戊型肝炎病毒宫内感染及产儿死因研究
作者：赵素元 杨忠礼 邹林樾 仲英娜
单位：830001 乌鲁木齐，新疆自治区医院肝炎室
关键词：肝炎；疾病传播；垂直；酶联免疫吸附测定；死胎
中华儿科杂志980214.htm 本课题为新疆自治区科学技术委员会资助课题(项目编号 91328-01)
【摘要】 目的 为了从分子水平探讨孕妇感染戊型肝炎病毒(HEV)后胎儿宫内感染和死亡原因。方法 对17例患重症戊型肝炎的孕妇和娩出的18例新生儿，以酶联免疫吸附法测母血和脐带血抗-HEV IgM/IgG，同时查新生儿肝组织病理改变，免疫组化法查肝内戊型肝炎病毒抗原(HEVAg)，用地戈辛(DIG)探针标记HEVcDNA 23 qbp片段进行原位杂交查肝内HEVRNA。结果 母血抗-HEV、IgM/IgG均阳性，脐带血仅抗-HEV IgG阳性，肝组织以变性、炎变为主，新生儿肝内HEVAg阳性率77%(10/13)，HEV-RNA阳性率62%(8/13)。结论 HEV存在宫内感染。
, 百拇医药
Analysis of causes for intrauterine HEV infection and deaths of fetuses or neonates Zhao Suyuan, Yang Zhongli, Zou Linyue, et al. Hepatitis Laboratory, Department of Infectious Diseases, The Peoples′s General Hospital of Xinjiang, Urumqi 830001
【Abstract】 Objective To clarify causes for intrauterine infection of hepatitis E virus (HEV) and deaths of fetuses and neonates. Methods Umbilical cord blood of 18 neonates of 17 pregnant women with severe hepatitis E and their mothers′ blood were examined for anti-HEV IgM/IgG by using ELISA, were studial with metbod liver biopsy specimens of the neonates, HEV antigens (HEV Ag) in the biopsy specimens, were detected by using immunohistochemical method and HEA RNA was detected by using in situ hybridization with DIG probe labelled with HEVcDNA .Results The pregnant women were positive for both anti-HEV IgM/IgG in venous blood and anti-HEV IgG was positive in the cord blood specimens. The histopathological examinations showed degenerations and inflammatory cells infiltration The positive rate of immunohistochemistry for HEVAg was 77% (10/13) and positive rate of in situ hybridization for HEV RNA was 62% (8/13). Conclusion These results indicated that of intrauterine infection with HEV does exist.
, 百拇医药
【Key words】 Hepatitise Disease transmission, vertical Enzyme-linked immuno sorbent assay Fetal death
孕妇妊娠晚期患戊型肝炎(简称戊肝)易发展为重症肝炎，病死率高，并易发生死胎，流产和早产[1]。对戊型肝炎病毒(HEV)宫内感染致垂直传播及胎儿死因的研究鲜见报道。本研究从HEV抗体检测及新生儿肝组织病理及病原检查，为研究其致病机理和死亡原因提供依据。
对象与方法
一、标本来源
1986年10月～1988年5月新疆戊肝流行时疫区住院确诊的17例患重症戊肝孕妇的18例早产儿(1例双胎)，其中5例死胎、13例生后24～48小时死亡。取肝脏用10%甲醛固定、石蜡包埋待检。同时留母血和脐带血。
