7个培养皿中的细胞和对照组6个培养皿中的细胞繁殖缓慢，细胞密度稀疏，且细胞核内均不表达SV40TAg 和p53 蛋白(图1c、d)，培养到6～8 代时均自行凋亡。
讨论
在实验组培养的1株毛丝鼠中耳上皮细胞的传代次数已超过20代以上，20代以后仍然具有旺盛的繁殖能力，而且建立细胞株时应用的SV40TAg已在细胞核内表达，证明我们培养的毛丝鼠中耳上皮细胞系形成。此细胞系在传代过程中未发现形态上的遗传形状改变。
尽管有很多的生物学制剂被用于体外培养细胞的无限增殖，从而建立细胞系，但最广泛地被应用的是SV40，其主要作用是由SV40TAg起到的[1]。SV40TAg是SV40染色体组“早期”部位(early region)复制出的3种蛋白质之一，这种蛋白质已确认有诸多的生物学特性，如：在细胞核内的局限性、与p53基因产物的结合、延长细胞的寿命等[2]。虽然，已发现SV40TAg 诱导体外培养的体细胞产生无限增殖现象，但SV40TAg如何进入细胞核内的机制尚不完全清楚。SV40TAg 诱导细胞无限增殖时，人类成纤维细胞发生的比率约是千万分之1～3个[3]；在哺乳类动物上皮细胞发生的比率是十万分之一[4]。
, 百拇医药
在本实验中下列2种现象值得注意：
1.毛丝鼠中耳上皮细胞系细胞持续繁殖与其核内表达SV40TAg有关。在建立本细胞系的过程中，注入了Ad12-SV40混合病毒于培养液内的8个培养皿中，只有1个培养皿内的细胞表达SV40TAg,且此培养皿内的细胞繁殖迅速而持续，已培养46代以上，仍具有旺盛的繁殖能力，成为毛丝鼠中耳上皮细胞系。其他7个培养皿内的细胞与对照组培养皿内的细胞一样，不表达SV40TAg,繁殖缓慢，培养到6～8代时自行凋亡。这种现象与Radna等[5]的发现是吻合的；而发生比率也和Shay等[4]的描述是相吻合的。据此推测，尽管培养液内存在SV40TAg,但其没有转染到细胞核内而不表达时，细胞不会持续繁殖，而最终凋亡。也就是说，SV40TAg在细胞核内表达可能是使用SV40建立毛丝鼠中耳细胞系持续性繁殖和形成细胞系的必要条件。
2.在本实验中毛丝鼠中耳上皮细胞系细胞在表达SV40TAg的同时表达P53蛋白。Lane等[6]认为SV40TAg与P53蛋白的结合，对延长人类成纤维细胞的繁殖趋势是必要的。P53蛋白是动物细胞染色体中的p53基因的产物，其在细胞周期中起关键性的负向调节作用。正常细胞中的野生型P53蛋白的半衰期短(约20 min左右)，核内的含量极少，免疫组化无法检出。故在正常的毛丝鼠中耳上皮细胞内无法检出。但在某种因素的作用下，P53蛋白发生突变时，半衰期明显延长，且聚集在细胞核内，免疫组化实验中可测出[7]。故在本实验中，毛丝鼠中耳上皮细胞株细胞核内的P53 蛋白表达本身就说明其已突变。根据本组实验中P53蛋白表达的事实推测：SV40TAg进入毛丝鼠中耳上皮细胞系细胞核内后，可能与野生型P53蛋白结合，引起突变，产生突变型P53蛋白，半衰期延长，且聚集在核内，在实验中可以测出。这种突变型P53蛋白在核内的半衰期明显增长，免疫组化实验中可检出。突变型P53蛋白可能失去了在细胞周期中的负向调节作用，使体外培养的毛丝鼠中耳上皮细胞发生持续而迅速的繁殖，形成细胞系。虽然培养液内存在SV40TAg,但其没有转染到细胞核内而不表达时，P53蛋白不发生突变，细胞核内只存在野生型P53蛋白。在野生型P53蛋白的细胞周期中的负向调节作用下，上皮细胞不能持续繁殖而凋亡。因此，SV40TAg诱导毛丝鼠中耳上皮细胞的无限增殖，而建立毛丝鼠中耳上皮细胞系与 ①毛丝鼠中耳上皮细胞系细胞核内表达SV40TAg； ②SV40TAg 和P53蛋白的结合；③ P53蛋白发生突变,产生突变型P53蛋白有密切的相关性。目前，SV40TAg 如何进入细胞核内，如何与P53蛋白结合等分子生物学机制尚不十分清楚。这也是我们今后继续研究的课题。
, 百拇医药
图1 免疫荧光组织化学反应中SV40TAg 和P53 蛋白的表达。 × 630 a 毛丝鼠中耳上皮细胞系细胞核内 SV40TAg 单克隆抗体的荧光素的阳性反应； b 毛丝鼠中耳上皮细胞系细胞核内 P53 蛋白单克隆抗体的荧光素的阳性反应； c 对照组毛丝鼠中耳上皮细胞核内SV40TAg 单克隆抗体的荧光素的阴性反应； d 对照组毛丝鼠中耳上皮细胞核内P53蛋白单克隆抗体的荧光素的阴性反应
参考文献
1，Bryan TM, Reddel RR. SV40-induced immortalization of human cells. Crit Rev Oncog, 1994: 5 : 331-357.
2，Fanning E, Knippers R. Structure and function of simian virus 40 large tumor antigen. Annu Rev Biochem, 1992, 61: 55-85.
, 百拇医药
3，Huschtscha LI, Holliday R. Limited and unlimited growth of SV40-transformed cells from human diploid MRC-5 fibroblasts. J Cell Sci, 1983, 63:77-99.
