用耳鸣动物模型评价药物治疗耳鸣效果
作者：王洪田 姜泗长 杨伟炎 韩东一
单位：100853 北京 解放军总医院耳鼻咽喉-头颈外科 解放军耳鼻咽喉科研究所
关键词：耳鸣；疾病模型；动物；水杨酸钠；条件反射；经典；行为；动物
中华耳鼻咽喉科杂志000503 【摘要】 目的 建立动物耳鸣的行为学模型，确认动物是否感觉到了耳鸣，并用该模型评价药物治疗效果。方法 雄性健康Wistar大鼠60只，平均分为10组：第Ⅰ、Ⅱ组为水杨酸组，皮下注射水杨酸钠每日350 mg/kg体重；第Ⅲ、Ⅳ组为生理盐水对照组；第Ⅴ、Ⅵ组为纯音组，用8 kHz、65 dB SPL的纯音代替水杨酸；第Ⅶ、Ⅷ组为尼莫地平组，注射水杨酸后再皮下注射尼莫地平每日1 mg/kg体重；第Ⅸ、Ⅹ组为骨参舒耳片组，注射水杨酸后给予骨参舒耳片剂5 g/kg体重。第Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ组是从条件反射建立前开始给予药物或纯音，第Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅷ、Ⅹ组从条件反射建立后开始给予药物或纯音。将禁水后非常渴的动物置于隔声室内进行条件反射训练。持续背景白噪声强度55 dB SPL，背景噪声随机停止为条件刺激，电击为非条件刺激。训练时给动物供水并记录吸水次数。经强化训练后形成“背景噪声停止-吸水减少或停止”的条件反射。不再给电击，观察条件反射的消除时间。结果 各组的消除时间分别为：第Ⅰ组5 d，第Ⅱ组2 d，第Ⅲ、Ⅳ组均为4 d，第Ⅴ组5 d、第Ⅵ组2 d，第Ⅶ组5 d，第Ⅷ组4 d，第Ⅸ组5 d，第Ⅹ组4 d。经双因素方差分析显示，各组之间和各训练时间(d)之间差异具有极显著性意义(P值均<0.001)。在此时间后动物吸水率完全恢复到适应训练前水平。可见大鼠确实感觉到了耳鸣，水杨酸诱发的声音感觉与纯音类似，尼莫地平和骨参舒耳片能够消除水杨酸诱发的耳鸣。结论 行为学模型的成功建立为动物耳鸣提供了有力证据，并为评价药物治疗效果提供了一种新的理想模型。
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Evaluating effects of some medicine on tinnitus with animal behavioral model in rats
WANG Hongtian JIANG Sichang YANG Weiyan
(Institute of Otorhinolaryngology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China)
【Abstract】 Objective To develop a valid behavioral animal model of tinnitus and to determine the animals whether have the perception of tinnitus and to evaluate effects of nimodipine and Chinese herbs on tinnitus using the behavioral model. Methods Adult male albino rats (n=60) were fell evenly and randomly into ten groups. Animals in Group Ⅰand Ⅱ were administrated sodium salicylate 350 mg/kg/d (i.p.). Instead, animals in control groups (Group Ⅲ and Ⅳ) were saline injected. Pure tone (8kHz, 65dBSPL) was given to rats in Group Ⅴand Ⅵ instead of sodium salicylate. Nimodipine (1 mg/kg) were administrated to animals in Group Ⅶand Ⅷ. Gushenshuerfang, one kind of Chinese herbs were administrated to animals in Group Ⅸ and Ⅹ. Medicine or pure tone were being given to all animals in GroupⅠ,Ⅲ,Ⅴ,Ⅶ,Ⅸbefore conditioned reflex. Animals in Group Ⅱ,Ⅳ,Ⅵ,Ⅷ,Ⅹ began to have medicine or pure tone after conditioned reflex. Thirsty animals (deprived of water for several days) were breeded in sound-proofed room and listened a persistent white noise (55 dB SPL) and trained daily with our instrument system, according to the procedure based on Pavlovian conditioned suppression paradigm. Subjects were permitted to lick water at an automatic dispenser during daily training sessions and the number of licks was recorded automatically. Noise offset (silence) was the conditioned stimulus and the electrical shock was the unconditioned stimulus. After two or three days training, subjects learnt rapidly to associate noise offset with shock and then established a behavioral conditioned reflex. Because of shock fear they decrease or even stop licking with the presentations of conditioned stimulus. However, subjects gradually forgot or ignored the fear without any shock present in extinction test sessions. Results Animals′ licking recovered to their pre-training levels respectively at the following days: GroupⅠ-5 days，GroupⅡ-2 days，both GroupⅢand Ⅳ-4 days，GroupⅤ-5 days，Group Ⅵ-2 days, Group Ⅶ-5 days, Group Ⅷ-4 days, Group Ⅸ-5 days, Group Ⅹ-4 days. There were much significant differences among all groups and all training days (F test, P<0.001). Above results provided sufficient evidence for that tinnitus was induced by salicylate and tinnitus presented with noise offset. In groupⅠ,tinnitus became additional conditioned stimulus. Therefore, the fear of animals was much severe and the numbers of licking were much fewer. Extinction lasted longer. In groupⅡ,animals ignored the noise offset much easily and the extinction lasted much shorter. Moreover, results from groupⅤand Ⅵ,pure tone instead of salicylate, indicated that sensation (tinnitus) sounded like pure tone. The groups Ⅶ,Ⅷ,Ⅸ,Ⅹdemonstrated that nimodipine and Gushenshuerfang, one kind of Chinese herbs can cure the tinnitus induced by salicylate. Conclusion All behavioral evidence indicated that animals perceived tinnitus induced by salicylate and this animal model could be used in evaluating curative effects of some medicine on tinnitus.