, 百拇医药
二、方法和试剂
1.血清免疫学检测包括甲肝病毒抗体(抗-HAV IgM)，乙肝病毒标志物HBV-M(HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc)，丙肝病毒抗体(抗-HCV IgG)。均采用酶联免疫吸附法(ELISA)，试剂购自北京生化免疫中心和珠海亚莉生物公司；戊型肝炎病毒抗体(抗-HEV IgM/IgG)，也是应用ELISA法，试剂先后用本地HE流行时研制的试剂盒[2]，北京高达生物制品研究所、上海卫民生物技术研究所三种试剂共检确定。
2.肝功能及凝血因子检测由疫区医疗队和当地医院完成。
3.新生儿肝组织检查：(1)肝组织进行常规光镜病理检查、由区防疫站病理科协助。(2)免疫组化法检测肝内戊肝病毒抗原(HEVAg)，用购自美国ZyMED公司SPTm试剂盒，本室完成[3]。(3)原位杂交法查肝内戊肝病毒核酸(HEV RNA)，用西德Bergman公司的地戈辛(DIG)探针试剂盒，按说明书标记HEVcDNA 239bp片段进行，本室完成[4]。
, 百拇医药
结果
一、临床资料
17例孕妇均为孕龄7～8个月的维吾尔族农民，年龄17～32岁，初产妇3例，经产妇14例，血清学排除HAV、HBV、HCV感染。抗-HEV IgM阳性，结合临床表现，肝功异常、凝血因子低下经住院确诊为重症戊型肝炎(急性重症15例，亚急性重症2例)[5]。18例新生儿均为早产儿，5例死胎余13例产后48小时内死亡。
二、血清学检测
母血抗-HAV IgM、HBV-M、抗-HCV IgG均阴性、抗-HEV IgM/IgG均阳性，脐带血抗-HEV IgG全阳性而IgM全阴性。肉眼观察新生儿发育营养尚可、全身皮肤紫红色、斑片状脱皮易剥脱、无黄疸，5例死胎肝脏严重自溶并有淡黄色腹水，余13例肝呈紫红色、肝瘀血、余正常。
, 百拇医药 三、肝组织光镜下检查
5例肝细胞自溶。13例主要病变为多种肝细胞变性，浊肿，伴瘀血，细胞肿大、变形，胞核大小不等双核多，汇管区有关细胞浸润偶见片状出血，未见嗜酸小体和程度不等的坏死(图1)。
四、肝内有关病原检查结果
筛出5例自溶标本。
五、免疫组化法
免疫组化法肝内HEVAg检出率为77%(10/13)，HEVAg在胞浆中呈均匀细颗粒状、弥漫分布，有的成簇状、在胞膜周边或/和核膜胞浆面围集、阳性细胞分布与肝细胞炎症平行、与肝细胞变性和胆色素分布无关，亦无汇管区集中分布现象(图2)。
六、原位杂交法
仅检测10例HEVAg阳性标本8例阳性，阳性符合率80%，阳性率至少62%(8/13)。阳性细胞呈现蓝色粗颗粒状、线状，肝细胞内表达位于核膜和胞膜周围以显示出细胞和胞核界限。阳性颗粒在胞浆中随意，散在或弥漫分布，小叶中心和汇管区亦见，胞核内偶见、与肝细胞炎症无关。枯否细胞、胆管腔、胆管上皮细胞内均未见(图3)。
, 百拇医药
图1 新生儿肝细胞变性×400，HE染色，显示以变性为主
图2 新生儿肝脏免疫组化检查×400，ABC法，苏木素复染，查HEVAg在肝内定位和分布
图3 新生儿肝脏原位杂交检查×400，原位杂交法查HEV-RNA在肝内的定位和分布 讨论
戊型肝炎病毒垂直传播的研究近年已有学者重视而对胎儿和新生儿死因的报道尚少见。本组17例重症戊型肝炎孕妇脐带血抗-HEV-IgG均为阳性，5例早产儿肝细胞自溶，13例有肝组织学病理改变、HEVAg和HEV RNA的检出可证实新生儿肝病变来自HEV的宫内感染导致的母婴垂直传播。与Khuroo等[6]通过对新生儿生后随访半年的研究，认为存在垂直传播的观点吻合，本研究从免疫病理和分子病理角度研究证明HEV宫内感染的存在提供直接证据，排除生后诸多因素的影响。
值得讨论的是有学者[7]通过灵长类(猴)实验动物研究认为感染HEV后子代不存在垂直传播。而本组资料可能与母体病情轻重、病毒含量有关，因为重症肝炎时母体中病毒含量多、毒力强，病毒血症和肝坏死重，对胎儿相应病毒入侵多，毒力也强，即或此时母体中有少量抗-HEV IgG形成通过脐带进入胎儿体内，但因含量少不具有保护作用，由于胎儿在宫内感染HEV后的病毒血症以及重症戊肝对胎儿的非特异因素影响，如缺血、缺氧等易导致死胎和早产。又因胎儿免疫功能不完善，HEV大量入侵后抗-HEV-IgG也低度的进入致胎肝未来得及形成坏死性病变而死亡，如母体中HEV少，毒力弱则肝脏炎症轻，胎儿可正常出生并可获得保护性抗体。
, 百拇医药
因此通过本研究提示，在疫苗未问世前对孕妇、尤其围产期孕妇感染HEV患HE时，要重视管理和治疗，挽救两代人的生命。
参考文献
1 赵素元.中国.新疆における流行性非A非B型肝炎3160例の.临床的检讨感染症学杂志，1990，64：105-111.