4，Shay JW, Van Der Haegen BA, Ying Y et al. The frequency of immortalization of human fibroblasts and mammary epithelial cells transfected with SV40 lager T-antigen. Exp Cell Res, 1993, 209:45-52.
5，Radna RL, Caton YK, Jha K, et al. Growth of immortal simian virus 40 tsA-transformed human fibroblasts is temperature dependent. Mol Cell Biol, 1989, 9: 3093-3096.
6，Lane DP, Crawford LV. T antigen is bound to a host protein in SV40-transformed cells. Nature, 1979, 278: 261-263.
7，王进，李延华，吴正鸿. 简述喉癌的研究进展. 临床耳鼻咽喉科杂志, 1999,13:142-143.
(收稿日期：2000-04-10), 百拇医药
单位：133000 吉林省延吉市 延边大学医学院附属医院耳鼻咽喉科
关键词：多瘤病毒；猕猴；抗原；多瘤病毒转化；蛋白质P53；细胞；培养的；细胞系
中华耳鼻咽喉科杂志000506 【摘要】 目的 证实猴病毒40(simian virus40，SV40)T抗原(large T-antigen, TAg)和P53蛋白在毛丝鼠(chinchilla)中耳上皮细胞系细胞核内的表达,初步探讨它们在细胞无限增殖(immortalization)过程中的作用。方法 应用免疫荧光组织化学原理，分别检测SV40TAg和P53蛋白在培养液内注入腺病毒12-猴病毒40混合病毒(实验组)及未在培养液内注入上述病毒(对照组)的体外培养毛丝鼠中耳上皮细胞核内的表达。结果 实验组的8个培养皿中，1个培养皿内的细胞核内表达SV40TAg和P53蛋白，且已持续培养46代以上，形成细胞系；其余7个培养皿内的细胞和对照组细胞核内均不表达SV40TAg和P53蛋白，且培养到6～8代时均自行凋亡。结论 SV40TAg和P53蛋白在细胞无限增殖过程中起重要的作用；它们在细胞核内的表达对毛丝鼠中耳上皮细胞系的建立可能具有密切的相关性。
, 百拇医药
Expression of simian virus 40 large T-antigen and p53 protein in chinchilla middle ear epithelial cell line and its significance
JIN Shunji JIN Yongde CUI Zhezhu
(Department of Otorhynolaryngology, Medical College Hospital, Yanbian University. Yanji, Jilin 133000, China)
【Abstract】 Objective To identify the expression of simian virus 40 large T-antigen (SV40TAg) and p53 protein in the cell nuclei of chinchilla middle ear epithelial cell line and explore the significance of the expression. Method To examine the expression of SV40TAg and p53 protein in cell nuclei of chinchilla middle ear epithelial cell which had been infected and had not been infected with Ad 12-SV40 hybrid virus by immunocytochemistry method. Results All of the cell nuclei in 1 of 8 culturing dishes which infected with the Ad12-SV40 virus expressed the SV40TAg and p53 protein and had cultured over 46 passages. They have become a cell line. All of the cells in rest 7 culturing dishes and the control cells did not express the SV40TAg and p53 protein in their nuclei and died after culturing 6 - 8 passages. Conclusion The SV40TAg and p53 protein play some important role in process of cell immortalization. The expression of SV40TAg and p53 protein in cell nuclei of CMEE - 1 cell line has close interrelations with establishing the CMEE - 1 cell line.