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【Key words】 Tinnitus； Disease models, animal； Sodium, salicylate； Conditioning, classical； Behavior, animal
耳鸣是一种无外界相应声源的主观感觉，发病率极高。文献报告[1]，在美国和欧洲总人口中约有17%的人患有耳鸣。有时，耳鸣引起的痛苦和烦恼甚至比耳聋更大。因此，耳鸣受到越来越多的重视，已成为临床上迫切需要解决而又难以解决的顽症之一。至今，耳鸣发生机制仍不清楚，更无特效的治疗方法。由于缺少动物模型，以往的耳鸣研究多局限于人类，这大大限制了对耳鸣机制的深入了解。动物不可能用语言表达其主观感觉，但通过某种行为反应，可以得知动物是否感觉到了耳鸣。本研究目的是，按照巴甫洛夫条件反射原理，参照Jastreboff 等[1]的方法并适当改进，建立动物耳鸣的行为反应模型，并用该模型观察尼莫地平、骨参舒耳片的治疗效果。
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一、动物
健康雄性白色Wistar大鼠60只，体重243～580 g，平均347 g 。随机分为10组，每组6只：第Ⅰ、Ⅱ组为水杨酸组，皮下注射水杨酸钠(Sigma公司，美国)每日350 mg/kg体重；第Ⅲ、Ⅳ组为生理盐水对照组；第Ⅴ、Ⅵ组为纯音组，用8 kHz、65 dB SPL的纯音代替水杨酸；第Ⅶ、Ⅷ组为尼莫地平组，注射水杨酸后再皮下注射尼莫地平每日1 mg/kg体重；第Ⅸ、Ⅹ组为骨参舒耳片组，注射水杨酸后给予骨参舒耳片剂5 g/kg体重(配成10%液体，训练时通过供水器让动物饮入)。第Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ组是从条件反射建立前开始给予药物或纯音，第Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅷ、Ⅹ组从条件反射建立后开始给予药物或纯音。听性脑干反应阈值≤35 dB SPL者纳入实验。
适应性喂养1周后，禁水2～3 d，使动物体重下降至原来的80%，使动物处于干渴状态。将动物移入隔声室后单独饲养，给予食物但仍禁水，一直到实验结束。隔声室本底噪声：500 Hz以上各频率均小于25 dB SPL。实验过程中保持室内灯光的12 h开/关，以使动物的日夜节律保持稳定。
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二、仪器
仪器包括吸水计数器、训练箱、电刺激器、定时器、给声系统等(图1)。吸水计数器和训练箱为Lafayette公司产品(美国)，吸水计数器型号Model-102。训练箱系有机玻璃制成，内径43 cm×23 cm×23 cm，箱底是不锈钢栅，箱顶置吸水管。箱底接电刺激器的负极，箱顶吸水管接电刺激器的正极。吸水时动物的身体接通该电路，可以给予电击。该电路也与吸水计数器连接，可以准确记录动物的吸水次数。电刺激器为日本光电Model8201型，隔离器型号SS102J。用SDK-2型数字式定时控制器将听力计和电刺激器同步。给声系统包括 Madsen OB822临床听力计，Madsen PA501功放和飞乐牌YD5-2004扬声器(8Ω)。扬声器位于动物正上方以使所有动物感受到的声音强度相等，均为55 dB SPL白噪声。
图1 耳鸣动物模型训练仪器系统模式图
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三、条件反射训练程序
条件反射训练在另一间隔声室里进行，每只动物每天训练1次，每次30 min。条件刺激是背景声音(55 dB SPL白噪声)的随机停止，共呈现5次，分别在第3、9、17、24、29 min左右出现，每次30 s。非条件刺激是电击，1.5 mA，持续0.5 s，在条件刺激出现时的第9 s、18 s或27 s给予，1次即可。训练时给动物供水，按7～10 滴/min将供水量控制在15～20 ml以内。用自动计数器记录吸水次数。条件刺激出现时的吸水次数为B，条件刺激不出现时每30 s的平均吸水次数为A，吸水率R=B/(A+B)。训练分3个阶段：①适应训练期：目的是让动物适应条件刺激并持续吸水，吸水率应该等于或接近0.5，动物吸水次数一般为6 000～8 000次，如果少于350次则被淘汰；②条件反射训练期：条件刺激出现时给予电击，动物因恐惧电击而减少或停止吸水，吸水率应等于或接近0；经2～3 d强化训练后，动物建立了“背景噪声停止-吸水率下降或停止”的条件反射；③条件反射消除期：条件刺激出现时不再给予电击，观察条件反射的消除或遗忘时间，吸水率逐渐恢复到0.5。
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结果
