喉癌组织及手术切缘P53和P16蛋白表达与局部复发的关系
作者：魏伯俊 唐平章 屠规益 吕宁 梁克
单位：魏伯俊(中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院耳鼻咽喉科 北京 100730)；唐平章 屠规益(中国医学科学院肿瘤医院头颈外科)；吕宁(病理科)；梁克(放射生物室)
关键词：喉肿瘤；蛋白质P53；蛋白质P16；肿瘤复发；局部
中华耳鼻咽喉科杂志000618 【摘要】 目的 用免疫组织化学方法监测P16和P53蛋白在喉癌手术切缘中的表达情况及其与肿瘤局部复发的关系。方法 选择HE染色病理学检查手术切缘为阴性但术后肿瘤局部复发的52例喉癌作为复发组，并按照患者的年龄、性别、临床分型、TNM分期、病理分级、术前放疗剂量等可能影响因素选择48例随访5年以上无肿瘤局部复发者为无复发组。对2组手术切缘和肿瘤标本同时行P16和P53蛋白免疫组织化学检查。结果 在100例喉癌组织中P53蛋白的表达率和P16蛋白的丢失率分别为54%和40%，喉癌组织中P16和P53蛋白表达同时异常的喉癌患者当其手术切缘粘膜中P16和P53蛋白表达也同时异常时，其术后肿瘤局部复发率为85%。P16和P53蛋白表达与喉癌的临床分型和T分期无关。结论 采用免疫组化方法联合检测P16和P53蛋白在喉癌组织和手术切缘中的表达情况可为筛选术后肿瘤局部复发的高危病例提供依据。
, 百拇医药
The status of protein P16 and P53 in the surgical margins of laryngeal carcinoma and the association with local recurrence
WEI Bojun，TANG Pingzhang, TU Guiyi, et al.
(Department of Otorhinolaryngology, Beijing Union Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing Union Medical College, Beijing 100730, China)
【Abstract】 Objective To assess the status of P53 and P16 of surgical margins in laryngeal carcinoma and the association with the local recurrence following surgical treatment Methods The status of P53 and P16 of surgical margins in laryngeal carcinoma was studied using immunohistochemistry (IHC) staining method in 100 cases of laryngeal carcinoma. Fifty-two of them had recurrent tumors while 48 cases were free of local recurrence after 5-year follow up. The original tumor sites and T stages, which bear important influence over the risk of local recurrence, were strictly matched between the two groups, and the ages and preoperative doses of radiation were also considered. Results The percentage of local recurrence was 85% in these patients who showed positive staining for P53 and simultaneous negative staining for P16 in both the cancer tissues and the surgical margins. No association was found between the expression of P53 and P16 and the clinical types or T stages. Conclusion The status of P53 and P16 in combination demonstrated by IHC technique in surgical margins of laryngeal carcinoma may predict the possibility of local recurrence.
, 百拇医药
【Key words】 Laryngeal neoplasms; Protein P53; Protein P16; Neoplasms recurrence, local