, 百拇医药
【Key words】 Polyomavirus macacae； Antigens, polyomavirus transforming； Protein p53；Cells,cultured； Cell line
毛丝鼠(chinchilla)中耳上皮细胞在体外培养并应用于中耳炎病因和病理的细胞生物学和分子生物学方面的研究时与其他的体细胞一样，由于其有限的寿命、有限的繁殖能力和成纤维细胞的污染，受到很多的限制。1996年我们利用腺病毒12(adenovirus 12，Ad12)和 猴病毒40(simian virus40，SV40)混合病毒建立的毛丝鼠中耳上皮细胞系，在很大程度上克服了毛丝鼠中耳上皮细胞在体外培养和应用时的种种缺陷，为中耳炎病因学和病理学的研究开辟了一条经济、简便的研究途径。目前，使细胞能够无限增殖(immortalization)而建立细胞系的最常用生物制剂是SV40，而SV40的T抗原(large T-antigen, TAg)是否已转染到细胞核内是建立细胞系成败的关键。我们利用免疫荧光组织化学方法检验出了利用Ad12-SV40混合病毒建立的毛丝鼠中耳上皮细胞系细胞核中存在的SV40TAg和P53蛋白。
, 百拇医药
材料和方法
1.材料来源：使用16只健康毛丝鼠鼓室粘膜的碎片进行细胞培养，7 d后在显微镜下刮除梭状细胞，12 d后筛选出生长初代上皮细胞而无梭状成纤维细胞的14个培养皿，淘汰其余50余个有污染而不易取净的培养皿。
2.分组：实验组在有初代毛丝鼠中耳上皮细胞生长的8个培养皿的培养液内分别注入0.3 ml Ad12-SV40混合病毒液体(1∶10稀释液)，保持3 d，然后按常规体外细胞培养方法培养4周的毛丝鼠中耳上皮细胞；对照组6个培养皿内生长的初代毛丝鼠中耳上皮细胞的培养液内未注入Ad12-SV40混合病毒。
3.培养液成分：达尔克必需基本培养基(Dulbecco′s modified eagle medium,DMEM)培养液300 ml、 Ham′s F12营养液 100 ml、10% 小牛血清(Gibco公司，美国)，氢化可的松0.4 mg/L、异丙肾上腺素10-6 mol/L、青霉素100 U/ml、链霉素100 U/ml、两性霉素0.25 mg/L(Sigma公司，美国)。
, 百拇医药
4.细胞培养：实验组培养皿内注入病毒4周后，将生长有实验组和对照组毛丝鼠中耳上皮细胞的培养皿内的培养液吸除后，用磷酸缓冲液(phosphatic buffer saline，PBS)洗一次，加入0.25%胰蛋白酶液1 ml，放入培养箱5 min(36.5℃)，待细胞完全胰酶化，既轻轻晃动培养皿时细胞层分散成单个的圆形细胞，然后离心并去掉上清液。加入培养液成1×103/ml细胞悬浮液。将0.5 ml细胞悬浮液注于放在细胞培养皿内的培养玻片上，并向细胞培养皿内注入培养液，放入5%二氧化碳培养箱内(37℃)，培养5 d。
5.抗体：一抗采用鼠SV40TAg单克隆抗体和鼠P53蛋白单克隆抗体(Oncogene Research Products,Cambrige,MA,美国)。二抗采用了附有荧光素的山羊抗鼠IgG(Sigma公司，美国)。
6.免疫组化反应及观察：将培养皿内的附着有实验组和对照组细胞的培养玻片取出，用10%甲醇固定细胞(-20℃)，自然干燥后用PBS洗一次。加入10% 山羊血清,放入恒温箱30 min(37℃)，以封闭非特异性抗原。再用PBS洗净多余血清后加入一抗，放在恒温箱内(37℃)1 h。取出后用PBS洗2次，加入二抗，放入恒温箱内(37℃)1 h。用PBS洗净多余抗体，将培养玻片固定于一般载玻片上。24 h后待固定胶干燥，在暗室用免疫荧光显微镜(Zeiss, Axiovert 135)观察，并拍摄照片。