各组动物吸水率随训练时间变化的情况见图2。动物需要2～3 d就可以适应条件刺激，再经2～3 d强化训练即可形成条件反射。各组的平均消除时间分别为：第Ⅰ组5 d，第Ⅱ组2 d，第Ⅲ、Ⅳ组均为4 d，第Ⅴ组5 d、第Ⅵ组2 d，第Ⅶ组5 d，第Ⅷ组4 d，第Ⅸ组5 d，第Ⅹ组4 d。条件反射建立后给药的尼莫地平(第Ⅷ组)和骨参舒耳片(第Ⅹ组)比水杨酸组(第Ⅱ组)的消除曲线明显下移；条件反射建立前给药的尼莫地平(第Ⅶ组)和骨参舒耳片(第Ⅸ组)比水杨酸组(第Ⅰ组)的消除曲线明显上移。经双因素随机区组设计资料的方差分析显示，各组之间和各训练时间之间(d)的差异具有极显著性意义(各组间F=49.66，P<0.001；各训练时间之间F=51.64，P<0.001)。
, http://www.100md.com 上图：水杨酸组(第Ⅰ组、第Ⅱ组)和生理盐水对照组(第Ⅲ、第Ⅳ组)及纯音组(第Ⅴ组、第Ⅵ组)的比较。下图：水杨酸组(第Ⅰ组、第Ⅱ组)和尼莫地平(第Ⅶ组、第Ⅷ组)及骨参舒耳片(第Ⅸ组、第Ⅹ组)的比较
图2 各组动物吸水率随训练时间的变化。1～3 d适应训练期，4、5 d条件反射训练期，6～12 d消除期
上述结果可以证明动物确实感觉到了耳鸣：在条件反射建立前注射水杨酸(第Ⅰ组)，动物产生了耳鸣，条件刺激出现时耳鸣暴露出来，除背景噪声停止外，耳鸣本身成为额外的条件刺激。因此，动物恐惧反应加重，消除期延长。在条件反射建立后注射水杨酸(第Ⅱ组)，动物因听到了耳鸣而分辨不清背景噪声是否停止，所以很容易忽略条件刺激，消除期缩短。用生理盐水代替水杨酸，二者的消除曲线有明显差异，表明水杨酸才有致耳鸣作用。用纯音代替水杨酸所引起的耳鸣，二者的消除曲线基本相同，表明水杨酸诱发的耳鸣感觉与纯音类似。给予尼莫地平和骨参舒耳片后，水杨酸的消除曲线向生理盐水对照组靠拢，表明尼莫地平和骨参舒耳片能够消除水杨酸诱发的耳鸣。
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讨论
我们对实验结果的分析表明，动物的吸水行为在注射水杨酸后发生了规律性变化。不管在条件反射建立前还是在条件反射建立后给药，吸水率的变化都提示动物感受到了耳鸣。而且证实水杨酸诱发的耳鸣与纯音类似。本实验结果与文献报道[2]基本一致，表明我们的训练仪器和训练方法是可靠的，结果和结论是可信的，所建立的动物模型是有效的。
最早，人们仅能推测动物在注射水杨酸后产生了与人相似的耳鸣。之后，有学者用放射自显影方法监测动物的脑葡萄糖代谢情况，发现一侧听神经切断后主要上传通路核团(同侧蜗核、对侧下丘、对侧内膝体等)代谢活动先降低后升高，这种升高可能是耳鸣的证据[3 ]。再后，有学者用玻璃微电极行单纤维胞内记录，发现动物在给予水杨酸后，听神经、下丘、初级皮层的自发放电率增加，这种增加被皮层感觉为耳鸣[4]。现在，人们可以通过行为学模型来判定动物是否感觉到了耳鸣。行为学模型具有以下优点：简便，无创，而且从整体水平提供动物耳鸣的证据。
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水杨酸是常用的解热镇痛抗炎抗风湿药物，其耳毒性包括听力下降和耳鸣。Mongan等[5]报告，风湿病患者大量应用水杨酸后几乎所有患者都发生耳鸣，同时伴有暂时性听力下降。动物实验表明，水杨酸对耳蜗形态结构无明显损伤[6]。基于以上事实，学者们将水杨酸视为能诱发耳鸣和可逆性听力下降的药物而广泛应用于动物实验研究。文献报告[2]，行为学模型可以排除水杨酸非特异性作用(听力下降、痛阈改变、干渴等)的影响。在条件反射建立前开始给药，如果动物仅有听力下降而无耳鸣，条件反射期的吸水抑制程度应该较轻；在消除期，动物应该很快消除对恐惧的反应。然而，事实却与此相反，第Ⅰ组动物的吸水抑制更重，需要5 d才能消除对恐惧的反应。水杨酸对电刺激的镇痛作用不能合理解释实验结果。水杨酸对动物渴的程度无明显影响，既不增加也不减少动物的水消耗。水杨酸和噪声共同作用并不增加动物死亡率[7]。用视觉模式(用持续的灯光代替背景噪声，灯光关闭作为条件刺激)验证结果表明，水杨酸诱发的行为反应严格限于听觉系统内[1]。临床上早已发现奎宁也能引起患者耳鸣及可逆性听力下降。用奎宁进行的行为学实验表明，奎宁与水杨酸使动物产生相同的行为表现[8]，进一步证明了行为学模型的有效性和可信性。
