豚鼠内耳微循环障碍对血迷路屏障通透性的影响
作者：张学渊 汪吉宝
单位：张学渊(400038 重庆 第三军医大学西南医院耳鼻咽喉科)；汪吉宝(同济医科大学协和医院耳鼻咽喉科)
关键词：迷路；耳蜗；微循环；毛细血管通透性；局部缺血
中华耳鼻咽喉科杂志000505 【摘要】 目的 研究豚鼠耳蜗微循环障碍动物模型的血迷路屏障通透性变化特点, 了解血迷路屏障通透性变化在内耳缺血性损伤中的可能作用。方法 采用光化学法建立豚鼠耳蜗微循障碍动物模型, 改良伊文蓝荧光法定量检测其血迷路屏障通透性变化特点。结果 豚鼠耳蜗发生微循环障碍后2 h和4 h, 伊文蓝通过血迷路屏障的量分别为每只(1.709±0.769) μg(x±s，下同)和(2.849±0.653) μg，t检验P<0.01。结论 豚鼠耳蜗发生微循环障碍后其血迷路屏障通透性明显增高，并随时间的延长而加重，可能是微循环障碍致内耳损伤的重要机制之一。
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Effects of microcirculatory disorders of inner ear on blood-labyrinth barrier permeability in guinea pigs
ZHANG Xueyuan WANG Jibao
(Department of Otorhinolaryngology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
【Abstract】 Objective To study the changes of blood-labyrinth barrier permeability during cochlea microcirculatory disorders in guinea pigs. Methods Using modified method of Evan′s blue fluorescence, the changes of permeability of blood-labyrinth barrier were observed in the animal model of cochlea microcirculatory disorders which was induced by photochemical reaction. Results Amount of Evan′s blue passing through the blood-labyrinth barrier was (1.709±0.769) μg per guinea pig after 2 hours and (2.849 ±0.653) μg per guinea pig after 4 hours when the cochlea was in microcirculatory disorder. Conclusion The results indicated that the permeability of blood-labyrinth barrier increased when cochlea microcirculatory disorders occurred and the increase of blood-labyrinth barrier permeability may be one of the important mechanisms which causes the cochlear ischemic lesions.
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【Key words】 Labyrinth； Cochlea； Microcirculation； Capillary permeability； Ischemia
内耳必须维持其内环境的相对稳定才能保特正常的生理功能，正常的微循环和血迷路屏障是维持并调节耳蜗内环境稳定的基础，任何破坏微循环和血迷路屏障的因素，均可能导致耳蜗内环境的变化，使耳蜗功能发生障碍[1-5]。已报告血脑屏障通透性增高是缺血性脑梗死的重要原因[6]，为探讨血迷路屏障通透性变化在微循环障碍致听力损伤机制中的作用，采用改良伊文蓝荧光法定量研究豚鼠耳蜗微循环障碍动物模型的血迷路屏障通透性变化特点，了解血迷路屏障通透性改变在微循环障碍致内耳损伤中的可能作用。
材料和方法
一、伊文蓝荧光法的建立
我们对Saria等[7]的伊文蓝荧光法进行了改良。
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1. 5 μg伊文蓝溶于1 ml甲酰胺溶液，同量甲酰胺溶液为空白对照，荧光分光光度计(日立 MPF-4，日本)扫描，确定最佳激发光的波长和波宽范围。
2. 取500 μg伊文蓝溶于2 ml甲酰胺中，梯度稀释，配制成不同浓度的标准管。用荧光分光光度计测定其相对荧光强度；用72-1型分光光度计测定其吸光度(A)；绘制标准工作曲线。
3. 耳蜗组织中伊文蓝回收率的测定：豚鼠离体耳蜗7只，用微量注射器经圆窗将伊文蓝(每只5 μg)注入各耳蜗内，置室温下0.5 h后，移于1 ml甲酰胺液中，放置24 h(50℃)，取浸出液测荧光值。
二、豚鼠耳蜗微循环障碍动物模型的血迷路屏障通透性变化检测
