四种化疗药物诱导正常骨髓及白细胞株凋亡作用的比较
作者：赵卫红 于载泺 叶奇鲁 马瑞英 寿好长
单位：100034 北京医科大学第一医院儿科
关键词：脱噬作用；骨髓；白血病
中华儿科杂志980210.htm 【摘要】 目的 探讨化疗药物诱导正常骨髓及白血病细胞凋亡作用的差异。方法 检测了临床常用4种药物作用后凋亡细胞出现的比例(形态学指标为APO%、流式细胞仪指标为sub-G1%)和细胞DNA断裂(ladder)的变化。结果 足叶乙甙、阿糖胞苷、长春新碱、柔红霉素作用48小时，正常骨髓细胞APO%分别为17.9%±4.6%、30.5%±6.5%、16.7%±4.2%、12.3%±0.7%；sub-G1%分别为10.5%±3.1%、27.9%±4.7%、6.5%±1.5%、4.5%±1.5%、仅阿糖胞苷组有ladder出现。白血病细胞株APO%分别为80.9%±8.4%、38.1%±7.7%、52.6%±9.3%、24.2%±6.1%；sub-G1%分别为73.4%±12.7%、59.8%±10.1%、47.6%±9.3%、26.7%±6.8%，且都有ladder出现。结论 化疗药物也能诱导正常骨髓细胞凋亡，但明显低于诱导白血病细胞凋亡的作用。
, 百拇医药
Apoptosis in normal bone marrow and leukemic cell line induced by four kinds of chemotherapeutic agents Zhao Weihong, Yu Zaile, Ye Qilu, et al. Department of Pediatrics, The First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034
【Abstract】 Objective To investigate the differences in apoptosis between normal bone marrow cells and leukemic cell line induced by chemotherapeutic agents. Methods The authors observed the percentage of apoptotic cells (morphological study-APO%, flow cytometry-subG1%) and performed DNA biochemical analysis (ladder). Results The results showed that when cells were cocultured with etoposide, cytosine arabinoside, vincristine or daunorubicine for 48 hours, APO% of normal bone marrow cells was 17.9%±4.6%, 30.5%±6.5%, 16.7%±4.2% and 12.3%±0.7%, respectively, and sub-G1% was 10.5%±3.1%, 27.9%±4.7%, 6.5%±1.5% and 4.5%±1.5%, respectively. DNA only from cells with cytosine arabinoside showed ladder. While APO% of HL-60 cells was 80.9%±8.4%, 38.1%±7.7%, 52.6%±9.3% and 24.2%±6.1%, respectively and sub-G1% was 73.4%±12.7%, 59.8%±10.1%, 47.6%±9.3% and 26.7%±6.8%, respectively. Ladder was seen in DNA from cells with the four drugs treatment. Conclusion These results demonstrated that normal bone marrow cells could be induced to apoptosis by chemotherapeutic agents. The effects of four drugs inducing apoptosis on HL-60 were stronger than those on normal bone marrow cells.
