缺氧缺血性脑病新生鼠胃壁内一氧化氮的改变
作者：王琳 黄绍敏 吴河水 吴建平
单位：430022 武汉，同济医科大学附属协和医院儿科(王琳、黄绍敏)，普外科(吴河水)；同济医科大学环境毒理教研室(吴建平)
关键词：一氧化氮；氨基酸氧化还原酶炎；脑缺氧；脑缺血
中华儿科杂志980203.htm 【摘要】 目的 探讨缺氧缺血性脑病新生鼠胃壁局部一氧化氮(NO)的改变及窒息对消化系统的影响。方法 采用二氢硫辛酰胺脱氢酶NADPH组织化学方法，检测24只正常或缺氧新生鼠胃壁各层一氧化氮合成酶(NOS)的分布变化。结果 急性缺氧组与正常对照组相比，NOS阳性产物无论在分布、染色深浅、纤维密度及NOS阳性胞体数目上，差异均无显著意义(P>0.05)。但在缺氧缺血性脑病组，其肌层的NOS阳性纤维无论是密度还是染色深浅，均明显强于正常对照组，NOS阳性胞体亦明显多于正常对照组，其差异有非常显著意义(P<0.01)；而粘膜和粘膜下层的NOS分布与正常对照组相比，差异无显著意义(P>0.05)。结论 窒息时胃动力降低及胃粘膜病变与一氧化氮在胃壁内的改变有关。
, 百拇医药
Changes in gastric nitric oxide in neonatal rats with hypoxic-ischemic encephalopathy Wang Lin, Huang Shaomin, Wu Heshui, et al. The Union Hospital of Tongji Medical University, Wuhan 430022
【Abstract】 Objective To study the changes in nitric oxide (NO) in gastric wall in neonatal rats with hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE) and the influence of asphyxia on digestive system. Methods NADPH distribution of histochemistry analysis was taken to show the distribution of nitric oxide synthase (NOS) in the gastric wall of 24 neonatal rats. Results There was no significant difference in the number of NOS-positive neuronal bodies and the density of NOS positive fibers between acute hypoxic rats and the normal controls (P>0.05). However, in HIE neonatal rats, the NOS-positive reaction products were markedly increased in the gastric muscle (P<0.01) but not in the mucosal and submucosal layers compared with the control rats (P>0.05). Conclusion Decreased gastric motivation and the gastric mucosal lesion caused by asphyxia are associated with the changes in NO in gastric wall.
, 百拇医药
【Key words】 Nitric oxide Amino acid oxidoreductases Cerebral anoxia Cerebral ischemia
一氧化氮(nitric oxide, NO)是近年来发现的一种新的胃肠道动力强抑制性神经递质，还具有舒张血管、保护胃肠粘膜的作用。已有报道，窒息新生儿血中NO代谢产物亚硝酸/硝酸根离子(NO-2/NO-3)的浓度呈下降趋势[1]。但窒息时NO在胃壁局部是否改变，是否与新生儿窒息时消化系统受影响有关尚不清楚，本研究应用二氢硫辛酰胺脱氢酶NADPH组织化学方法(ND法)对此进行初步探讨。
材料和方法
一、实验动物
正常7日龄、体重18～22g的SD 新生鼠24只。随机分成3组(每组8只)：(1)正常对照组；(2)急性缺氧组：吸入8%浓度氧10～15分钟；(3)缺氧缺血性脑病(HIE)组：结扎左颈动脉并吸入8%浓度氧2小时[2]。
