分子生物学与临床
作者：方福德
单位：100005 北京 中国医学科学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室(Email：fangfd@public3.bts.net.cn))
关键词：
中华耳鼻咽喉科杂志000632 一、分子生物学的理论和技术方法引入临床医学的必然性和必要性
概括起来说，生命科学包括3方面内容：①宏观论证(形而上学科)，主要特点是从宏观角度描述生命的终极表现即进化过程；②研究问题(主题学科)，主要特点是研究各种生命现象的发生机理，包括现代生命科学所有学科和交叉、边缘领域；③技术手段(方法学科)，主要特点是为研究问题而提供技术手段。上述3方面经过长期的发展过程，逐步向纵深掘进，呈现出如下的发展规律：主题学科依次沿分类学-胚胎学-遗传学的方向发展；方法学科则沿解剖学-细胞学-分子学的方向发展。由于主题学科和方法学科的发展，采用分子学技术手段去研究、解决生命科学各学科的问题，不仅成为可能，而且成为一种共同语言。这种共同语言是在分子水平上进行表达的，它就是分子生物学。这就是为什么在目前分子水平代表认识生命科学中的一个新层次和分子生物学成为带头学科的原因所在。因此，分子生物学的理论和技术方法引入临床医学是必然的，也是非常必要的。
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分子生物学的理论是什么？归纳起来，主要包括以下几方面的理论：①结构与功能关系的理论；②表型(现象)与基因型(本质)之关系的理论；③效应与信号传导之关系的理论。这些理论构成分子生物学永恒的主题。
结构与功能的关系是分子生物学很早知晓但远未阐明的问题。小分子生物活性物质的结构比较简单，并非重点研究结构与功能关系的对象，只待积累资料就行了。重点研究对象是生物大分子的结构与功能，因为两者的关系比较复杂或者非常复杂，其复杂性不仅在于其功能与一级结构相关，还与二级、三级和四级结构相关；不仅在于其功能与整体结构相关，还与分子中的区域性结构或者位点结构相关。为了研究结构、功能及其关系，技术方法的精细化、专一化和准确化是必需的，没有相应的技术方法的改进和发展，研究问题只是一句空话。正因如此，一系列为研究生物大分子的结构、功能及其关系的技术方法应运而生，主要包括两大类：一类是基于生物学原理、化学原理、光电原理及其他原理而设计的实验方法，如各种结构测定方法和功能检测方法等。结构分子生物学就是专门研究生物大分子结构和功能及其相互关系的新的分支学科。另一类是根据结构和功能而建立的各种数据库，进而进行各种生物信息的加工处理，从而在现有信息的基础上对未知结构与功能及其关系作出某种预测和提示。现在已经在这方面形成专门的分支学科，如生物信息学和计算机生物学等。实验方法与生物信息学或计算机生物学方法都很重要，两者相辅相成，相得益彰。
, 百拇医药
表型和基因型关系的研究在生命科学中具有普遍性意义。任何一种蛋白质(包括酶)或RNA的结构、表达或功能的异常，在原因上皆可追溯至相应的基因改变。基因改变包括基因结构(一级结构或空间结构)的改变和基因表达调控的改变。
基因结构改变通常引起遗传信息传递过程的改变，从而引起表达产物的数量或性质的改变。基因也存在量效效应关系，表达量过高或过低，都会产生相应的效应，如大家熟知的原癌基因，一旦表达过度，会引起很严重的后果。细胞中有一类叫“管家基因”(housekeeping gene)，需要持续进行通常是低水平的表达，方可维持细胞的日常正常工作。疾病也是一种表型。按照分子生物学和分子遗传学理论，既然疾病也是一种表型，必然有其基因型作为其发病的基础。任何疾病从根本上说，都与特定基因有关联。因此在目前，生物医学研究者最感兴趣的事情之一便是想知道哪种疾病与那种基因相关？这就是寻找疾病相关基因的工作。这是一个很重要和很大的领域，国际竞争相当激烈，形成了世纪之交的“基因大战”态势。“基因大战”的现实意义在于：谁发现了新的致病基因或疾病易感基因，谁就拥有知识产权，随之而来的是不可估量的科学意义、经济效益和社会效益。目前正在实施中的人类基因组计划是以研究人类基因组结构为主要内容的科学工程，称为基因组学(genomics)，其目标是绘制4张图：遗传图、物理图、序列图、转录图，以便为下一步的基因定位及基因识别和功能研究奠定基础，这下一步工作内容属于所谓的“后基因组学”(post-genomics)或功能基因组学(functional genomics)范畴。