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【Key words】 Apoptosis Bone marrow Leukemia
细胞凋亡是基因控制下的细胞自我消亡过程，是一种不同于坏死的细胞生理性死亡方式。目前，有关白血病细胞凋亡的研究日益增多[1，2]，而对正常骨髓细胞的研究较少。我们采用形态学观察DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪等方法观察了临床常用的几种化疗药物对正常骨髓和白血病细胞诱导凋亡的作用，以探讨化疗药物对这两种细胞作用的差异。
材料及方法
一、标本来源
12例正常骨髓标本取自本院胸外科手术切除之肋骨，除外血液系统疾病及实体瘤伴骨髓转移者，未曾进行过放疗或化疗。
人髓细胞白血病细胞株HL-60由北京医科大学血液研究所提供。
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二、实验方法
1.细胞培养：按本实验室常规制作正常骨髓单个核细胞悬液，调浓度为1×106细胞/ml；取对数生长期的HL-60细胞，调浓度为0.5×106细胞/ml，分别接种于含10%加热灭活胎牛血清的RPMI-1640液中，CO2孵箱中常规培养。分别加入不同浓度的足叶乙甙(VP-16)，即分别为1、10、100 μg/ml，阿糖胞苷(Ara-C)为1、10、100 μg/ml，长春新碱(VCR)为0.01、0.1、1 μg/ml，柔红霉素(DNR)为0.1、1、10 μg/ml，继续培养3、6、12、24、48小时，收获细胞。
2.形态学观察：将培养细胞用离心涂片机制片，甲醇固定，常规苏木精染色，油镜下观察。细胞皱缩、染色质凝聚染成深蓝色、胞核固缩断裂、胞膜仍完整者为凋亡细胞。计数200个细胞中凋亡细胞所占的比例(APO%)。
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3.DNA琼脂糖凝胶电泳：参照Ray等[3]方法。取2×106个正常骨髓细胞或1×106个HL-60细胞，PBS洗涤2遍，加入细胞裂解液及RNA酶，37℃水浴1小时，再加入蛋白酶K，50℃水浴3小时。用饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)及氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提1次。无水乙醇沉淀过夜70%乙醇洗涤1遍，真空干燥，最后溶于20 μl TE液中。取10 μl样品在1.8%琼脂糖凝胶中电泳3～4小时，电泳缓冲液为0.5×TBE，电压为2 V/cm，紫外灯下观察、拍照。有“梯状”(ladder)图谱出现者表明有细胞凋亡发生，有弥漫图谱(smear)出现者表明有细胞坏死发生。
4.流式细胞仪检测：参照Ormerod等[4]方法。取1×106细胞用PBS洗涤2遍，70%冷乙醇4℃固定过夜。次日用PBS洗涤1次，溶于0.5 ml PBS中，加入RNA酶，室温放置30分钟，加入碘化丙啶，400目尼龙膜过滤除去细胞团块，避光放置1小时内上机检测。每份标本测1×104个细胞。细胞发生凋亡后，流式细胞仪可检测到在G1期前出现1个峰，称sub-G1期，其占检测细胞的百分比(sub-G1%)即为细胞发生凋亡的比例。
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三、统计学处理
采用方差分析及t检验。
结果
一、化疗药物诱导正常骨髓细胞凋亡
不同浓度Ara-C与正常骨髓细胞共同培养3～48小时，形态学观察均可见凋亡细胞出现，APO%随药物浓度的增加而增加，在同一浓度下随作用时间延长而增加，100 μg/ml的Ara-c作用48小时，APO%达最高，为30.5%±6.5%(图1)。VP-16、VCR和DNR作用后，APO%的变化趋势同Ara-C。仅APO%比例较低，每种药物在最大浓度作用48小时，APO%分别达VP-16为17.9%±4.6%、VCR为16.7%±4.2%、DNR为12.3%±0.7%。DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示：100 μg/ml的Ara-C作用24～48小时有ladder出现，其余药物在不同浓度、不同时间均无ladder出现。
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选择每种药物在最大浓度作用48小时的条件下进行流式细胞仪检测，sub-G1%分别为：Ara-C组27.9%±4.7%、VP-16组10.5%±3.1%、VCR组6.5±1.5%、DNR组4.5%±1.5%
图1 100 μg/ml Ara-c，100 μg/ml VP-16，1 μg/ml VCR，10 μg/ml DNR作用正常骨髓细胞不同时间APO%的比较
图2 不同浓度VP-16作用于HL-60细胞不同时间诱导APO%的变化。