1. 实验组: 健康白色豚鼠18只，体重250～350 g，雌雄不限，耳廓反射正常；光化学法在豚鼠右耳诱导耳蜗微循环障碍[9]，将豚鼠随机分为2组：第1组(9只)：光化学诱导后立即经股静脉注射伊文蓝(40 mg/kg体重)，2 h后开胸，生理盐水经左心室灌注冲洗，直至右心房流出无色液体为止。断头取右侧听泡，将耳蜗置于1 ml甲酰胺中(50℃)24 h，取浸出液用荧光分光光度计测其荧光值，标准曲线工作法计算浸出液伊文蓝量。第2组(9只)：光化学诱导后2 h，经股静脉注入伊文蓝(40 mg/kg体重)，4 h后，同第1组处理。
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2. 对照组(10只)：除不使用光照射耳蜗外，其余处理同实验组。
结果
1. 伊文蓝甲酰胺液的激发光谱和荧光光谱(图1)：本实验条件下，其激发光峰值在635 nm处，荧光光谱峰值在687 nm处。故激发光以波长635 nm、波宽10 nm，发射光以波长687 nm、波宽8 nm为本实验荧光分光光度计的工作条件。
图1 伊文蓝甲酰胺溶液的激发光谱和荧光光谱
2. 伊文蓝甲酰胺液的荧光法标准曲线和比色法标准曲线(图2)：本实验条件下，伊文蓝荧光法检测下限为0.122 μg/ml，比色法检测下限为3.90 μg/ml，荧光法较比色法灵敏度高31.97倍。
, 百拇医药 3.耳蜗组织中伊文蓝的回收率：7只耳蜗测试，
图2 伊文蓝甲酰胺溶液荧光法标准曲线(A)和比色法(B)标准曲线
注入伊文蓝量每只5 μg，伊文蓝甲酰胺浸出液中伊文蓝量(
±s，下同)为每只(4.68±0.286) μg，其回收率为(93.33±5.51)%。
4.内耳血迷路屏障通透性的变化：①实验组光化学法诱导9只豚鼠耳蜗发生微循环障后2 h，通过血迷路屏障的伊文蓝为每只(1.709±0.769) μg，9只耳蜗微循环障后4 h的伊文蓝为每只(2.849±0.653) μg；两组比较采用t检验，t=3.390 4，大于t0.01(16)=2.921，P<0.01，2 h组和4 h组血迷路屏障通透性变化差异有非常显著性意义；②对照组10只动物荧光法检测未发现伊文蓝通过正常血迷路屏障。
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讨论
伊文蓝是由1分子重氮联甲苯胺与2分子1-氨基-8-萘酚-2、4-二磺酸相连接合成的生物染料，注入血管后可立即与血浆蛋白稳定结合，广泛用于血管通透性和血脑屏障通透性的研究[6，8]。传统的伊文蓝检测法有2种[8]：①将伊文蓝注入血管，如果血脑屏障通透性增强，伊文蓝即随血浆蛋白漏出并导致脑实质蓝染，通过肉眼观察即可初步了解血脑屏障通透性的变化；②由于伊文蓝在甲酰胺液中的溶解度高，且性质稳定，故用甲酰胺摄取漏入组织中的伊文蓝，再将伊文蓝甲酰胺溶液进行比色测定伊文蓝的含量。但比色法所需样本量较大且欠灵敏，而耳蜗组织较小，即使血迷路屏障通透性发生变化，其漏出量亦少，常在比色法检测下限之外，故伊文蓝比色法不能用于研究内耳血迷路屏障通透性的变化。
参照Saria等[7]伊文蓝荧光法并加以改良，建立了伊文蓝荧光法以定量研究内耳血迷路屏障通透性的变化。在本实验条件下，伊文蓝荧光法的检测下限为122 ng/ml，灵敏度是比色法的32倍。将5 μg伊文蓝用微量注射器注入离体耳蜗，测定甲酰胺从耳蜗组织中摄取伊文蓝的能力，其回收率为(93.33±5.51)%。结果表明，伊文蓝荧光法可用于内耳血迷路屏障通透性的研究。在预实验中发现，只要在取材前从左心室注入生理盐水，直至右心房流出无色液体为止，则所测结果是可靠的，且每次实验均建立标准工作曲线，亦可排除其他因素的干扰。
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微循环障碍是内耳疾病的重要原因，然而迄今尚不清楚血迷路屏障功能改变在微循环障碍致内耳疾病机制中的可能作用。本实验提示：伊文蓝不能通过正常豚鼠血迷路屏障；在豚鼠耳蜗发生微循环障碍后，伊文蓝通过血迷路屏障的量随时间的延长而明显增加。在实验中观察活体豚鼠耳蜗时注意到，耳蜗发生微循环障碍后立即静脉内注入伊文蓝，30～60 min后耳蜗逐渐蓝染；耳蜗发生微循环障碍后120 min静脉注入伊文蓝者，10余分钟后耳蜗即明显蓝染。另文报告的形态学结果也表明[9,10]：豚鼠耳蜗发生微循环障碍后立即可见耳蜗外侧壁血管内皮细胞损伤，但内皮细胞膜和内皮细胞间连接完整，边缘细胞、中间细胞和基底细胞形态及细胞间连接均正常，可能此时其屏蔽血液中大分子物质通过血迷路屏障的能力尚存；在豚鼠耳蜗发生微循环障碍后5 min，耳蜗外侧壁微血管内皮细胞坏死脱落；15～30 min血管纹及螺旋韧带微血管周围间隙水肿，并随时间的延长而加重；24 h后蜗管明显积水；同样提示耳蜗发生微循环障碍后血迷路屏障通透性明显增加。
(本研究在武汉同济医科大学协和医院完成)
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参考文献
1，Juhn SK, Li W, Kim JY,et al. Effect of stress-related hormones on inner ear fluid homeostasis and function. Am J Otol, 1999, 20:800-806.