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基因表达的调控是一个非常复杂的过程，包括基因本身、转录、转录后、翻译及翻译后等环节。一个基因的表达受顺式调控元件、负调控元件、反式作用因子、细胞内外信号及其他因素的调控，在很多情况下其调控是多因素、多级和网络式的模式。如果基因结构正常而表达异常，则需研究其调控失常的机理。正常生理过程本身就是正常的基因表达调控过程的模型，这种调控使基因在时空上达到有序的表达，形成特定的基因表达谱，如在特定的细胞生长阶段、特定的细胞分化阶段和特定的组织细胞类型中，都具有自己的基因表达谱。搞清正常生理过程的基因表达谱，就可以用于比较非生理过程的基因表达谱，进而了解和研究病理状态下或特定条件下的基因表达谱。
效应与信号传导关系的理论是近年来在生命科学中逐步确立的理论体系。这一理论体系试图说明细胞内外信号通过何种分子途径，与何种靶分子相互作用从而产生何种生物学效应(如基因的开启和关闭，酶的激活和失活，细胞膜通透性改变等)。因细胞内外信号涉及细胞因子、神经递质、激素、物理因素刺激、药物及其他化学物质作用等，因而几乎各个学科领域都对这个命题倍加关注。
, 百拇医药
信号传导通常经过受体作用、信号放大和效应器作用3个阶段。有的细胞外信号没有相应的受体，可直接通过细胞膜进入细胞快速发挥效应(如一氧化氮)。信号通过细胞膜受体的传导称为跨膜信号传导，跨膜信号传导与其细胞内信号传导相偶联。目前在真核细胞中已知道存在5种重要的信号传导系统：它们与离子通道、第二信使、蛋白激酶、核内受体(转录因子)等密切相关。90年代以来，信号传导研究的重点逐步趋向于信息的相互串联(crosstalk)，即信号分子的相互作用。信号分子的相互作用包括细胞内信号的相互作用、胞浆和胞核信号的相互作用以及核内信号的相互作用等。这样就把信号传导与生物学效应关系的研究推向立体交叉网络层次，它在信号传导和生物学效应之间搭起了一座“立交桥”。这样看来，今天仅仅用简单的信号传导知识来解释某种生物学效应已经显得不够了。因此，应用分子生物学(包括分子生理学、分子药理学、分子病理学等)理论和方法去研究深层次的信号传导与生物学效应的关系，势在必行。
二、临床医学如何引进分子生物学的理论和技术方法
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首先应当明确，任何一种技术方法都是为解决某种问题而建立起来和被应用的。技术方法是“工具”、“手段”，而不是“目的”，“目的”是“解决问题”。所以，“问题”的提出至关重要。
这里想讨论的是，假设一个待研究的临床“问题”已经被提出来，怎样采用分子生物学理论和技术方法去研究、去解决呢？欲研究和解决这样的“问题”，可以分两步走：第一步叫初步结合，第二步叫深入结合。所谓初步结合，就是采用现代分子生物学的技术方法和技术路线这些“工具”，获得一定的实验结果，去回答特定的和有限的问题，即回答“问题”中的局部问题。如，假设“问题”中涉及基因的结构和功能两部分工作，结构部分的工作又涉及“是否发生一级结构的改变？”和“如果发生结构改变，其改变的位点和类型若何？”针对这些具体问题，可分别采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(polymerase chain reaction/single strand conformation polymorphism analysis，PCR/SSCP)法和序列测定等常规技术手段予以解决。在临床医学研究中，类似于上述情况比比皆是。因此，分子生物学技术方法在临床医学中的应用是大有可为的，如果分子生物学与临床问题结合得好，可突破原来的学科界限，解决单独学科解决不了的问题，从而使研究水平得到提高。分子生物学现有技术方法有很强的针对性，可用来解决各种问题。兹将一些主要的技术方法及其可以解决的问题归纳于下，供参考。特别要说明的是，随着学科的发展，技术方法也在不断发展，新技术、新方法的不断涌现是分子生物学发展的特点之一。