二、化疗药物诱导HL-60细胞凋亡及与正常骨髓细胞的比较
1.VP-16的作用：VP-16作用HL-60细胞，形态学观察到APO%也随作用时间、药物浓度的增加而增加(图2)，100 μg/ml VP-16作用48小时，APO%达最高(80.9%±8.4%)，明显高于同样浓度、时间条件下的正常骨髓细胞组(t=4.523，P?.01)。DNA琼脂糖凝胶电泳发现1、10、100 μg/ml VP-16分别作用24、12、3小时即有ladder出现，持续至48小时。流式细胞仪检测100 μg/ml的VP-16作用HL-60细胞48小时，sub-G1%也明显高于正常骨髓细胞(t=6.975，P?.01)。
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2.Ara-C及VCR的作用：Ara-C和VCR作用HL-60细胞后，3种方法的检测结果及与正常骨髓细胞的比较类似VP-16。
3.DNR的作用：0.1、1 μg/ml DNR作用HL-60细胞，检测结果与VP-16的作用类似，但10 μg/ml DNR作用HL-60细胞6～48小时，形态学观察为大量坏死细胞出现。电泳表现为smear；流式细胞仪检测是大量细胞碎片，无明显周期分布。这表明10 μg/ml DNR主要引起HL-60细胞坏死，而不是凋亡。
讨论
化疗药物在杀伤白血病细胞的同时也杀伤正常骨髓细胞，其作用差异是设计化疗方案的重要依据。我们观察到，在包括临床应用剂量在内的一定剂量范围内，4种常用化疗药物都有诱导正常骨髓细胞凋亡的作用，且其作用大小与药物浓度和作用时间有关，表明诱导凋亡也是化疗药物杀伤正常骨髓细胞的机制之一。4种药物中，Ara-C诱导正常骨髓细胞凋亡的作用最强，其次为VP-16和VCR，DNR的作用较弱。即不同药物的作用强度不同，其机制有待于进一步研究。
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我们将化疗药物对正常骨髓和HL-60细胞的作用进行比较，发现除100 μg/ml的Ara-C和10 μg/ml DNR外，其余药物的几种浓度诱导HL-60细胞凋亡的作用明显大于对正常骨髓细胞的作用。Anand等[5]将阿霉素、地塞米松、α-干扰素、羟基脲分别与慢性粒细胞白血病病人的细胞共同培养一定时间，其形态学观察有凋亡细胞出现，电泳有ladder出现。而同样条件作用正常人外周血单个核细胞，凋亡细胞数明显降低，也无ladder出现。因此，我们认为白血病细胞可能比正常细胞更容易被化疗药物诱导而凋亡，其机制可能与白血病细胞的凋亡通路或信号传导与正常细胞不同有关，有待于今后进一步研究。但这种现象提示临床上可根据这种差异设计更合理的化疗方案，提高对白血病细胞的杀伤作用，减轻对正常骨髓造血功能的抑制。
参考文献
1 Marx J. Cell death studies yield cancer clues [news]. Science, 1993, 259:760-761.
, 百拇医药
2 Lotem J, Sachs L. Regulation by bcl-2, c-myc and p53 of susceptibility to induction of apoptosis by heart shock and cancer chemotherapy compounds in differentiation-competent and -defective myeloid leukemiccells. Cell Growth Differ, 1993, 4:41-47.
3 Ray S, Ponnatpur V, Huang Y, et al. 1-beta-D-arabinofuranosylcytosine-, mitoxantrone-, and paclitaxel-induced apoptosis in HL-60 cells: improvedmethod for detection of internucleosomal DNA fragmentation. Cancer Chemother Pharmacol, 1994, 34:365-371.
, http://www.100md.com
4 Ormerod MG, Collins MK, Rodrigucz-Tarduchy G, et al. Apoptosis in interleukin-3-depenednt haemopoietic cells. Quantitation by two flow cytometric methods. J Immunol Methods, 1992, 153:57-65.
5 Anand S, Verma H, Kumar L, et al. Induction of apoptosis in chronic myelogenous leukemia lymphocytes by hydroxyurea and adriamycin. Cancer Lett, 1995, 88:101-105.