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大鼠是造模的适宜动物，而豚鼠因特别敏感不易造成行为学模型。国外用有色大鼠(pigmented rat)是因为其对水杨酸钠的吸收高于白色大鼠，血清药物浓度相对较高，药物与耳鸣的量-效关系较明显[1，2]。国内尚无实验用有色大鼠，而本实验结果表明，用白色Wistar大鼠同样能造成行为学模型。在实验期间，为避免应激反应对吸水行为的影响，应多接触和多抚摸动物。而在实验前应该剔除那些特别敏感或易激怒者，这样的大鼠为数极少，因其不能适应吸水训练，故不会形成条件反射，更不能用于评价药物治疗效果。目前，国内外尚没有市售的成套的耳鸣动物模型训练仪器可供选择，所有仪器均是根据实验目的自行组装的。我们对Jastreboff等的训练方法进行了改良：①增加吸水次数或使动物持续不断的吸水，文献报告的吸水次数是350～1 600次，本实验的吸水次数是6 000～8 000次，只有当动物吸水时才能给予电击，持续吸水才不会使电击失败；②增加训练次数以使动物更快记住条件反射，文献报告每天训练时条件刺激出现4次，而本实验条件刺激出现5次；③文献要求在条件刺激结束的最后1 s才给予一次电击，但经仔细观察，这很容易失败。我们根据预试验情况，在条件刺激出现7 s后给予第一次电击，如果失败则在9 s后给予第二次，一直到电击成功。 经过上述改良后能较容易地造成动物模型，表明改良是可行和成功的。
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行为学模型可用于耳鸣神经机制、客观检测、诊断及治疗等各方面的研究，也可用于评价药物的治疗效果，因此具有重要研究价值。用该模型测得动物耳鸣频率为10 kHz或11 kHz，200 mg水杨酸诱发的耳鸣强度为72 dB SPL[9]。尼莫地平是钙离子拮抗剂，临床上常用于治疗耳鸣[10]。骨参舒耳片是我科近年来应用的临床验方，主要由骨碎补、丹参、葛根等多种中药成分组成，具有补肾益精、健脾升阳、化痰祛湿、宣通耳窍之功效，临床治疗耳鸣有效率达71.7%。尼莫地平和骨参舒耳片治疗耳鸣作用机理已经有较多电生理的和形态的文献，本研究又为二种药物从整体水平提供了行为学证据。二种药物治疗耳鸣的有效性又反过来证明了动物模型的可信性。
本研究表明，用条件反射方法可以造成动物耳鸣的行为学模型，实验证实该模型是可信的，用该模型可评价药物治疗耳鸣有效或无效。虽然行为学模型具有重要研究价值和意义，但仍存在一定的局限性。首先，本模型仅仅是水杨酸诱发的耳鸣而不是其他因素诱发的耳鸣；其次，该模型不能鉴别耳鸣侧别；再次，该模型也不能确定耳鸣产生部位(以往认为水杨酸的作用主要是外周的，但越来越多的资料显示，水杨酸也有中枢作用)。因此，耳鸣动物模型仍有待深入研究。
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参考文献
1，Jastreboff PJ, Sasaki CT. An animal model of tinnitus: a decade of development. Am J Otol, 1994,15:19-27.
2，Jastreboff PJ, Brennan JF, Sasaki CT. An animal model for tinnitus. Laryngoscope, 1988, 98:280-286.
3，Sasaki CT,Kauer JS,Babitz L. Differential [14C]2-deoxyglucose uptake after deafferentation of the mammalian auditory pathway——a model for examining tinnitus.Brain Res,1980,194:511-516.
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4，Jastreboff PJ, Sasaki CT. Salicylate-induced changes in spontaneous activity of single units in the inferior colliculus of the guinea pig. J Acoust Soc Am, 1986, 80: 1384-1391.
5，Mongan E,Kelly P,Nies K,et al.Tinnitus as an indication of therapeutic serum salicylate levels.J AM A,1973,226:142-144.
6，Stypulkowski PH.Mechanisms of salicylate ototoxicity.Hear Res,1990,46:113-145.
7，Brennan JF, Jastreboff PJ. Interaction of salicylate and noise results in mortality of rats. Experientia, 1989,45:731-734.
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8，Jastreboff PJ, Brennan JF, Sasaki CT.Quinine-induced tinnitus in rats. Arch Otolaryngol Head Neck Surg,1991,117:1162-1166.