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1.基因克隆和分离：基因文库的构建——采用分子克隆技术(采用质粒、噬菌体、粘粒或人工酵母染色体(简称YAC载体)；基因分离策略——功能性克隆：根据蛋白质氨基酸序列合成探针筛选法、免疫筛选法、PCR筛选法；定位克隆：采用限制酶片段长度多态性分析法(简称RFLP法)、遗传连锁分析法、染色体跳跃或步移法、基因组扫描、突变检测体系；表型克隆：采用差异显示法，差减杂交法。
2.基因结构测定：基因序列测定采用化学法、Sanger法、自动测序仪、物理学方法、芯片技术；基因组织测定采用限制酶酶谱法、测序法。
3.基因表达及其调控：①染色质结构和功能，采用活性染色质的分离、体外转录体系、DNAseI超敏感位点的检测和DNA甲基化作用检测；②转录水平调控信使RNA(mRNA)分离、纯化和鉴定采用mRNA量测定、Northern印迹杂交、DNA结合蛋白的检测、电泳迁移率滞后法、DnaseI足迹法、Southwestern印迹法、DNA-蛋白质复合物紫外交联法、滤膜结合法、基因转录活性的检测、转录起始位点的测定、体外转录、报告基因活性检测、mRNA定量测定反式作用因子相互作用的检测、双杂交体转录体系、共转染体系细胞特异性基因表达研究方法、递减杂交文库、mRNA差异显示法；③翻译水平的调控采用体外翻译体系、翻译后修饰(磷酸化、乙酰化等)、产物检测、Westhern blot、免疫荧光法、放射免疫法等；④基因水平研究采用RFLP分析、Southern印迹杂交、PCR法、斑点杂交、原位杂交、顺式调控元件鉴定；⑤转基因技术与基因剔除(gene knock out)研究，采用转基因技术、显微注射法、反转录病毒法、胚胎干细胞法、基因打靶技术、反义核酸技术、核酶技术等。
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4.基因诊断：策略、途径和应用研究——基因突变的检测：采用基因探针技术(印迹杂交、点杂交、原位杂交、寡核苷酸探针技术)、PCR技术、变性梯度胶法、SSCP法等，DNA链置换法；连接酶介导法等。基因探查；RFLP分析；连锁分析。mRNA检测；印迹杂交；斑点杂交；反转录PCR(RT-PCR)法。
5.基因治疗：策略、途径和应用的研究——采用基因替代、基因打靶、增强免疫功能、新型载体的使用、新的基因转移技术的应用、外源基因表达及其调控。
6.基因工程：产品开发的研究，采用原核表达体系，下游工作，生物活性测定，真核表达体系。
分子生物学技术方法与临床医学研究的初步结合并不困难，任何一个实验室只要具备最基本的条件，就可开展起来。在我国临床医学界，分子生物学技术方法的引进已经比较普遍了，有的还做得相当好。但是，在一些研究生论文和专业刊物的投稿中，也发现对分子生物学技术方法使用不当的情形。一种情形是技术操作不当，如重复性不佳和缺乏必须的对照等。例如：有的论文中在作Northern印迹杂交时不做内对照，严格来讲，这样的结果是不应被接受发表的。又如，有的论文中斑点杂交图谱出现明显的操作误差，按倍数稀释的斑点，高稀释度的杂交斑点比低稀释度的杂交斑点反而呈现更强的杂交信号，这样的结果是不能用的。另一种情况是技术方法使用不当，有的文章不管是否必要，都要做分子杂交，实际上对于要说明的问题并无用处，这说明有些人对分子生物学技术方法的应用尚缺乏足够的了解。
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所谓深入结合，是指在说明“问题”这一层次上的结合，做到这一点难度较大，需要探索和一定的积累。如何将分子生物学理论和技术方法与临床医学理论和技术方法结合去解决临床“问题”，达到深入结合，目前还很难归纳出一个模式来，有待大家去努力摸索。深入结合做得好不好，应当由科学实践来证明，如果有创新性成果，说明结合得好。
三、分子生物学研究新的理论和技术体系的建立