2，Juhn SK, Ikeda K, Morizono T,et al. Pathophysiology of inner ear fluid imbalance. Acta Otolaryngol, 1991, Suppl 485:9-14.
3，Juhn SK, Rybak LP. Labyrinthine barriers and cochlear homeostasis. Acta Otolaryngol,1981,91:529-534.
, http://www.100md.com
4，Hukee MJ, Duvall AJ . Cochlear vessel permeability to horseradish peroxidase in the normal and acoustically traumatized chinchilla: a reevaluation. Ann Otol Rhinol Laryngol,1985,94:297-303.
5，Sakagami M, Sano M, Harada T, et al. Morphological study of blood-labyrinth barrier in the vestibular organs under normal and experimental acute hypertensive and acute hypotensive conditions. Acta Otolaryngol, 1986,101:165-171.
6，Dietrich WD, Watson BD, Busto R, et al. Photochemically induced cerebral infarction.I.Early microvascular alterations. Acta Neuropathol, 1987, 72:315-325.
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7，Saria A, Lundberg JM. Evans blue fluorescence: quantitative and morphological evaluation of vascular permeability in animal tissues. J Neurosci Methods, 1983,8:41-49.
8，田牛. 微循环方法学. 北京: 原子能出版社, 1993. 47-48.
9，张学渊, 汪吉宝. 光化学法建立豚鼠耳蜗微循环障碍模型的初步报告. 中华耳鼻咽喉科杂志，1995，30：285-287.
10，张学渊, 汪吉宝. 光化学诱导豚鼠耳蜗微血栓形成的超微病理研究. 临床耳鼻咽喉科杂志, 1995,9:13-14.
(收稿日期：2000-04-10), 百拇医药
单位：张学渊(400038 重庆 第三军医大学西南医院耳鼻咽喉科)；汪吉宝(同济医科大学协和医院耳鼻咽喉科)
关键词：迷路；耳蜗；微循环；毛细血管通透性；局部缺血
中华耳鼻咽喉科杂志000505 【摘要】 目的 研究豚鼠耳蜗微循环障碍动物模型的血迷路屏障通透性变化特点, 了解血迷路屏障通透性变化在内耳缺血性损伤中的可能作用。方法 采用光化学法建立豚鼠耳蜗微循障碍动物模型, 改良伊文蓝荧光法定量检测其血迷路屏障通透性变化特点。结果 豚鼠耳蜗发生微循环障碍后2 h和4 h, 伊文蓝通过血迷路屏障的量分别为每只(1.709±0.769) μg(x±s，下同)和(2.849±0.653) μg，t检验P<0.01。结论 豚鼠耳蜗发生微循环障碍后其血迷路屏障通透性明显增高，并随时间的延长而加重，可能是微循环障碍致内耳损伤的重要机制之一。
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Effects of microcirculatory disorders of inner ear on blood-labyrinth barrier permeability in guinea pigs
ZHANG Xueyuan WANG Jibao
(Department of Otorhinolaryngology, Southwest Hospital, Third Military Medical University, Chongqing 400038, China)
【Abstract】 Objective To study the changes of blood-labyrinth barrier permeability during cochlea microcirculatory disorders in guinea pigs. Methods Using modified method of Evan′s blue fluorescence, the changes of permeability of blood-labyrinth barrier were observed in the animal model of cochlea microcirculatory disorders which was induced by photochemical reaction. Results Amount of Evan′s blue passing through the blood-labyrinth barrier was (1.709±0.769) μg per guinea pig after 2 hours and (2.849 ±0.653) μg per guinea pig after 4 hours when the cochlea was in microcirculatory disorder. Conclusion The results indicated that the permeability of blood-labyrinth barrier increased when cochlea microcirculatory disorders occurred and the increase of blood-labyrinth barrier permeability may be one of the important mechanisms which causes the cochlear ischemic lesions.