, 百拇医药
结果
培养4周后，实验组的8个培养皿中的1个培养皿内的细胞繁殖迅速，细胞密度明显高于其他7个培养皿和对照组培养皿，且细胞核内均表达SV40TAg (图1a)和 P53蛋白(图1b)。此细胞株已持续培养46代以上,仍具有旺盛的繁殖能力，可持续培养，成为毛丝鼠中耳上皮细胞系。但其余7个培养皿中的细胞和对照组6个培养皿中的细胞繁殖缓慢，细胞密度稀疏，且细胞核内均不表达SV40TAg 和p53 蛋白(图1c、d)，培养到6～8 代时均自行凋亡。
讨论
在实验组培养的1株毛丝鼠中耳上皮细胞的传代次数已超过20代以上，20代以后仍然具有旺盛的繁殖能力，而且建立细胞株时应用的SV40TAg已在细胞核内表达，证明我们培养的毛丝鼠中耳上皮细胞系形成。此细胞系在传代过程中未发现形态上的遗传形状改变。
尽管有很多的生物学制剂被用于体外培养细胞的无限增殖，从而建立细胞系，但最广泛地被应用的是SV40，其主要作用是由SV40TAg起到的[1]。SV40TAg是SV40染色体组“早期”部位(early region)复制出的3种蛋白质之一，这种蛋白质已确认有诸多的生物学特性，如：在细胞核内的局限性、与p53基因产物的结合、延长细胞的寿命等[2]。虽然，已发现SV40TAg 诱导体外培养的体细胞产生无限增殖现象，但SV40TAg如何进入细胞核内的机制尚不完全清楚。SV40TAg 诱导细胞无限增殖时，人类成纤维细胞发生的比率约是千万分之1～3个[3]；在哺乳类动物上皮细胞发生的比率是十万分之一[4]。
, 百拇医药
在本实验中下列2种现象值得注意：
1.毛丝鼠中耳上皮细胞系细胞持续繁殖与其核内表达SV40TAg有关。在建立本细胞系的过程中，注入了Ad12-SV40混合病毒于培养液内的8个培养皿中，只有1个培养皿内的细胞表达SV40TAg,且此培养皿内的细胞繁殖迅速而持续，已培养46代以上，仍具有旺盛的繁殖能力，成为毛丝鼠中耳上皮细胞系。其他7个培养皿内的细胞与对照组培养皿内的细胞一样，不表达SV40TAg,繁殖缓慢，培养到6～8代时自行凋亡。这种现象与Radna等[5]的发现是吻合的；而发生比率也和Shay等[4]的描述是相吻合的。据此推测，尽管培养液内存在SV40TAg,但其没有转染到细胞核内而不表达时，细胞不会持续繁殖，而最终凋亡。也就是说，SV40TAg在细胞核内表达可能是使用SV40建立毛丝鼠中耳细胞系持续性繁殖和形成细胞系的必要条件。
2.在本实验中毛丝鼠中耳上皮细胞系细胞在表达SV40TAg的同时表达P53蛋白。Lane等[6]认为SV40TAg与P53蛋白的结合，对延长人类成纤维细胞的繁殖趋势是必要的。P53蛋白是动物细胞染色体中的p53基因的产物，其在细胞周期中起关键性的负向调节作用。正常细胞中的野生型P53蛋白的半衰期短(约20 min左右)，核内的含量极少，免疫组化无法检出。故在正常的毛丝鼠中耳上皮细胞内无法检出。但在某种因素的作用下，P53蛋白发生突变时，半衰期明显延长，且聚集在细胞核内，免疫组化实验中可测出[7]。故在本实验中，毛丝鼠中耳上皮细胞株细胞核内的P53 蛋白表达本身就说明其已突变。根据本组实验中P53蛋白表达的事实推测：SV40TAg进入毛丝鼠中耳上皮细胞系细胞核内后，可能与野生型P53蛋白结合，引起突变，产生突变型P53蛋白，半衰期延长，且聚集在核内，在实验中可以测出。