尽管分子生物学从20世纪50年代创立以来，50年间取得了辉煌成果，成为生命科学的领头学科，但就其思维模式来讲，仍属“线性思维”，即把某一表型(疾病)与某一种或某几种基因相对应。事实上任何生命现象(包括健康状态和疾病状态)都涉及一系列基因的变化(结构或表达的变化)。因此，必须变线性思维为整体综合思维，在基因组水平上鸟瞰相关基因的变化谱，这样才能全面而正确地阐明特定生命现象发生的机理，更好地为医学目的服务。这就是由医学科学家首先建议而后启动的20世纪最伟大的科学工程“人类基因组计划”之所以能够取得国际共识和成功的原因所在。如果说在过去所进行的实验室作坊式的研究仅仅局限于单个基因遗传信息表达的检测，到了90年代则转变为对整个基因组所包含的所有基因的考察，这就形成了一门新的分支学科——基因组学(图1)。
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图1 基因组学体系
基因组学包括结构基因组学和功能基因组学，结构基因组学的主要目标是绘制4张图：遗传连锁图、物理图、序列图和转录图，总的来说是侧重于结构分析。基因组序列结构是一部“天书”，它的真实生物学含义由“功能”来体现。故功能基因组学的主要目标是识别、鉴定和克隆包含于基因组中的全部基因，并研究其功能及其相互作用的综合结果。功能基因组学包含转录物组学、蛋白质组学、代谢物组学，这些“组学”是研究基因组表达不同层次发生的分子事件及其相互作用和相互关系。而且，由于基因组信息传递过程中的修饰和放大，从基因组到代谢物组，每个层次其信息量和相互作用量大大地被扩增，因此产出的数据含量极大，运用手工操作远远不能胜任。因此，必须发展以高通量、大规模、自动化为技术特点的基因组研究新技术。现已研究出的符合这一技术特点的新技术有微阵列(microarray)和基因芯片(gene chip)技术，新的质谱技术，无凝胶电泳技术，单细胞基因组扩增技术等。由此可见，在功能基因组学研究中，有2个重点，一是“功能”，一是新技术体系的建立，有了这2方面的基础，新的理论体系就有可能构筑起来。临床医师从医疗实践中提出科学问题，并与基础学科的科学家共同合作研究，从基因组、基因原理入手，继而阐明基因后的生理和病理发生过程，有可能最终搞清疾病发生发展的机理，为解决诊断、治疗和预防提供有力的科学依据，可以说，临床与基础相结合是取得成功的一条必由之路。
(收稿日期：2000-06-14), http://www.100md.com
单位：100005 北京 中国医学科学院基础医学研究所医学分子生物学国家重点实验室(Email：fangfd@public3.bts.net.cn))
关键词：
中华耳鼻咽喉科杂志000632 一、分子生物学的理论和技术方法引入临床医学的必然性和必要性
概括起来说，生命科学包括3方面内容：①宏观论证(形而上学科)，主要特点是从宏观角度描述生命的终极表现即进化过程；②研究问题(主题学科)，主要特点是研究各种生命现象的发生机理，包括现代生命科学所有学科和交叉、边缘领域；③技术手段(方法学科)，主要特点是为研究问题而提供技术手段。上述3方面经过长期的发展过程，逐步向纵深掘进，呈现出如下的发展规律：主题学科依次沿分类学-胚胎学-遗传学的方向发展；方法学科则沿解剖学-细胞学-分子学的方向发展。由于主题学科和方法学科的发展，采用分子学技术手段去研究、解决生命科学各学科的问题，不仅成为可能，而且成为一种共同语言。这种共同语言是在分子水平上进行表达的，它就是分子生物学。这就是为什么在目前分子水平代表认识生命科学中的一个新层次和分子生物学成为带头学科的原因所在。因此，分子生物学的理论和技术方法引入临床医学是必然的，也是非常必要的。
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分子生物学的理论是什么？归纳起来，主要包括以下几方面的理论：①结构与功能关系的理论；②表型(现象)与基因型(本质)之关系的理论；③效应与信号传导之关系的理论。这些理论构成分子生物学永恒的主题。