(收稿：1997-02-18 修回：1997-06-08), http://www.100md.com
单位：100034 北京医科大学第一医院儿科
关键词：脱噬作用；骨髓；白血病
中华儿科杂志980210.htm 【摘要】 目的 探讨化疗药物诱导正常骨髓及白血病细胞凋亡作用的差异。方法 检测了临床常用4种药物作用后凋亡细胞出现的比例(形态学指标为APO%、流式细胞仪指标为sub-G1%)和细胞DNA断裂(ladder)的变化。结果 足叶乙甙、阿糖胞苷、长春新碱、柔红霉素作用48小时，正常骨髓细胞APO%分别为17.9%±4.6%、30.5%±6.5%、16.7%±4.2%、12.3%±0.7%；sub-G1%分别为10.5%±3.1%、27.9%±4.7%、6.5%±1.5%、4.5%±1.5%、仅阿糖胞苷组有ladder出现。白血病细胞株APO%分别为80.9%±8.4%、38.1%±7.7%、52.6%±9.3%、24.2%±6.1%；sub-G1%分别为73.4%±12.7%、59.8%±10.1%、47.6%±9.3%、26.7%±6.8%，且都有ladder出现。结论 化疗药物也能诱导正常骨髓细胞凋亡，但明显低于诱导白血病细胞凋亡的作用。
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Apoptosis in normal bone marrow and leukemic cell line induced by four kinds of chemotherapeutic agents Zhao Weihong, Yu Zaile, Ye Qilu, et al. Department of Pediatrics, The First Hospital, Beijing Medical University, Beijing 100034
【Abstract】 Objective To investigate the differences in apoptosis between normal bone marrow cells and leukemic cell line induced by chemotherapeutic agents. Methods The authors observed the percentage of apoptotic cells (morphological study-APO%, flow cytometry-subG1%) and performed DNA biochemical analysis (ladder). Results The results showed that when cells were cocultured with etoposide, cytosine arabinoside, vincristine or daunorubicine for 48 hours, APO% of normal bone marrow cells was 17.9%±4.6%, 30.5%±6.5%, 16.7%±4.2% and 12.3%±0.7%, respectively, and sub-G1% was 10.5%±3.1%, 27.9%±4.7%, 6.5%±1.5% and 4.5%±1.5%, respectively. DNA only from cells with cytosine arabinoside showed ladder. While APO% of HL-60 cells was 80.9%±8.4%, 38.1%±7.7%, 52.6%±9.3% and 24.2%±6.1%, respectively and sub-G1% was 73.4%±12.7%, 59.8%±10.1%, 47.6%±9.3% and 26.7%±6.8%, respectively. Ladder was seen in DNA from cells with the four drugs treatment. Conclusion These results demonstrated that normal bone marrow cells could be induced to apoptosis by chemotherapeutic agents. The effects of four drugs inducing apoptosis on HL-60 were stronger than those on normal bone marrow cells.