手术是治疗喉癌的主要措施，局部复发是其失败的重要原因之一。正确选择手术切缘，合理选择术后辅助治疗是预防术后局部复发最重要措施。通过检测P53和P16在喉癌组织和手术切缘中的表达情况来探讨两者的表达与术后局部复发的关系，以期能找到预测喉癌术后局部复发危险性的生物学标志，为有针对性地采取预防措施，进一步降低局部复发率提供有益的参考。
材料和方法
一、标本及处理
100例患者均为1982～1992年期间在中国医学科学院肿瘤医院头颈外科行手术治疗的喉癌患者，其中男76例，女24例，年龄37～71岁，平均57岁。复发组病例的选择： 52例术中经病理学检查手术切缘为阴性，但术后经病理证实为局部复发者；无复发组病例的选择：依据复发组病例的性别、年龄、临床分型(声门型37例、声门上型15例)、TNM分期、病理分级和术前放射治疗及剂量等因素选择条件相同或十分接近且随诊至少5年以上无局部复发喉癌患者48例，其临床分型与复发组完全相同, 其中T分期与复发组相同者47例。 2组病例手术时均无远处转移。手术切缘的取材方法：在喉癌标本整块切除后，选择距肿瘤边缘相对较近的切开处切取1～2 mm粘膜组织宽送病理检查。所有标本均经10%福尔马林固定，石腊包埋，4～5 μm连续切片，行HE染色及免疫组化染色，HE染色切片请病理学家复审核定，肿瘤标本均为鳞癌且切缘为阴性。
, 百拇医药
二、实验试剂和方法
鼠抗人P16单克隆抗体，工作效价1∶50；鼠抗人P53单克隆抗体，工作效价1∶50；生物素标记羊抗鼠IgG，工作效价1∶100；辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，稀释度为1∶200；DAB显色液。以上试剂均购自北京中山生物工程公司(美国Zymed公司产品)。实验方法采用免疫组化SP法检测喉癌组织与切缘，具体实验步骤和方法见说明书。
三、结果判断
用已知有P53、P16染色的切片为阳性对照，用正常的血清代替一抗做阴性对照。P53和P16基因的蛋白着色均为细胞核染色，呈黄色或棕褐色者为染色阳性，呈淡紫蓝色者为染色阴性。当细胞核阳性染色比例大于10% 时判断为阳性表达，小于或等于10%时判定为阴性表达。
四、结果统计学处理均采用χ2检验
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结果
一、P53、P16蛋白在喉癌组织中的表达(表1)
二、喉癌组织中P53、P16蛋白表达与临床分型(表2)
三、复发组与无复发组肿瘤组织P53、P16蛋白表达与T分期(见表3)
四、P53、P16蛋白在手术切缘中的表达(见表4)
表1 P53、P16蛋白在喉癌组织中的表达(例数) 癌组织蛋白表达
P53
P16
复发组
无复发组
, 百拇医药
复发组
无复发组
阴性
31
15
21
19
阳性
21
33
31
29
合计
52
, 百拇医药
48
52
48
注：复发组与无复发组之间比较，P值均>0.05，下表同表2 临床分型与P53、P16蛋白表达(例数，%) 分型
P53
P16
复发组
无复发组
复发组
无复发组
声门型
15/37(40.5)
, 百拇医药
24/34(70.6)
21/37(56.7)
22/34(64.7)
声门上型
6/15(40.0)
9/14(64.3)
10/15(66.7)
7/14(50.0)
表3 肿瘤组织中P53、P16蛋白表达与T分期(例数，%) 分组
T1
T2
, 百拇医药
T3
T4
P53
P16
P53
P16
P53
P16
P53
P16
复发组
3/7
3/7
, http://www.100md.com
10/21
12/21
9/16
10/16
5/8
5/8
(47.6)
(57.1)
(56.3)
(62.5)
无复发组
5/8
5/8
, 百拇医药
9/20
13/20
8/15
9/15
3/5
3/5
(45.0)
(65.0)
(53.3)
(60.0)
表4 P53、P16蛋白在喉癌手术切缘中的表达(例数) 手术切缘蛋白表达
P53
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P16
复发组
无复发组
复发组
无复发组
阴性
29
28
13
12
阳性
23
20
, 百拇医药 39
36
合计
52
48
52
48
100例喉癌组织中P53蛋白阳性者54例，占54%，P16蛋白缺失者40例，占40%；100例肿瘤标本中两者同时异常的发生率为21%；手术切缘中P53蛋白阳性和P16蛋白缺失表达者分别为43例和25例。单一基因的表达率无论P53或P16在复发组和无复发组之间差异均无显著性(P值均>0.05)。P53和P16蛋白表达在声门型和声门上型喉癌之间差异无显著性，也与T分期无关(P值均>0.05)。
五、P53、P16蛋白同时异常在喉癌手术切缘中的分布
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手术切缘粘膜中P53蛋白阳性表达与P16蛋白失活同时存在者在复发组的发生率为22%(11/52)，而在无复发组中的发生率则为4%(2/48)，2组之间差异有显著性(χ2=6.368，P<0.05)。