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【Key words】 Labyrinth； Cochlea； Microcirculation； Capillary permeability； Ischemia
内耳必须维持其内环境的相对稳定才能保特正常的生理功能，正常的微循环和血迷路屏障是维持并调节耳蜗内环境稳定的基础，任何破坏微循环和血迷路屏障的因素，均可能导致耳蜗内环境的变化，使耳蜗功能发生障碍[1-5]。已报告血脑屏障通透性增高是缺血性脑梗死的重要原因[6]，为探讨血迷路屏障通透性变化在微循环障碍致听力损伤机制中的作用，采用改良伊文蓝荧光法定量研究豚鼠耳蜗微循环障碍动物模型的血迷路屏障通透性变化特点，了解血迷路屏障通透性改变在微循环障碍致内耳损伤中的可能作用。
材料和方法
一、伊文蓝荧光法的建立
我们对Saria等[7]的伊文蓝荧光法进行了改良。
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1. 5 μg伊文蓝溶于1 ml甲酰胺溶液，同量甲酰胺溶液为空白对照，荧光分光光度计(日立 MPF-4，日本)扫描，确定最佳激发光的波长和波宽范围。
2. 取500 μg伊文蓝溶于2 ml甲酰胺中，梯度稀释，配制成不同浓度的标准管。用荧光分光光度计测定其相对荧光强度；用72-1型分光光度计测定其吸光度(A)；绘制标准工作曲线。
3. 耳蜗组织中伊文蓝回收率的测定：豚鼠离体耳蜗7只，用微量注射器经圆窗将伊文蓝(每只5 μg)注入各耳蜗内，置室温下0.5 h后，移于1 ml甲酰胺液中，放置24 h(50℃)，取浸出液测荧光值。
二、豚鼠耳蜗微循环障碍动物模型的血迷路屏障通透性变化检测
1. 实验组: 健康白色豚鼠18只，体重250～350 g，雌雄不限，耳廓反射正常；光化学法在豚鼠右耳诱导耳蜗微循环障碍[9]，将豚鼠随机分为2组：第1组(9只)：光化学诱导后立即经股静脉注射伊文蓝(40 mg/kg体重)，2 h后开胸，生理盐水经左心室灌注冲洗，直至右心房流出无色液体为止。断头取右侧听泡，将耳蜗置于1 ml甲酰胺中(50℃)24 h，取浸出液用荧光分光光度计测其荧光值，标准曲线工作法计算浸出液伊文蓝量。第2组(9只)：光化学诱导后2 h，经股静脉注入伊文蓝(40 mg/kg体重)，4 h后，同第1组处理。
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2. 对照组(10只)：除不使用光照射耳蜗外，其余处理同实验组。
结果
1. 伊文蓝甲酰胺液的激发光谱和荧光光谱(图1)：本实验条件下，其激发光峰值在635 nm处，荧光光谱峰值在687 nm处。故激发光以波长635 nm、波宽10 nm，发射光以波长687 nm、波宽8 nm为本实验荧光分光光度计的工作条件。
图1 伊文蓝甲酰胺溶液的激发光谱和荧光光谱
2. 伊文蓝甲酰胺液的荧光法标准曲线和比色法标准曲线(图2)：本实验条件下，伊文蓝荧光法检测下限为0.122 μg/ml，比色法检测下限为3.90 μg/ml，荧光法较比色法灵敏度高31.97倍。
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图2 伊文蓝甲酰胺溶液荧光法标准曲线(A)和比色法(B)标准曲线
注入伊文蓝量每只5 μg，伊文蓝甲酰胺浸出液中伊文蓝量(
±s，下同)为每只(4.68±0.286) μg，其回收率为(93.33±5.51)%。4.内耳血迷路屏障通透性的变化：①实验组光化学法诱导9只豚鼠耳蜗发生微循环障后2 h，通过血迷路屏障的伊文蓝为每只(1.709±0.769) μg，9只耳蜗微循环障后4 h的伊文蓝为每只(2.849±0.653) μg；两组比较采用t检验，t=3.390 4，大于t0.01(16)=2.921，P<0.01，2 h组和4 h组血迷路屏障通透性变化差异有非常显著性意义；②对照组10只动物荧光法检测未发现伊文蓝通过正常血迷路屏障。
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伊文蓝是由1分子重氮联甲苯胺与2分子1-氨基-8-萘酚-2、4-二磺酸相连接合成的生物染料，注入血管后可立即与血浆蛋白稳定结合，广泛用于血管通透性和血脑屏障通透性的研究[6，8]。传统的伊文蓝检测法有2种[8]：①将伊文蓝注入血管，如果血脑屏障通透性增强，伊文蓝即随血浆蛋白漏出并导致脑实质蓝染，通过肉眼观察即可初步了解血脑屏障通透性的变化；②由于伊文蓝在甲酰胺液中的溶解度高，且性质稳定，故用甲酰胺摄取漏入组织中的伊文蓝，再将伊文蓝甲酰胺溶液进行比色测定伊文蓝的含量。但比色法所需样本量较大且欠灵敏，而耳蜗组织较小，即使血迷路屏障通透性发生变化，其漏出量亦少，常在比色法检测下限之外，故伊文蓝比色法不能用于研究内耳血迷路屏障通透性的变化。