结构与功能的关系是分子生物学很早知晓但远未阐明的问题。小分子生物活性物质的结构比较简单，并非重点研究结构与功能关系的对象，只待积累资料就行了。重点研究对象是生物大分子的结构与功能，因为两者的关系比较复杂或者非常复杂，其复杂性不仅在于其功能与一级结构相关，还与二级、三级和四级结构相关；不仅在于其功能与整体结构相关，还与分子中的区域性结构或者位点结构相关。为了研究结构、功能及其关系，技术方法的精细化、专一化和准确化是必需的，没有相应的技术方法的改进和发展，研究问题只是一句空话。正因如此，一系列为研究生物大分子的结构、功能及其关系的技术方法应运而生，主要包括两大类：一类是基于生物学原理、化学原理、光电原理及其他原理而设计的实验方法，如各种结构测定方法和功能检测方法等。结构分子生物学就是专门研究生物大分子结构和功能及其相互关系的新的分支学科。另一类是根据结构和功能而建立的各种数据库，进而进行各种生物信息的加工处理，从而在现有信息的基础上对未知结构与功能及其关系作出某种预测和提示。现在已经在这方面形成专门的分支学科，如生物信息学和计算机生物学等。实验方法与生物信息学或计算机生物学方法都很重要，两者相辅相成，相得益彰。
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表型和基因型关系的研究在生命科学中具有普遍性意义。任何一种蛋白质(包括酶)或RNA的结构、表达或功能的异常，在原因上皆可追溯至相应的基因改变。基因改变包括基因结构(一级结构或空间结构)的改变和基因表达调控的改变。
基因结构改变通常引起遗传信息传递过程的改变，从而引起表达产物的数量或性质的改变。基因也存在量效效应关系，表达量过高或过低，都会产生相应的效应，如大家熟知的原癌基因，一旦表达过度，会引起很严重的后果。细胞中有一类叫“管家基因”(housekeeping gene)，需要持续进行通常是低水平的表达，方可维持细胞的日常正常工作。疾病也是一种表型。按照分子生物学和分子遗传学理论，既然疾病也是一种表型，必然有其基因型作为其发病的基础。任何疾病从根本上说，都与特定基因有关联。因此在目前，生物医学研究者最感兴趣的事情之一便是想知道哪种疾病与那种基因相关？这就是寻找疾病相关基因的工作。这是一个很重要和很大的领域，国际竞争相当激烈，形成了世纪之交的“基因大战”态势。“基因大战”的现实意义在于：谁发现了新的致病基因或疾病易感基因，谁就拥有知识产权，随之而来的是不可估量的科学意义、经济效益和社会效益。目前正在实施中的人类基因组计划是以研究人类基因组结构为主要内容的科学工程，称为基因组学(genomics)，其目标是绘制4张图：遗传图、物理图、序列图、转录图，以便为下一步的基因定位及基因识别和功能研究奠定基础，这下一步工作内容属于所谓的“后基因组学”(post-genomics)或功能基因组学(functional genomics)范畴。
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基因表达的调控是一个非常复杂的过程，包括基因本身、转录、转录后、翻译及翻译后等环节。一个基因的表达受顺式调控元件、负调控元件、反式作用因子、细胞内外信号及其他因素的调控，在很多情况下其调控是多因素、多级和网络式的模式。如果基因结构正常而表达异常，则需研究其调控失常的机理。正常生理过程本身就是正常的基因表达调控过程的模型，这种调控使基因在时空上达到有序的表达，形成特定的基因表达谱，如在特定的细胞生长阶段、特定的细胞分化阶段和特定的组织细胞类型中，都具有自己的基因表达谱。搞清正常生理过程的基因表达谱，就可以用于比较非生理过程的基因表达谱，进而了解和研究病理状态下或特定条件下的基因表达谱。
效应与信号传导关系的理论是近年来在生命科学中逐步确立的理论体系。这一理论体系试图说明细胞内外信号通过何种分子途径，与何种靶分子相互作用从而产生何种生物学效应(如基因的开启和关闭，酶的激活和失活，细胞膜通透性改变等)。因细胞内外信号涉及细胞因子、神经递质、激素、物理因素刺激、药物及其他化学物质作用等，因而几乎各个学科领域都对这个命题倍加关注。
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信号传导通常经过受体作用、信号放大和效应器作用3个阶段。有的细胞外信号没有相应的受体，可直接通过细胞膜进入细胞快速发挥效应(如一氧化氮)。信号通过细胞膜受体的传导称为跨膜信号传导，跨膜信号传导与其细胞内信号传导相偶联。目前在真核细胞中已知道存在5种重要的信号传导系统：它们与离子通道、第二信使、蛋白激酶、核内受体(转录因子)等密切相关。90年代以来，信号传导研究的重点逐步趋向于信息的相互串联(crosstalk)，即信号分子的相互作用。信号分子的相互作用包括细胞内信号的相互作用、胞浆和胞核信号的相互作用以及核内信号的相互作用等。这样就把信号传导与生物学效应关系的研究推向立体交叉网络层次，它在信号传导和生物学效应之间搭起了一座“立交桥”。这样看来，今天仅仅用简单的信号传导知识来解释某种生物学效应已经显得不够了。因此，应用分子生物学(包括分子生理学、分子药理学、分子病理学等)理论和方法去研究深层次的信号传导与生物学效应的关系，势在必行。