有意义的是喉癌组织中P53蛋白阳性表达和P16蛋白失活同时发生的21例患者中，手术切缘粘膜上皮中P53蛋白阳性表达和P16蛋白失活也同时发生者13例，其中11例在复发组(占85%)，而无复发组仅2例。讨论
喉癌治疗失败的主要原因之一是术后局部复发。手术切缘有明显肿瘤残留者术后极易复发，复发的时间间隔与手术切缘的肿瘤负荷密切相关。目前判断手术范围是否充分，或者说手术切缘是否安全的主要手段是病理学检查。但常规病理学检查为阴性时仍有一定局部复发率，这反映出病理学检查的局限性。所以寻找更为敏感的检查手段就显得很有必要。
野生型P53是最常见的抑癌基因之一，通过多种途径发挥抑癌作用[1]，并被誉为维持人类基因组稳定性的“分子警察”[2]，其蛋白产物不能被免疫组化方法检出。但突变型的P53不仅促进细胞的生长，还会影响基因组的稳定性而加快细胞恶性变[2]。突变型P53蛋白的半衰期明显延长，可通过免疫组化方法检出。P53基因的突变几乎见于所有的人类肿瘤中，在喉癌中的突变发生率约为60%，是迄今发现与喉癌的发生最为密切的癌基因[3，4]。
, 百拇医药
P16通过抑制CDK4/6(cyclin-dependent kinase 4/6)的活性而控制细胞的正常分裂和增生。大量研究发现，在上呼吸道、消化道粘膜中，P53的表达阳性率随着癌前病变的不断发展而升高，P16的表达率则逐渐降低[5，6]。本结果显示，单一种基因不论是P53阳性表达或者P16的失活在2组手术切缘中均较普遍，但在两组之间并无统计学差异，所有手术切缘粘膜上皮中P53蛋白阳性表达和P16蛋白失活同时发生者，其相应喉癌组织中也有相同发现，在复发组中P53和P16同时异常者的比例显著高于无复发组。提示P53和P16的表达异常是喉鳞癌产生过程中的早期事件，两者对喉癌的发生具有协同作用。其他作者也有相同发现[7]。因此，联合检测P53和P16对手术切缘生物学特性的估计有着积极意义。如果喉癌组织中P53和P16同时表达异常的喉癌患者其手术切缘中P53和P16也同时表达异常时，则其术后局部复发率高达85%。因此，对于这些患者有必要采取积极措施如放射治疗、化学预防或再手术等，以期减少局部复发, 改善预后。由于复发组与无复发组进行了临床分型和TNM分期等配对，因此避免了这些因素对结果的影响。因此认为，用免疫组化这一简单灵敏可靠的方法联合检测喉癌及其手术切缘中P53和P16表达状态将为医师筛选术后复发的高危患者提供有益参考,值得进一步研究和推广。
, 百拇医药
由本组中P53和P16在喉癌组织中的的异常表达可见，P53和P16的异常表达既非喉癌发生的必要条件，也非唯一条件。对于喉癌组织中缺乏P53和P16异常表达的喉癌患者采用其他癌基因或/和抑癌基因来筛选高危术后复发患者是必要的。
参考文献
1，Nigro JM, Baker SJ, Preisinger AC. Mutations in the P53 gene occur in diverse human tumor types. Nature，1989；342：705-708.
2，Lane DP. P53，guardian of the genome. Nature， 1992 ，358：15-16.
3，Maestro R, Doleetti R,Gasprotto D， et al. High frequency of P53 gene alterations associated with protein overeypresion in human squamous cell carcinoma of the larynx. Oncogene，1992, 7：1159-1166.
, 百拇医药
4，Boyle JO, John H, Koch W. The incidence of P53 mutations increases with progression of head and neck cancer. Cancer Res，1993, 53：4477-4480.
5，Califano J. Genetic progression model for head and neck cancer: implications for field cancerization. Cancer Res，1996, 56：2488-2492.
6，Nowell PC. The clonal evolution of tumor cell populations. Science，1979, 194：23-28.
7，Gallo O, Santucci M, Franchi A. Cumulative prognostic value of P16/CDKN2 and P53 oncoprotein expression in premalignant laryngeal lesions. J Natl Cancer Inst，1997, 89：1161-1163.