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【Key words】 Apoptosis Bone marrow Leukemia
细胞凋亡是基因控制下的细胞自我消亡过程，是一种不同于坏死的细胞生理性死亡方式。目前，有关白血病细胞凋亡的研究日益增多[1，2]，而对正常骨髓细胞的研究较少。我们采用形态学观察DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪等方法观察了临床常用的几种化疗药物对正常骨髓和白血病细胞诱导凋亡的作用，以探讨化疗药物对这两种细胞作用的差异。
材料及方法
一、标本来源
12例正常骨髓标本取自本院胸外科手术切除之肋骨，除外血液系统疾病及实体瘤伴骨髓转移者，未曾进行过放疗或化疗。
人髓细胞白血病细胞株HL-60由北京医科大学血液研究所提供。
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二、实验方法
1.细胞培养：按本实验室常规制作正常骨髓单个核细胞悬液，调浓度为1×106细胞/ml；取对数生长期的HL-60细胞，调浓度为0.5×106细胞/ml，分别接种于含10%加热灭活胎牛血清的RPMI-1640液中，CO2孵箱中常规培养。分别加入不同浓度的足叶乙甙(VP-16)，即分别为1、10、100 μg/ml，阿糖胞苷(Ara-C)为1、10、100 μg/ml，长春新碱(VCR)为0.01、0.1、1 μg/ml，柔红霉素(DNR)为0.1、1、10 μg/ml，继续培养3、6、12、24、48小时，收获细胞。
2.形态学观察：将培养细胞用离心涂片机制片，甲醇固定，常规苏木精染色，油镜下观察。细胞皱缩、染色质凝聚染成深蓝色、胞核固缩断裂、胞膜仍完整者为凋亡细胞。计数200个细胞中凋亡细胞所占的比例(APO%)。
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3.DNA琼脂糖凝胶电泳：参照Ray等[3]方法。取2×106个正常骨髓细胞或1×106个HL-60细胞，PBS洗涤2遍，加入细胞裂解液及RNA酶，37℃水浴1小时，再加入蛋白酶K，50℃水浴3小时。用饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)及氯仿∶异戊醇(24∶1)各抽提1次。无水乙醇沉淀过夜70%乙醇洗涤1遍，真空干燥，最后溶于20 μl TE液中。取10 μl样品在1.8%琼脂糖凝胶中电泳3～4小时，电泳缓冲液为0.5×TBE，电压为2 V/cm，紫外灯下观察、拍照。有“梯状”(ladder)图谱出现者表明有细胞凋亡发生，有弥漫图谱(smear)出现者表明有细胞坏死发生。
4.流式细胞仪检测：参照Ormerod等[4]方法。取1×106细胞用PBS洗涤2遍，70%冷乙醇4℃固定过夜。次日用PBS洗涤1次，溶于0.5 ml PBS中，加入RNA酶，室温放置30分钟，加入碘化丙啶，400目尼龙膜过滤除去细胞团块，避光放置1小时内上机检测。每份标本测1×104个细胞。细胞发生凋亡后，流式细胞仪可检测到在G1期前出现1个峰，称sub-G1期，其占检测细胞的百分比(sub-G1%)即为细胞发生凋亡的比例。
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三、统计学处理
采用方差分析及t检验。
结果
一、化疗药物诱导正常骨髓细胞凋亡
不同浓度Ara-C与正常骨髓细胞共同培养3～48小时，形态学观察均可见凋亡细胞出现，APO%随药物浓度的增加而增加，在同一浓度下随作用时间延长而增加，100 μg/ml的Ara-c作用48小时，APO%达最高，为30.5%±6.5%(图1)。VP-16、VCR和DNR作用后，APO%的变化趋势同Ara-C。仅APO%比例较低，每种药物在最大浓度作用48小时，APO%分别达VP-16为17.9%±4.6%、VCR为16.7%±4.2%、DNR为12.3%±0.7%。DNA琼脂糖凝胶电泳结果显示：100 μg/ml的Ara-C作用24～48小时有ladder出现，其余药物在不同浓度、不同时间均无ladder出现。
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选择每种药物在最大浓度作用48小时的条件下进行流式细胞仪检测，sub-G1%分别为：Ara-C组27.9%±4.7%、VP-16组10.5%±3.1%、VCR组6.5±1.5%、DNR组4.5%±1.5%
图1 100 μg/ml Ara-c，100 μg/ml VP-16，1 μg/ml VCR，10 μg/ml DNR作用正常骨髓细胞不同时间APO%的比较
图2 不同浓度VP-16作用于HL-60细胞不同时间诱导APO%的变化。
二、化疗药物诱导HL-60细胞凋亡及与正常骨髓细胞的比较