参照Saria等[7]伊文蓝荧光法并加以改良，建立了伊文蓝荧光法以定量研究内耳血迷路屏障通透性的变化。在本实验条件下，伊文蓝荧光法的检测下限为122 ng/ml，灵敏度是比色法的32倍。将5 μg伊文蓝用微量注射器注入离体耳蜗，测定甲酰胺从耳蜗组织中摄取伊文蓝的能力，其回收率为(93.33±5.51)%。结果表明，伊文蓝荧光法可用于内耳血迷路屏障通透性的研究。在预实验中发现，只要在取材前从左心室注入生理盐水，直至右心房流出无色液体为止，则所测结果是可靠的，且每次实验均建立标准工作曲线，亦可排除其他因素的干扰。
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微循环障碍是内耳疾病的重要原因，然而迄今尚不清楚血迷路屏障功能改变在微循环障碍致内耳疾病机制中的可能作用。本实验提示：伊文蓝不能通过正常豚鼠血迷路屏障；在豚鼠耳蜗发生微循环障碍后，伊文蓝通过血迷路屏障的量随时间的延长而明显增加。在实验中观察活体豚鼠耳蜗时注意到，耳蜗发生微循环障碍后立即静脉内注入伊文蓝，30～60 min后耳蜗逐渐蓝染；耳蜗发生微循环障碍后120 min静脉注入伊文蓝者，10余分钟后耳蜗即明显蓝染。另文报告的形态学结果也表明[9,10]：豚鼠耳蜗发生微循环障碍后立即可见耳蜗外侧壁血管内皮细胞损伤，但内皮细胞膜和内皮细胞间连接完整，边缘细胞、中间细胞和基底细胞形态及细胞间连接均正常，可能此时其屏蔽血液中大分子物质通过血迷路屏障的能力尚存；在豚鼠耳蜗发生微循环障碍后5 min，耳蜗外侧壁微血管内皮细胞坏死脱落；15～30 min血管纹及螺旋韧带微血管周围间隙水肿，并随时间的延长而加重；24 h后蜗管明显积水；同样提示耳蜗发生微循环障碍后血迷路屏障通透性明显增加。
(本研究在武汉同济医科大学协和医院完成)
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参考文献
1，Juhn SK, Li W, Kim JY,et al. Effect of stress-related hormones on inner ear fluid homeostasis and function. Am J Otol, 1999, 20:800-806.
2，Juhn SK, Ikeda K, Morizono T,et al. Pathophysiology of inner ear fluid imbalance. Acta Otolaryngol, 1991, Suppl 485:9-14.
3，Juhn SK, Rybak LP. Labyrinthine barriers and cochlear homeostasis. Acta Otolaryngol,1981,91:529-534.
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4，Hukee MJ, Duvall AJ . Cochlear vessel permeability to horseradish peroxidase in the normal and acoustically traumatized chinchilla: a reevaluation. Ann Otol Rhinol Laryngol,1985,94:297-303.
5，Sakagami M, Sano M, Harada T, et al. Morphological study of blood-labyrinth barrier in the vestibular organs under normal and experimental acute hypertensive and acute hypotensive conditions. Acta Otolaryngol, 1986,101:165-171.
6，Dietrich WD, Watson BD, Busto R, et al. Photochemically induced cerebral infarction.I.Early microvascular alterations. Acta Neuropathol, 1987, 72:315-325.
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7，Saria A, Lundberg JM. Evans blue fluorescence: quantitative and morphological evaluation of vascular permeability in animal tissues. J Neurosci Methods, 1983,8:41-49.
8，田牛. 微循环方法学. 北京: 原子能出版社, 1993. 47-48.
9，张学渊, 汪吉宝. 光化学法建立豚鼠耳蜗微循环障碍模型的初步报告. 中华耳鼻咽喉科杂志，1995，30：285-287.
10，张学渊, 汪吉宝. 光化学诱导豚鼠耳蜗微血栓形成的超微病理研究. 临床耳鼻咽喉科杂志, 1995,9:13-14.
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