二、临床医学如何引进分子生物学的理论和技术方法
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首先应当明确，任何一种技术方法都是为解决某种问题而建立起来和被应用的。技术方法是“工具”、“手段”，而不是“目的”，“目的”是“解决问题”。所以，“问题”的提出至关重要。
这里想讨论的是，假设一个待研究的临床“问题”已经被提出来，怎样采用分子生物学理论和技术方法去研究、去解决呢？欲研究和解决这样的“问题”，可以分两步走：第一步叫初步结合，第二步叫深入结合。所谓初步结合，就是采用现代分子生物学的技术方法和技术路线这些“工具”，获得一定的实验结果，去回答特定的和有限的问题，即回答“问题”中的局部问题。如，假设“问题”中涉及基因的结构和功能两部分工作，结构部分的工作又涉及“是否发生一级结构的改变？”和“如果发生结构改变，其改变的位点和类型若何？”针对这些具体问题，可分别采用聚合酶链反应-单链构象多态性分析(polymerase chain reaction/single strand conformation polymorphism analysis，PCR/SSCP)法和序列测定等常规技术手段予以解决。在临床医学研究中，类似于上述情况比比皆是。因此，分子生物学技术方法在临床医学中的应用是大有可为的，如果分子生物学与临床问题结合得好，可突破原来的学科界限，解决单独学科解决不了的问题，从而使研究水平得到提高。分子生物学现有技术方法有很强的针对性，可用来解决各种问题。兹将一些主要的技术方法及其可以解决的问题归纳于下，供参考。特别要说明的是，随着学科的发展，技术方法也在不断发展，新技术、新方法的不断涌现是分子生物学发展的特点之一。
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1.基因克隆和分离：基因文库的构建——采用分子克隆技术(采用质粒、噬菌体、粘粒或人工酵母染色体(简称YAC载体)；基因分离策略——功能性克隆：根据蛋白质氨基酸序列合成探针筛选法、免疫筛选法、PCR筛选法；定位克隆：采用限制酶片段长度多态性分析法(简称RFLP法)、遗传连锁分析法、染色体跳跃或步移法、基因组扫描、突变检测体系；表型克隆：采用差异显示法，差减杂交法。
2.基因结构测定：基因序列测定采用化学法、Sanger法、自动测序仪、物理学方法、芯片技术；基因组织测定采用限制酶酶谱法、测序法。
3.基因表达及其调控：①染色质结构和功能，采用活性染色质的分离、体外转录体系、DNAseI超敏感位点的检测和DNA甲基化作用检测；②转录水平调控信使RNA(mRNA)分离、纯化和鉴定采用mRNA量测定、Northern印迹杂交、DNA结合蛋白的检测、电泳迁移率滞后法、DnaseI足迹法、Southwestern印迹法、DNA-蛋白质复合物紫外交联法、滤膜结合法、基因转录活性的检测、转录起始位点的测定、体外转录、报告基因活性检测、mRNA定量测定反式作用因子相互作用的检测、双杂交体转录体系、共转染体系细胞特异性基因表达研究方法、递减杂交文库、mRNA差异显示法；③翻译水平的调控采用体外翻译体系、翻译后修饰(磷酸化、乙酰化等)、产物检测、Westhern blot、免疫荧光法、放射免疫法等；④基因水平研究采用RFLP分析、Southern印迹杂交、PCR法、斑点杂交、原位杂交、顺式调控元件鉴定；⑤转基因技术与基因剔除(gene knock out)研究，采用转基因技术、显微注射法、反转录病毒法、胚胎干细胞法、基因打靶技术、反义核酸技术、核酶技术等。
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4.基因诊断：策略、途径和应用研究——基因突变的检测：采用基因探针技术(印迹杂交、点杂交、原位杂交、寡核苷酸探针技术)、PCR技术、变性梯度胶法、SSCP法等，DNA链置换法；连接酶介导法等。基因探查；RFLP分析；连锁分析。mRNA检测；印迹杂交；斑点杂交；反转录PCR(RT-PCR)法。