9，Jastreboff PJ, Brennan JF. Evaluating the loudness of phantom auditory perception (tinnitus) in rats. Audiology, 1994,33:202-217.
10，Davies E，Knox E，Donaldson I. The usefulness of nimodipine, an L-calcium channel antagonist, in the treatment of tinnitus.Br J Audiol，1994, 28:125-129.
(收稿日期：2000-01-05), 百拇医药
单位：100853 北京 解放军总医院耳鼻咽喉-头颈外科 解放军耳鼻咽喉科研究所
关键词：耳鸣；疾病模型；动物；水杨酸钠；条件反射；经典；行为；动物
中华耳鼻咽喉科杂志000503 【摘要】 目的 建立动物耳鸣的行为学模型，确认动物是否感觉到了耳鸣，并用该模型评价药物治疗效果。方法 雄性健康Wistar大鼠60只，平均分为10组：第Ⅰ、Ⅱ组为水杨酸组，皮下注射水杨酸钠每日350 mg/kg体重；第Ⅲ、Ⅳ组为生理盐水对照组；第Ⅴ、Ⅵ组为纯音组，用8 kHz、65 dB SPL的纯音代替水杨酸；第Ⅶ、Ⅷ组为尼莫地平组，注射水杨酸后再皮下注射尼莫地平每日1 mg/kg体重；第Ⅸ、Ⅹ组为骨参舒耳片组，注射水杨酸后给予骨参舒耳片剂5 g/kg体重。第Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ组是从条件反射建立前开始给予药物或纯音，第Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅷ、Ⅹ组从条件反射建立后开始给予药物或纯音。将禁水后非常渴的动物置于隔声室内进行条件反射训练。持续背景白噪声强度55 dB SPL，背景噪声随机停止为条件刺激，电击为非条件刺激。训练时给动物供水并记录吸水次数。经强化训练后形成“背景噪声停止-吸水减少或停止”的条件反射。不再给电击，观察条件反射的消除时间。结果 各组的消除时间分别为：第Ⅰ组5 d，第Ⅱ组2 d，第Ⅲ、Ⅳ组均为4 d，第Ⅴ组5 d、第Ⅵ组2 d，第Ⅶ组5 d，第Ⅷ组4 d，第Ⅸ组5 d，第Ⅹ组4 d。经双因素方差分析显示，各组之间和各训练时间(d)之间差异具有极显著性意义(P值均<0.001)。在此时间后动物吸水率完全恢复到适应训练前水平。可见大鼠确实感觉到了耳鸣，水杨酸诱发的声音感觉与纯音类似，尼莫地平和骨参舒耳片能够消除水杨酸诱发的耳鸣。结论 行为学模型的成功建立为动物耳鸣提供了有力证据，并为评价药物治疗效果提供了一种新的理想模型。
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WANG Hongtian JIANG Sichang YANG Weiyan
(Institute of Otorhinolaryngology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China)
【Abstract】 Objective To develop a valid behavioral animal model of tinnitus and to determine the animals whether have the perception of tinnitus and to evaluate effects of nimodipine and Chinese herbs on tinnitus using the behavioral model. Methods Adult male albino rats (n=60) were fell evenly and randomly into ten groups. Animals in Group Ⅰand Ⅱ were administrated sodium salicylate 350 mg/kg/d (i.p.). Instead, animals in control groups (Group Ⅲ and Ⅳ) were saline injected. Pure tone (8kHz, 65dBSPL) was given to rats in Group Ⅴand Ⅵ instead of sodium salicylate. Nimodipine (1 mg/kg) were administrated to animals in Group Ⅶand Ⅷ. Gushenshuerfang, one kind of Chinese herbs were administrated to animals in Group Ⅸ and Ⅹ. Medicine or pure tone were being given to all animals in GroupⅠ,Ⅲ,Ⅴ,Ⅶ,Ⅸbefore conditioned reflex. Animals in Group Ⅱ,Ⅳ,Ⅵ,Ⅷ,Ⅹ began to have medicine or pure tone after conditioned reflex. Thirsty animals (deprived of water for several days) were breeded in sound-proofed room and listened a persistent white noise (55 dB SPL) and trained daily with our instrument system, according to the procedure based on Pavlovian conditioned suppression paradigm. Subjects were permitted to lick water at an automatic dispenser during daily training sessions and the number of licks was recorded automatically. Noise offset (silence) was the conditioned stimulus and the electrical shock was the unconditioned stimulus. After two or three days training, subjects learnt rapidly to associate noise offset with shock and then established a behavioral conditioned reflex. Because of shock fear they decrease or even stop licking with the presentations of conditioned stimulus. However, subjects gradually forgot or ignored the fear without any shock present in extinction test sessions. Results Animals′ licking recovered to their pre-training levels respectively at the following days: GroupⅠ-5 days，GroupⅡ-2 days，both GroupⅢand Ⅳ-4 days，GroupⅤ-5 days，Group Ⅵ-2 days, Group Ⅶ-5 days, Group Ⅷ-4 days, Group Ⅸ-5 days, Group Ⅹ-4 days. There were much significant differences among all groups and all training days (F test, P<0.001). Above results provided sufficient evidence for that tinnitus was induced by salicylate and tinnitus presented with noise offset. In groupⅠ,tinnitus became additional conditioned stimulus. Therefore, the fear of animals was much severe and the numbers of licking were much fewer. Extinction lasted longer. In groupⅡ,animals ignored the noise offset much easily and the extinction lasted much shorter. Moreover, results from groupⅤand Ⅵ,pure tone instead of salicylate, indicated that sensation (tinnitus) sounded like pure tone. The groups Ⅶ,Ⅷ,Ⅸ,Ⅹdemonstrated that nimodipine and Gushenshuerfang, one kind of Chinese herbs can cure the tinnitus induced by salicylate. Conclusion All behavioral evidence indicated that animals perceived tinnitus induced by salicylate and this animal model could be used in evaluating curative effects of some medicine on tinnitus.