(收稿日期：2000-01-25), http://www.100md.com
单位：魏伯俊(中国医学科学院中国协和医科大学北京协和医院耳鼻咽喉科 北京 100730)；唐平章 屠规益(中国医学科学院肿瘤医院头颈外科)；吕宁(病理科)；梁克(放射生物室)
关键词：喉肿瘤；蛋白质P53；蛋白质P16；肿瘤复发；局部
中华耳鼻咽喉科杂志000618 【摘要】 目的 用免疫组织化学方法监测P16和P53蛋白在喉癌手术切缘中的表达情况及其与肿瘤局部复发的关系。方法 选择HE染色病理学检查手术切缘为阴性但术后肿瘤局部复发的52例喉癌作为复发组，并按照患者的年龄、性别、临床分型、TNM分期、病理分级、术前放疗剂量等可能影响因素选择48例随访5年以上无肿瘤局部复发者为无复发组。对2组手术切缘和肿瘤标本同时行P16和P53蛋白免疫组织化学检查。结果 在100例喉癌组织中P53蛋白的表达率和P16蛋白的丢失率分别为54%和40%，喉癌组织中P16和P53蛋白表达同时异常的喉癌患者当其手术切缘粘膜中P16和P53蛋白表达也同时异常时，其术后肿瘤局部复发率为85%。P16和P53蛋白表达与喉癌的临床分型和T分期无关。结论 采用免疫组化方法联合检测P16和P53蛋白在喉癌组织和手术切缘中的表达情况可为筛选术后肿瘤局部复发的高危病例提供依据。
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The status of protein P16 and P53 in the surgical margins of laryngeal carcinoma and the association with local recurrence
WEI Bojun，TANG Pingzhang, TU Guiyi, et al.
(Department of Otorhinolaryngology, Beijing Union Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing Union Medical College, Beijing 100730, China)
【Abstract】 Objective To assess the status of P53 and P16 of surgical margins in laryngeal carcinoma and the association with the local recurrence following surgical treatment Methods The status of P53 and P16 of surgical margins in laryngeal carcinoma was studied using immunohistochemistry (IHC) staining method in 100 cases of laryngeal carcinoma. Fifty-two of them had recurrent tumors while 48 cases were free of local recurrence after 5-year follow up. The original tumor sites and T stages, which bear important influence over the risk of local recurrence, were strictly matched between the two groups, and the ages and preoperative doses of radiation were also considered. Results The percentage of local recurrence was 85% in these patients who showed positive staining for P53 and simultaneous negative staining for P16 in both the cancer tissues and the surgical margins. No association was found between the expression of P53 and P16 and the clinical types or T stages. Conclusion The status of P53 and P16 in combination demonstrated by IHC technique in surgical margins of laryngeal carcinoma may predict the possibility of local recurrence.