5.基因治疗：策略、途径和应用的研究——采用基因替代、基因打靶、增强免疫功能、新型载体的使用、新的基因转移技术的应用、外源基因表达及其调控。
6.基因工程：产品开发的研究，采用原核表达体系，下游工作，生物活性测定，真核表达体系。
分子生物学技术方法与临床医学研究的初步结合并不困难，任何一个实验室只要具备最基本的条件，就可开展起来。在我国临床医学界，分子生物学技术方法的引进已经比较普遍了，有的还做得相当好。但是，在一些研究生论文和专业刊物的投稿中，也发现对分子生物学技术方法使用不当的情形。一种情形是技术操作不当，如重复性不佳和缺乏必须的对照等。例如：有的论文中在作Northern印迹杂交时不做内对照，严格来讲，这样的结果是不应被接受发表的。又如，有的论文中斑点杂交图谱出现明显的操作误差，按倍数稀释的斑点，高稀释度的杂交斑点比低稀释度的杂交斑点反而呈现更强的杂交信号，这样的结果是不能用的。另一种情况是技术方法使用不当，有的文章不管是否必要，都要做分子杂交，实际上对于要说明的问题并无用处，这说明有些人对分子生物学技术方法的应用尚缺乏足够的了解。
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所谓深入结合，是指在说明“问题”这一层次上的结合，做到这一点难度较大，需要探索和一定的积累。如何将分子生物学理论和技术方法与临床医学理论和技术方法结合去解决临床“问题”，达到深入结合，目前还很难归纳出一个模式来，有待大家去努力摸索。深入结合做得好不好，应当由科学实践来证明，如果有创新性成果，说明结合得好。
三、分子生物学研究新的理论和技术体系的建立
尽管分子生物学从20世纪50年代创立以来，50年间取得了辉煌成果，成为生命科学的领头学科，但就其思维模式来讲，仍属“线性思维”，即把某一表型(疾病)与某一种或某几种基因相对应。事实上任何生命现象(包括健康状态和疾病状态)都涉及一系列基因的变化(结构或表达的变化)。因此，必须变线性思维为整体综合思维，在基因组水平上鸟瞰相关基因的变化谱，这样才能全面而正确地阐明特定生命现象发生的机理，更好地为医学目的服务。这就是由医学科学家首先建议而后启动的20世纪最伟大的科学工程“人类基因组计划”之所以能够取得国际共识和成功的原因所在。如果说在过去所进行的实验室作坊式的研究仅仅局限于单个基因遗传信息表达的检测，到了90年代则转变为对整个基因组所包含的所有基因的考察，这就形成了一门新的分支学科——基因组学(图1)。
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图1 基因组学体系
基因组学包括结构基因组学和功能基因组学，结构基因组学的主要目标是绘制4张图：遗传连锁图、物理图、序列图和转录图，总的来说是侧重于结构分析。基因组序列结构是一部“天书”，它的真实生物学含义由“功能”来体现。故功能基因组学的主要目标是识别、鉴定和克隆包含于基因组中的全部基因，并研究其功能及其相互作用的综合结果。功能基因组学包含转录物组学、蛋白质组学、代谢物组学，这些“组学”是研究基因组表达不同层次发生的分子事件及其相互作用和相互关系。而且，由于基因组信息传递过程中的修饰和放大，从基因组到代谢物组，每个层次其信息量和相互作用量大大地被扩增，因此产出的数据含量极大，运用手工操作远远不能胜任。因此，必须发展以高通量、大规模、自动化为技术特点的基因组研究新技术。现已研究出的符合这一技术特点的新技术有微阵列(microarray)和基因芯片(gene chip)技术，新的质谱技术，无凝胶电泳技术，单细胞基因组扩增技术等。由此可见，在功能基因组学研究中，有2个重点，一是“功能”，一是新技术体系的建立，有了这2方面的基础，新的理论体系就有可能构筑起来。临床医师从医疗实践中提出科学问题，并与基础学科的科学家共同合作研究，从基因组、基因原理入手，继而阐明基因后的生理和病理发生过程，有可能最终搞清疾病发生发展的机理，为解决诊断、治疗和预防提供有力的科学依据，可以说，临床与基础相结合是取得成功的一条必由之路。
(收稿日期：2000-06-14), http://www.100md.com