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【Key words】 Tinnitus； Disease models, animal； Sodium, salicylate； Conditioning, classical； Behavior, animal
耳鸣是一种无外界相应声源的主观感觉，发病率极高。文献报告[1]，在美国和欧洲总人口中约有17%的人患有耳鸣。有时，耳鸣引起的痛苦和烦恼甚至比耳聋更大。因此，耳鸣受到越来越多的重视，已成为临床上迫切需要解决而又难以解决的顽症之一。至今，耳鸣发生机制仍不清楚，更无特效的治疗方法。由于缺少动物模型，以往的耳鸣研究多局限于人类，这大大限制了对耳鸣机制的深入了解。动物不可能用语言表达其主观感觉，但通过某种行为反应，可以得知动物是否感觉到了耳鸣。本研究目的是，按照巴甫洛夫条件反射原理，参照Jastreboff 等[1]的方法并适当改进，建立动物耳鸣的行为反应模型，并用该模型观察尼莫地平、骨参舒耳片的治疗效果。
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一、动物
健康雄性白色Wistar大鼠60只，体重243～580 g，平均347 g 。随机分为10组，每组6只：第Ⅰ、Ⅱ组为水杨酸组，皮下注射水杨酸钠(Sigma公司，美国)每日350 mg/kg体重；第Ⅲ、Ⅳ组为生理盐水对照组；第Ⅴ、Ⅵ组为纯音组，用8 kHz、65 dB SPL的纯音代替水杨酸；第Ⅶ、Ⅷ组为尼莫地平组，注射水杨酸后再皮下注射尼莫地平每日1 mg/kg体重；第Ⅸ、Ⅹ组为骨参舒耳片组，注射水杨酸后给予骨参舒耳片剂5 g/kg体重(配成10%液体，训练时通过供水器让动物饮入)。第Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ组是从条件反射建立前开始给予药物或纯音，第Ⅱ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅷ、Ⅹ组从条件反射建立后开始给予药物或纯音。听性脑干反应阈值≤35 dB SPL者纳入实验。
适应性喂养1周后，禁水2～3 d，使动物体重下降至原来的80%，使动物处于干渴状态。将动物移入隔声室后单独饲养，给予食物但仍禁水，一直到实验结束。隔声室本底噪声：500 Hz以上各频率均小于25 dB SPL。实验过程中保持室内灯光的12 h开/关，以使动物的日夜节律保持稳定。
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二、仪器
仪器包括吸水计数器、训练箱、电刺激器、定时器、给声系统等(图1)。吸水计数器和训练箱为Lafayette公司产品(美国)，吸水计数器型号Model-102。训练箱系有机玻璃制成，内径43 cm×23 cm×23 cm，箱底是不锈钢栅，箱顶置吸水管。箱底接电刺激器的负极，箱顶吸水管接电刺激器的正极。吸水时动物的身体接通该电路，可以给予电击。该电路也与吸水计数器连接，可以准确记录动物的吸水次数。电刺激器为日本光电Model8201型，隔离器型号SS102J。用SDK-2型数字式定时控制器将听力计和电刺激器同步。给声系统包括 Madsen OB822临床听力计，Madsen PA501功放和飞乐牌YD5-2004扬声器(8Ω)。扬声器位于动物正上方以使所有动物感受到的声音强度相等，均为55 dB SPL白噪声。
图1 耳鸣动物模型训练仪器系统模式图
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三、条件反射训练程序
条件反射训练在另一间隔声室里进行，每只动物每天训练1次，每次30 min。条件刺激是背景声音(55 dB SPL白噪声)的随机停止，共呈现5次，分别在第3、9、17、24、29 min左右出现，每次30 s。非条件刺激是电击，1.5 mA，持续0.5 s，在条件刺激出现时的第9 s、18 s或27 s给予，1次即可。训练时给动物供水，按7～10 滴/min将供水量控制在15～20 ml以内。用自动计数器记录吸水次数。条件刺激出现时的吸水次数为B，条件刺激不出现时每30 s的平均吸水次数为A，吸水率R=B/(A+B)。训练分3个阶段：①适应训练期：目的是让动物适应条件刺激并持续吸水，吸水率应该等于或接近0.5，动物吸水次数一般为6 000～8 000次，如果少于350次则被淘汰；②条件反射训练期：条件刺激出现时给予电击，动物因恐惧电击而减少或停止吸水，吸水率应等于或接近0；经2～3 d强化训练后，动物建立了“背景噪声停止-吸水率下降或停止”的条件反射；③条件反射消除期：条件刺激出现时不再给予电击，观察条件反射的消除或遗忘时间，吸水率逐渐恢复到0.5。
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结果