, 百拇医药
【Key words】 Laryngeal neoplasms; Protein P53; Protein P16; Neoplasms recurrence, local
手术是治疗喉癌的主要措施，局部复发是其失败的重要原因之一。正确选择手术切缘，合理选择术后辅助治疗是预防术后局部复发最重要措施。通过检测P53和P16在喉癌组织和手术切缘中的表达情况来探讨两者的表达与术后局部复发的关系，以期能找到预测喉癌术后局部复发危险性的生物学标志，为有针对性地采取预防措施，进一步降低局部复发率提供有益的参考。
材料和方法
一、标本及处理
100例患者均为1982～1992年期间在中国医学科学院肿瘤医院头颈外科行手术治疗的喉癌患者，其中男76例，女24例，年龄37～71岁，平均57岁。复发组病例的选择： 52例术中经病理学检查手术切缘为阴性，但术后经病理证实为局部复发者；无复发组病例的选择：依据复发组病例的性别、年龄、临床分型(声门型37例、声门上型15例)、TNM分期、病理分级和术前放射治疗及剂量等因素选择条件相同或十分接近且随诊至少5年以上无局部复发喉癌患者48例，其临床分型与复发组完全相同, 其中T分期与复发组相同者47例。 2组病例手术时均无远处转移。手术切缘的取材方法：在喉癌标本整块切除后，选择距肿瘤边缘相对较近的切开处切取1～2 mm粘膜组织宽送病理检查。所有标本均经10%福尔马林固定，石腊包埋，4～5 μm连续切片，行HE染色及免疫组化染色，HE染色切片请病理学家复审核定，肿瘤标本均为鳞癌且切缘为阴性。
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二、实验试剂和方法
鼠抗人P16单克隆抗体，工作效价1∶50；鼠抗人P53单克隆抗体，工作效价1∶50；生物素标记羊抗鼠IgG，工作效价1∶100；辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，稀释度为1∶200；DAB显色液。以上试剂均购自北京中山生物工程公司(美国Zymed公司产品)。实验方法采用免疫组化SP法检测喉癌组织与切缘，具体实验步骤和方法见说明书。
三、结果判断
用已知有P53、P16染色的切片为阳性对照，用正常的血清代替一抗做阴性对照。P53和P16基因的蛋白着色均为细胞核染色，呈黄色或棕褐色者为染色阳性，呈淡紫蓝色者为染色阴性。当细胞核阳性染色比例大于10% 时判断为阳性表达，小于或等于10%时判定为阴性表达。
四、结果统计学处理均采用χ2检验
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结果
一、P53、P16蛋白在喉癌组织中的表达(表1)
二、喉癌组织中P53、P16蛋白表达与临床分型(表2)
三、复发组与无复发组肿瘤组织P53、P16蛋白表达与T分期(见表3)
四、P53、P16蛋白在手术切缘中的表达(见表4)
表1 P53、P16蛋白在喉癌组织中的表达(例数) 癌组织蛋白表达
P53
P16
复发组
无复发组
, 百拇医药
复发组
无复发组
阴性
31
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19
阳性
21
33
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29
合计
52
, 百拇医药
48
52
48
注：复发组与无复发组之间比较，P值均>0.05，下表同表2 临床分型与P53、P16蛋白表达(例数，%) 分型
P53
P16
复发组
无复发组
复发组
无复发组
声门型
15/37(40.5)
, 百拇医药
24/34(70.6)
21/37(56.7)
22/34(64.7)
声门上型
6/15(40.0)
9/14(64.3)
10/15(66.7)
7/14(50.0)
表3 肿瘤组织中P53、P16蛋白表达与T分期(例数，%) 分组
T1
T2
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T3
T4
P53
P16
P53
P16
P53
P16
P53
P16
复发组
3/7
3/7
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10/21
12/21
9/16
10/16
5/8
5/8
(47.6)
(57.1)
(56.3)
(62.5)
无复发组
5/8
5/8
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9/20
13/20
8/15
9/15
3/5
3/5
(45.0)
(65.0)
(53.3)
(60.0)
表4 P53、P16蛋白在喉癌手术切缘中的表达(例数) 手术切缘蛋白表达
P53
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P16
复发组
无复发组
复发组
无复发组
阴性
29
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阳性
23
20
, 百拇医药 39
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合计
52
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100例喉癌组织中P53蛋白阳性者54例，占54%，P16蛋白缺失者40例，占40%；100例肿瘤标本中两者同时异常的发生率为21%；手术切缘中P53蛋白阳性和P16蛋白缺失表达者分别为43例和25例。单一基因的表达率无论P53或P16在复发组和无复发组之间差异均无显著性(P值均>0.05)。P53和P16蛋白表达在声门型和声门上型喉癌之间差异无显著性，也与T分期无关(P值均>0.05)。