1.VP-16的作用：VP-16作用HL-60细胞，形态学观察到APO%也随作用时间、药物浓度的增加而增加(图2)，100 μg/ml VP-16作用48小时，APO%达最高(80.9%±8.4%)，明显高于同样浓度、时间条件下的正常骨髓细胞组(t=4.523，P?.01)。DNA琼脂糖凝胶电泳发现1、10、100 μg/ml VP-16分别作用24、12、3小时即有ladder出现，持续至48小时。流式细胞仪检测100 μg/ml的VP-16作用HL-60细胞48小时，sub-G1%也明显高于正常骨髓细胞(t=6.975，P?.01)。
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2.Ara-C及VCR的作用：Ara-C和VCR作用HL-60细胞后，3种方法的检测结果及与正常骨髓细胞的比较类似VP-16。
3.DNR的作用：0.1、1 μg/ml DNR作用HL-60细胞，检测结果与VP-16的作用类似，但10 μg/ml DNR作用HL-60细胞6～48小时，形态学观察为大量坏死细胞出现。电泳表现为smear；流式细胞仪检测是大量细胞碎片，无明显周期分布。这表明10 μg/ml DNR主要引起HL-60细胞坏死，而不是凋亡。
讨论
化疗药物在杀伤白血病细胞的同时也杀伤正常骨髓细胞，其作用差异是设计化疗方案的重要依据。我们观察到，在包括临床应用剂量在内的一定剂量范围内，4种常用化疗药物都有诱导正常骨髓细胞凋亡的作用，且其作用大小与药物浓度和作用时间有关，表明诱导凋亡也是化疗药物杀伤正常骨髓细胞的机制之一。4种药物中，Ara-C诱导正常骨髓细胞凋亡的作用最强，其次为VP-16和VCR，DNR的作用较弱。即不同药物的作用强度不同，其机制有待于进一步研究。
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我们将化疗药物对正常骨髓和HL-60细胞的作用进行比较，发现除100 μg/ml的Ara-C和10 μg/ml DNR外，其余药物的几种浓度诱导HL-60细胞凋亡的作用明显大于对正常骨髓细胞的作用。Anand等[5]将阿霉素、地塞米松、α-干扰素、羟基脲分别与慢性粒细胞白血病病人的细胞共同培养一定时间，其形态学观察有凋亡细胞出现，电泳有ladder出现。而同样条件作用正常人外周血单个核细胞，凋亡细胞数明显降低，也无ladder出现。因此，我们认为白血病细胞可能比正常细胞更容易被化疗药物诱导而凋亡，其机制可能与白血病细胞的凋亡通路或信号传导与正常细胞不同有关，有待于今后进一步研究。但这种现象提示临床上可根据这种差异设计更合理的化疗方案，提高对白血病细胞的杀伤作用，减轻对正常骨髓造血功能的抑制。
参考文献
1 Marx J. Cell death studies yield cancer clues [news]. Science, 1993, 259:760-761.
, 百拇医药
2 Lotem J, Sachs L. Regulation by bcl-2, c-myc and p53 of susceptibility to induction of apoptosis by heart shock and cancer chemotherapy compounds in differentiation-competent and -defective myeloid leukemiccells. Cell Growth Differ, 1993, 4:41-47.
3 Ray S, Ponnatpur V, Huang Y, et al. 1-beta-D-arabinofuranosylcytosine-, mitoxantrone-, and paclitaxel-induced apoptosis in HL-60 cells: improvedmethod for detection of internucleosomal DNA fragmentation. Cancer Chemother Pharmacol, 1994, 34:365-371.
, http://www.100md.com
4 Ormerod MG, Collins MK, Rodrigucz-Tarduchy G, et al. Apoptosis in interleukin-3-depenednt haemopoietic cells. Quantitation by two flow cytometric methods. J Immunol Methods, 1992, 153:57-65.
5 Anand S, Verma H, Kumar L, et al. Induction of apoptosis in chronic myelogenous leukemia lymphocytes by hydroxyurea and adriamycin. Cancer Lett, 1995, 88:101-105.
(收稿：1997-02-18 修回：1997-06-08), http://www.100md.com