各组动物吸水率随训练时间变化的情况见图2。动物需要2～3 d就可以适应条件刺激，再经2～3 d强化训练即可形成条件反射。各组的平均消除时间分别为：第Ⅰ组5 d，第Ⅱ组2 d，第Ⅲ、Ⅳ组均为4 d，第Ⅴ组5 d、第Ⅵ组2 d，第Ⅶ组5 d，第Ⅷ组4 d，第Ⅸ组5 d，第Ⅹ组4 d。条件反射建立后给药的尼莫地平(第Ⅷ组)和骨参舒耳片(第Ⅹ组)比水杨酸组(第Ⅱ组)的消除曲线明显下移；条件反射建立前给药的尼莫地平(第Ⅶ组)和骨参舒耳片(第Ⅸ组)比水杨酸组(第Ⅰ组)的消除曲线明显上移。经双因素随机区组设计资料的方差分析显示，各组之间和各训练时间之间(d)的差异具有极显著性意义(各组间F=49.66，P<0.001；各训练时间之间F=51.64，P<0.001)。
, http://www.100md.com 上图：水杨酸组(第Ⅰ组、第Ⅱ组)和生理盐水对照组(第Ⅲ、第Ⅳ组)及纯音组(第Ⅴ组、第Ⅵ组)的比较。下图：水杨酸组(第Ⅰ组、第Ⅱ组)和尼莫地平(第Ⅶ组、第Ⅷ组)及骨参舒耳片(第Ⅸ组、第Ⅹ组)的比较
图2 各组动物吸水率随训练时间的变化。1～3 d适应训练期，4、5 d条件反射训练期，6～12 d消除期
上述结果可以证明动物确实感觉到了耳鸣：在条件反射建立前注射水杨酸(第Ⅰ组)，动物产生了耳鸣，条件刺激出现时耳鸣暴露出来，除背景噪声停止外，耳鸣本身成为额外的条件刺激。因此，动物恐惧反应加重，消除期延长。在条件反射建立后注射水杨酸(第Ⅱ组)，动物因听到了耳鸣而分辨不清背景噪声是否停止，所以很容易忽略条件刺激，消除期缩短。用生理盐水代替水杨酸，二者的消除曲线有明显差异，表明水杨酸才有致耳鸣作用。用纯音代替水杨酸所引起的耳鸣，二者的消除曲线基本相同，表明水杨酸诱发的耳鸣感觉与纯音类似。给予尼莫地平和骨参舒耳片后，水杨酸的消除曲线向生理盐水对照组靠拢，表明尼莫地平和骨参舒耳片能够消除水杨酸诱发的耳鸣。
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讨论
我们对实验结果的分析表明，动物的吸水行为在注射水杨酸后发生了规律性变化。不管在条件反射建立前还是在条件反射建立后给药，吸水率的变化都提示动物感受到了耳鸣。而且证实水杨酸诱发的耳鸣与纯音类似。本实验结果与文献报道[2]基本一致，表明我们的训练仪器和训练方法是可靠的，结果和结论是可信的，所建立的动物模型是有效的。
最早，人们仅能推测动物在注射水杨酸后产生了与人相似的耳鸣。之后，有学者用放射自显影方法监测动物的脑葡萄糖代谢情况，发现一侧听神经切断后主要上传通路核团(同侧蜗核、对侧下丘、对侧内膝体等)代谢活动先降低后升高，这种升高可能是耳鸣的证据[3 ]。再后，有学者用玻璃微电极行单纤维胞内记录，发现动物在给予水杨酸后，听神经、下丘、初级皮层的自发放电率增加，这种增加被皮层感觉为耳鸣[4]。现在，人们可以通过行为学模型来判定动物是否感觉到了耳鸣。行为学模型具有以下优点：简便，无创，而且从整体水平提供动物耳鸣的证据。
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水杨酸是常用的解热镇痛抗炎抗风湿药物，其耳毒性包括听力下降和耳鸣。Mongan等[5]报告，风湿病患者大量应用水杨酸后几乎所有患者都发生耳鸣，同时伴有暂时性听力下降。动物实验表明，水杨酸对耳蜗形态结构无明显损伤[6]。基于以上事实，学者们将水杨酸视为能诱发耳鸣和可逆性听力下降的药物而广泛应用于动物实验研究。文献报告[2]，行为学模型可以排除水杨酸非特异性作用(听力下降、痛阈改变、干渴等)的影响。在条件反射建立前开始给药，如果动物仅有听力下降而无耳鸣，条件反射期的吸水抑制程度应该较轻；在消除期，动物应该很快消除对恐惧的反应。然而，事实却与此相反，第Ⅰ组动物的吸水抑制更重，需要5 d才能消除对恐惧的反应。水杨酸对电刺激的镇痛作用不能合理解释实验结果。水杨酸对动物渴的程度无明显影响，既不增加也不减少动物的水消耗。水杨酸和噪声共同作用并不增加动物死亡率[7]。用视觉模式(用持续的灯光代替背景噪声，灯光关闭作为条件刺激)验证结果表明，水杨酸诱发的行为反应严格限于听觉系统内[1]。临床上早已发现奎宁也能引起患者耳鸣及可逆性听力下降。用奎宁进行的行为学实验表明，奎宁与水杨酸使动物产生相同的行为表现[8]，进一步证明了行为学模型的有效性和可信性。