这种突变型P53蛋白在核内的半衰期明显增长，免疫组化实验中可检出。突变型P53蛋白可能失去了在细胞周期中的负向调节作用，使体外培养的毛丝鼠中耳上皮细胞发生持续而迅速的繁殖，形成细胞系。虽然培养液内存在SV40TAg,但其没有转染到细胞核内而不表达时，P53蛋白不发生突变，细胞核内只存在野生型P53蛋白。在野生型P53蛋白的细胞周期中的负向调节作用下，上皮细胞不能持续繁殖而凋亡。因此，SV40TAg诱导毛丝鼠中耳上皮细胞的无限增殖，而建立毛丝鼠中耳上皮细胞系与 ①毛丝鼠中耳上皮细胞系细胞核内表达SV40TAg； ②SV40TAg 和P53蛋白的结合；③ P53蛋白发生突变,产生突变型P53蛋白有密切的相关性。目前，SV40TAg 如何进入细胞核内，如何与P53蛋白结合等分子生物学机制尚不十分清楚。这也是我们今后继续研究的课题。
, 百拇医药
图1 免疫荧光组织化学反应中SV40TAg 和P53 蛋白的表达。 × 630 a 毛丝鼠中耳上皮细胞系细胞核内 SV40TAg 单克隆抗体的荧光素的阳性反应； b 毛丝鼠中耳上皮细胞系细胞核内 P53 蛋白单克隆抗体的荧光素的阳性反应； c 对照组毛丝鼠中耳上皮细胞核内SV40TAg 单克隆抗体的荧光素的阴性反应； d 对照组毛丝鼠中耳上皮细胞核内P53蛋白单克隆抗体的荧光素的阴性反应
参考文献
1，Bryan TM, Reddel RR. SV40-induced immortalization of human cells. Crit Rev Oncog, 1994: 5 : 331-357.
2，Fanning E, Knippers R. Structure and function of simian virus 40 large tumor antigen. Annu Rev Biochem, 1992, 61: 55-85.
, 百拇医药
3，Huschtscha LI, Holliday R. Limited and unlimited growth of SV40-transformed cells from human diploid MRC-5 fibroblasts. J Cell Sci, 1983, 63:77-99.
4，Shay JW, Van Der Haegen BA, Ying Y et al. The frequency of immortalization of human fibroblasts and mammary epithelial cells transfected with SV40 lager T-antigen. Exp Cell Res, 1993, 209:45-52.
5，Radna RL, Caton YK, Jha K, et al. Growth of immortal simian virus 40 tsA-transformed human fibroblasts is temperature dependent. Mol Cell Biol, 1989, 9: 3093-3096.
6，Lane DP, Crawford LV. T antigen is bound to a host protein in SV40-transformed cells. Nature, 1979, 278: 261-263.
7，王进，李延华，吴正鸿. 简述喉癌的研究进展. 临床耳鼻咽喉科杂志, 1999,13:142-143.
(收稿日期：2000-04-10), 百拇医药