2 刘占娥，曾学义，热西达，等.酶联免疫试验检测肠道传播的非甲非乙型肝炎粪便抗原和血清IgM抗体的研究.中华流行病学杂志，1989，10(特刊8)：116-118.
3 赵素元，邹林樾，杨忠礼，等.免疫组化法检测戊肝病毒抗原.中华肝脏病杂志，1997，5：58-60.
4 赵素元，杨忠礼，邹林樾.原位杂交法检测HEV RNA.中华肝脏病杂志，1997，5：155.
, http://www.100md.com
5 中华医学会传染病寄生虫病学会修订.病毒性肝炎防治方案(试行).1995年5月北京.第五次全国传染病寄生虫病学术会议.中华传染病杂志，1995，13：241-247.
6 Khuroo MS,Kanilis Jameels. Vertical transmission of hepatitis E Virus. Lancet, 1995, 345:1025-1026.
7 Sergeri A, Tsarev, Tatiana S, et al.实验性戊型肝炎孕猴对子代无垂直传播及其自然获得抗体的证据.孙梅龙，杨可清摘译.国外医学流行病学分册，1996，23：47-48.
(收稿：1997-03-12 修回：1997-08-06), 百拇医药
单位：830001 乌鲁木齐，新疆自治区医院肝炎室
关键词：肝炎；疾病传播；垂直；酶联免疫吸附测定；死胎
中华儿科杂志980214.htm 本课题为新疆自治区科学技术委员会资助课题(项目编号 91328-01)
【摘要】 目的 为了从分子水平探讨孕妇感染戊型肝炎病毒(HEV)后胎儿宫内感染和死亡原因。方法 对17例患重症戊型肝炎的孕妇和娩出的18例新生儿，以酶联免疫吸附法测母血和脐带血抗-HEV IgM/IgG，同时查新生儿肝组织病理改变，免疫组化法查肝内戊型肝炎病毒抗原(HEVAg)，用地戈辛(DIG)探针标记HEVcDNA 23 qbp片段进行原位杂交查肝内HEVRNA。结果 母血抗-HEV、IgM/IgG均阳性，脐带血仅抗-HEV IgG阳性，肝组织以变性、炎变为主，新生儿肝内HEVAg阳性率77%(10/13)，HEV-RNA阳性率62%(8/13)。结论 HEV存在宫内感染。
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Analysis of causes for intrauterine HEV infection and deaths of fetuses or neonates Zhao Suyuan, Yang Zhongli, Zou Linyue, et al. Hepatitis Laboratory, Department of Infectious Diseases, The Peoples′s General Hospital of Xinjiang, Urumqi 830001
【Abstract】 Objective To clarify causes for intrauterine infection of hepatitis E virus (HEV) and deaths of fetuses and neonates. Methods Umbilical cord blood of 18 neonates of 17 pregnant women with severe hepatitis E and their mothers′ blood were examined for anti-HEV IgM/IgG by using ELISA, were studial with metbod liver biopsy specimens of the neonates, HEV antigens (HEV Ag) in the biopsy specimens, were detected by using immunohistochemical method and HEA RNA was detected by using in situ hybridization with DIG probe labelled with HEVcDNA .Results The pregnant women were positive for both anti-HEV IgM/IgG in venous blood and anti-HEV IgG was positive in the cord blood specimens. The histopathological examinations showed degenerations and inflammatory cells infiltration The positive rate of immunohistochemistry for HEVAg was 77% (10/13) and positive rate of in situ hybridization for HEV RNA was 62% (8/13). Conclusion These results indicated that of intrauterine infection with HEV does exist.