五、P53、P16蛋白同时异常在喉癌手术切缘中的分布
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手术切缘粘膜中P53蛋白阳性表达与P16蛋白失活同时存在者在复发组的发生率为22%(11/52)，而在无复发组中的发生率则为4%(2/48)，2组之间差异有显著性(χ2=6.368，P<0.05)。
有意义的是喉癌组织中P53蛋白阳性表达和P16蛋白失活同时发生的21例患者中，手术切缘粘膜上皮中P53蛋白阳性表达和P16蛋白失活也同时发生者13例，其中11例在复发组(占85%)，而无复发组仅2例。讨论
喉癌治疗失败的主要原因之一是术后局部复发。手术切缘有明显肿瘤残留者术后极易复发，复发的时间间隔与手术切缘的肿瘤负荷密切相关。目前判断手术范围是否充分，或者说手术切缘是否安全的主要手段是病理学检查。但常规病理学检查为阴性时仍有一定局部复发率，这反映出病理学检查的局限性。所以寻找更为敏感的检查手段就显得很有必要。
野生型P53是最常见的抑癌基因之一，通过多种途径发挥抑癌作用[1]，并被誉为维持人类基因组稳定性的“分子警察”[2]，其蛋白产物不能被免疫组化方法检出。但突变型的P53不仅促进细胞的生长，还会影响基因组的稳定性而加快细胞恶性变[2]。突变型P53蛋白的半衰期明显延长，可通过免疫组化方法检出。P53基因的突变几乎见于所有的人类肿瘤中，在喉癌中的突变发生率约为60%，是迄今发现与喉癌的发生最为密切的癌基因[3，4]。
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P16通过抑制CDK4/6(cyclin-dependent kinase 4/6)的活性而控制细胞的正常分裂和增生。大量研究发现，在上呼吸道、消化道粘膜中，P53的表达阳性率随着癌前病变的不断发展而升高，P16的表达率则逐渐降低[5，6]。本结果显示，单一种基因不论是P53阳性表达或者P16的失活在2组手术切缘中均较普遍，但在两组之间并无统计学差异，所有手术切缘粘膜上皮中P53蛋白阳性表达和P16蛋白失活同时发生者，其相应喉癌组织中也有相同发现，在复发组中P53和P16同时异常者的比例显著高于无复发组。提示P53和P16的表达异常是喉鳞癌产生过程中的早期事件，两者对喉癌的发生具有协同作用。其他作者也有相同发现[7]。因此，联合检测P53和P16对手术切缘生物学特性的估计有着积极意义。如果喉癌组织中P53和P16同时表达异常的喉癌患者其手术切缘中P53和P16也同时表达异常时，则其术后局部复发率高达85%。因此，对于这些患者有必要采取积极措施如放射治疗、化学预防或再手术等，以期减少局部复发, 改善预后。由于复发组与无复发组进行了临床分型和TNM分期等配对，因此避免了这些因素对结果的影响。因此认为，用免疫组化这一简单灵敏可靠的方法联合检测喉癌及其手术切缘中P53和P16表达状态将为医师筛选术后复发的高危患者提供有益参考,值得进一步研究和推广。
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由本组中P53和P16在喉癌组织中的的异常表达可见，P53和P16的异常表达既非喉癌发生的必要条件，也非唯一条件。对于喉癌组织中缺乏P53和P16异常表达的喉癌患者采用其他癌基因或/和抑癌基因来筛选高危术后复发患者是必要的。
参考文献
1，Nigro JM, Baker SJ, Preisinger AC. Mutations in the P53 gene occur in diverse human tumor types. Nature，1989；342：705-708.
2，Lane DP. P53，guardian of the genome. Nature， 1992 ，358：15-16.
3，Maestro R, Doleetti R,Gasprotto D， et al. High frequency of P53 gene alterations associated with protein overeypresion in human squamous cell carcinoma of the larynx. Oncogene，1992, 7：1159-1166.
, 百拇医药
4，Boyle JO, John H, Koch W. The incidence of P53 mutations increases with progression of head and neck cancer. Cancer Res，1993, 53：4477-4480.
5，Califano J. Genetic progression model for head and neck cancer: implications for field cancerization. Cancer Res，1996, 56：2488-2492.
6，Nowell PC. The clonal evolution of tumor cell populations. Science，1979, 194：23-28.
7，Gallo O, Santucci M, Franchi A. Cumulative prognostic value of P16/CDKN2 and P53 oncoprotein expression in premalignant laryngeal lesions. J Natl Cancer Inst，1997, 89：1161-1163.
(收稿日期：2000-01-25), http://www.100md.com