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大鼠是造模的适宜动物，而豚鼠因特别敏感不易造成行为学模型。国外用有色大鼠(pigmented rat)是因为其对水杨酸钠的吸收高于白色大鼠，血清药物浓度相对较高，药物与耳鸣的量-效关系较明显[1，2]。国内尚无实验用有色大鼠，而本实验结果表明，用白色Wistar大鼠同样能造成行为学模型。在实验期间，为避免应激反应对吸水行为的影响，应多接触和多抚摸动物。而在实验前应该剔除那些特别敏感或易激怒者，这样的大鼠为数极少，因其不能适应吸水训练，故不会形成条件反射，更不能用于评价药物治疗效果。目前，国内外尚没有市售的成套的耳鸣动物模型训练仪器可供选择，所有仪器均是根据实验目的自行组装的。我们对Jastreboff等的训练方法进行了改良：①增加吸水次数或使动物持续不断的吸水，文献报告的吸水次数是350～1 600次，本实验的吸水次数是6 000～8 000次，只有当动物吸水时才能给予电击，持续吸水才不会使电击失败；②增加训练次数以使动物更快记住条件反射，文献报告每天训练时条件刺激出现4次，而本实验条件刺激出现5次；③文献要求在条件刺激结束的最后1 s才给予一次电击，但经仔细观察，这很容易失败。我们根据预试验情况，在条件刺激出现7 s后给予第一次电击，如果失败则在9 s后给予第二次，一直到电击成功。 经过上述改良后能较容易地造成动物模型，表明改良是可行和成功的。
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行为学模型可用于耳鸣神经机制、客观检测、诊断及治疗等各方面的研究，也可用于评价药物的治疗效果，因此具有重要研究价值。用该模型测得动物耳鸣频率为10 kHz或11 kHz，200 mg水杨酸诱发的耳鸣强度为72 dB SPL[9]。尼莫地平是钙离子拮抗剂，临床上常用于治疗耳鸣[10]。骨参舒耳片是我科近年来应用的临床验方，主要由骨碎补、丹参、葛根等多种中药成分组成，具有补肾益精、健脾升阳、化痰祛湿、宣通耳窍之功效，临床治疗耳鸣有效率达71.7%。尼莫地平和骨参舒耳片治疗耳鸣作用机理已经有较多电生理的和形态的文献，本研究又为二种药物从整体水平提供了行为学证据。二种药物治疗耳鸣的有效性又反过来证明了动物模型的可信性。
本研究表明，用条件反射方法可以造成动物耳鸣的行为学模型，实验证实该模型是可信的，用该模型可评价药物治疗耳鸣有效或无效。虽然行为学模型具有重要研究价值和意义，但仍存在一定的局限性。首先，本模型仅仅是水杨酸诱发的耳鸣而不是其他因素诱发的耳鸣；其次，该模型不能鉴别耳鸣侧别；再次，该模型也不能确定耳鸣产生部位(以往认为水杨酸的作用主要是外周的，但越来越多的资料显示，水杨酸也有中枢作用)。因此，耳鸣动物模型仍有待深入研究。
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参考文献
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4，Jastreboff PJ, Sasaki CT. Salicylate-induced changes in spontaneous activity of single units in the inferior colliculus of the guinea pig. J Acoust Soc Am, 1986, 80: 1384-1391.
5，Mongan E,Kelly P,Nies K,et al.Tinnitus as an indication of therapeutic serum salicylate levels.J AM A,1973,226:142-144.
6，Stypulkowski PH.Mechanisms of salicylate ototoxicity.Hear Res,1990,46:113-145.
7，Brennan JF, Jastreboff PJ. Interaction of salicylate and noise results in mortality of rats. Experientia, 1989,45:731-734.
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8，Jastreboff PJ, Brennan JF, Sasaki CT.Quinine-induced tinnitus in rats. Arch Otolaryngol Head Neck Surg,1991,117:1162-1166.
9，Jastreboff PJ, Brennan JF. Evaluating the loudness of phantom auditory perception (tinnitus) in rats. Audiology, 1994,33:202-217.
10，Davies E，Knox E，Donaldson I. The usefulness of nimodipine, an L-calcium channel antagonist, in the treatment of tinnitus.Br J Audiol，1994, 28:125-129.
(收稿日期：2000-01-05), 百拇医药