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【Key words】 Hepatitise Disease transmission, vertical Enzyme-linked immuno sorbent assay Fetal death
孕妇妊娠晚期患戊型肝炎(简称戊肝)易发展为重症肝炎，病死率高，并易发生死胎，流产和早产[1]。对戊型肝炎病毒(HEV)宫内感染致垂直传播及胎儿死因的研究鲜见报道。本研究从HEV抗体检测及新生儿肝组织病理及病原检查，为研究其致病机理和死亡原因提供依据。
对象与方法
一、标本来源
1986年10月～1988年5月新疆戊肝流行时疫区住院确诊的17例患重症戊肝孕妇的18例早产儿(1例双胎)，其中5例死胎、13例生后24～48小时死亡。取肝脏用10%甲醛固定、石蜡包埋待检。同时留母血和脐带血。
, 百拇医药
二、方法和试剂
1.血清免疫学检测包括甲肝病毒抗体(抗-HAV IgM)，乙肝病毒标志物HBV-M(HBsAg、抗-HBs、HBeAg、抗-HBe、抗-HBc)，丙肝病毒抗体(抗-HCV IgG)。均采用酶联免疫吸附法(ELISA)，试剂购自北京生化免疫中心和珠海亚莉生物公司；戊型肝炎病毒抗体(抗-HEV IgM/IgG)，也是应用ELISA法，试剂先后用本地HE流行时研制的试剂盒[2]，北京高达生物制品研究所、上海卫民生物技术研究所三种试剂共检确定。
2.肝功能及凝血因子检测由疫区医疗队和当地医院完成。
3.新生儿肝组织检查：(1)肝组织进行常规光镜病理检查、由区防疫站病理科协助。(2)免疫组化法检测肝内戊肝病毒抗原(HEVAg)，用购自美国ZyMED公司SPTm试剂盒，本室完成[3]。(3)原位杂交法查肝内戊肝病毒核酸(HEV RNA)，用西德Bergman公司的地戈辛(DIG)探针试剂盒，按说明书标记HEVcDNA 239bp片段进行，本室完成[4]。
, 百拇医药
结果
一、临床资料
17例孕妇均为孕龄7～8个月的维吾尔族农民，年龄17～32岁，初产妇3例，经产妇14例，血清学排除HAV、HBV、HCV感染。抗-HEV IgM阳性，结合临床表现，肝功异常、凝血因子低下经住院确诊为重症戊型肝炎(急性重症15例，亚急性重症2例)[5]。18例新生儿均为早产儿，5例死胎余13例产后48小时内死亡。
二、血清学检测
母血抗-HAV IgM、HBV-M、抗-HCV IgG均阴性、抗-HEV IgM/IgG均阳性，脐带血抗-HEV IgG全阳性而IgM全阴性。肉眼观察新生儿发育营养尚可、全身皮肤紫红色、斑片状脱皮易剥脱、无黄疸，5例死胎肝脏严重自溶并有淡黄色腹水，余13例肝呈紫红色、肝瘀血、余正常。
, 百拇医药 三、肝组织光镜下检查
5例肝细胞自溶。13例主要病变为多种肝细胞变性，浊肿，伴瘀血，细胞肿大、变形，胞核大小不等双核多，汇管区有关细胞浸润偶见片状出血，未见嗜酸小体和程度不等的坏死(图1)。
四、肝内有关病原检查结果
筛出5例自溶标本。
五、免疫组化法
免疫组化法肝内HEVAg检出率为77%(10/13)，HEVAg在胞浆中呈均匀细颗粒状、弥漫分布，有的成簇状、在胞膜周边或/和核膜胞浆面围集、阳性细胞分布与肝细胞炎症平行、与肝细胞变性和胆色素分布无关，亦无汇管区集中分布现象(图2)。
六、原位杂交法
仅检测10例HEVAg阳性标本8例阳性，阳性符合率80%，阳性率至少62%(8/13)。阳性细胞呈现蓝色粗颗粒状、线状，肝细胞内表达位于核膜和胞膜周围以显示出细胞和胞核界限。阳性颗粒在胞浆中随意，散在或弥漫分布，小叶中心和汇管区亦见，胞核内偶见、与肝细胞炎症无关。枯否细胞、胆管腔、胆管上皮细胞内均未见(图3)。
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图1 新生儿肝细胞变性×400，HE染色，显示以变性为主
图2 新生儿肝脏免疫组化检查×400，ABC法，苏木素复染，查HEVAg在肝内定位和分布
图3 新生儿肝脏原位杂交检查×400，原位杂交法查HEV-RNA在肝内的定位和分布 讨论
戊型肝炎病毒垂直传播的研究近年已有学者重视而对胎儿和新生儿死因的报道尚少见。本组17例重症戊型肝炎孕妇脐带血抗-HEV-IgG均为阳性，5例早产儿肝细胞自溶，13例有肝组织学病理改变、HEVAg和HEV RNA的检出可证实新生儿肝病变来自HEV的宫内感染导致的母婴垂直传播。与Khuroo等[6]通过对新生儿生后随访半年的研究，认为存在垂直传播的观点吻合，本研究从免疫病理和分子病理角度研究证明HEV宫内感染的存在提供直接证据，排除生后诸多因素的影响。
值得讨论的是有学者[7]通过灵长类(猴)实验动物研究认为感染HEV后子代不存在垂直传播。而本组资料可能与母体病情轻重、病毒含量有关，因为重症肝炎时母体中病毒含量多、毒力强，病毒血症和肝坏死重，对胎儿相应病毒入侵多，毒力也强，即或此时母体中有少量抗-HEV IgG形成通过脐带进入胎儿体内，但因含量少不具有保护作用，由于胎儿在宫内感染HEV后的病毒血症以及重症戊肝对胎儿的非特异因素影响，如缺血、缺氧等易导致死胎和早产。又因胎儿免疫功能不完善，HEV大量入侵后抗-HEV-IgG也低度的进入致胎肝未来得及形成坏死性病变而死亡，如母体中HEV少，毒力弱则肝脏炎症轻，胎儿可正常出生并可获得保护性抗体。
, 百拇医药
因此通过本研究提示，在疫苗未问世前对孕妇、尤其围产期孕妇感染HEV患HE时，要重视管理和治疗，挽救两代人的生命。
参考文献
1 赵素元.中国.新疆における流行性非A非B型肝炎3160例の.临床的检讨感染症学杂志，1990，64：105-111.
2 刘占娥，曾学义，热西达，等.酶联免疫试验检测肠道传播的非甲非乙型肝炎粪便抗原和血清IgM抗体的研究.中华流行病学杂志，1989，10(特刊8)：116-118.
3 赵素元，邹林樾，杨忠礼，等.免疫组化法检测戊肝病毒抗原.中华肝脏病杂志，1997，5：58-60.
4 赵素元，杨忠礼，邹林樾.原位杂交法检测HEV RNA.中华肝脏病杂志，1997，5：155.
, http://www.100md.com
5 中华医学会传染病寄生虫病学会修订.病毒性肝炎防治方案(试行).1995年5月北京.第五次全国传染病寄生虫病学术会议.中华传染病杂志，1995，13：241-247.
6 Khuroo MS,Kanilis Jameels. Vertical transmission of hepatitis E Virus. Lancet, 1995, 345:1025-1026.
7 Sergeri A, Tsarev, Tatiana S, et al.实验性戊型肝炎孕猴对子代无垂直传播及其自然获得抗体的证据.孙梅龙，杨可清摘译.国外医学流行病学分册，1996，23：47-48.
(收稿：1997-03-12 修回：1997-08-06), 百拇医药