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二、采用ND法观察一氧化氮合成酶(NOS)在胃壁内的分布[3]。
1.上述各组动物以2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后开胸，经左心室插管，灌注4℃、4%多聚甲醛约20 ml后立即切下全胃，以0.01 mol/L PBS(pH值 7.4)洗去胃内容物后置上述固定液内固定12小时(4℃)，再移入20%蔗糖缓冲液中过夜(4℃)。
2.将胃切成胃底及胃窦两部分，置-20℃冰冻，以冰冻切片机在-20℃下切片，厚15 μm，铺平，贴于涂有明胶的干净载玻片上，室温晾干。
3.ND组化反应：将切片边缘以蜡笔画圈(防止液体流失)，然后滴加NOS反应液(取还原型辅酶Ⅱ NADPH 4 mg，硝基四氮唑蓝(NBT)0.4 mg，0.3% Triton-X100 4 ml，充分搅拌直至完全溶解于圈内，盖满切片，装于湿盒内，置37℃反应60分钟；各组取2张玻片不加NADPH反应液作阴性对照。反应完毕后均以0.01 mol/L PBS冲洗，终止反应，晾干，逐级脱水、透明、封固，光镜下观察NOS阳性纤维分布、数NOS阳性细胞数，并且照相，相片经MPIAS-500多媒体彩色病理图文分析系统在1.75×105μm2测量窗口下测面密度及平均灰度(面密度反映阳性纤维分布的密度，其值越大，纤维分布越密；平均灰度反映阳性纤维染色深浅，其值越大，染色越浅)。
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三、统计学方法
急性缺氧组或HLE组与正常组之间NOS阳性细胞数、面密度及平均灰度的比较采用t检验。
结果
ND法显示的阳性反应产物呈蓝色均质沉淀。正常新生鼠胃壁各层均可见NOS阳性产物分布，粘膜及粘膜下层可见少量NOS阳性物质及散在NOS阳性纤维，呈串珠状；粘膜下层血管壁周围有NOS阳性分布，高倍镜下呈砂粒状。其面密度4.3±0.7，平均灰度161±10。肌层见大量NOS阳性纤维，染色较深，内层环肌多于外层纵肌，其面密度6.7±0.5，平均灰度135±9；肌间可见较多的NOS阳性细胞，平均4.6个/HP。急性缺氧组与正常对照组相比，无论在分布、染色深浅、纤维密度及NOS阳性细胞数上，差异均无显著意义(P>0.05)。但在缺氧缺血性脑病组，其肌层的NOS纤维无论是密度，还是染色深浅均明显强于正常对照组，面密度、平均灰度分别为8.8±0.7、111±8；肌间的NOS阳性细胞亦明显多于正常对照组，平均12.5个/HP(P<0.01)；而在粘膜和粘膜下层的NOS分布与正常对照组相比，差异无显著意义(P>0.05)(表1，2)。
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表1 各组新生鼠胃壁NOS阳性产物分布 组别
粘膜
粘膜
下层
内环肌
外纵肌
肌间阳性细胞
数(个/HP)
正常对照组
-～+
+
+++
++
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4.6±0.5
急性缺氧组
-～+
+
+++
++
5.0±0.8*
HIE组
-～+
+
++++
+++
12.5±1.2* *
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注：-～+++为NOS阳性分布的分级：-示阴性，+示稀疏，++示中等，+++示密集，++++示特别密集，与正常组相比，*P>0.05，**P<0.01表2 各组新生鼠胃壁NOS阳性纤维彩色
病理图文分析结果 部位与组别
面密度
平均灰度
粘膜及粘膜下层
正常对照组
4±0.7
161±10
急性缺氧组
5±0.7*
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160±11*
HIE组
5±0.7*
159±11*
肌层
正常对照组
7±0.5
135±9
急性缺氧组
7±0.5*
135±11*
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HIE组
9±0.7**
111±8**
注：与正常组比较，* P>0.05，**P<0.01讨论
一、ND法的可靠性
NOS催化L-精氨酸分解生成NO和瓜氨酸，NOS活性变化间接反映了组织内NO含量的变化。已有研究表明，NOS在还原型辅酶Ⅱ(NADPH)存在的条件下能降解硝基四氮唑蓝(NBT)，生成蓝色化合物。本实验利用该原理，以显色程度深浅来间接表示NOS活性。Dowson等[4]证明，ND法显示的神经、血管定位与抗NOS免疫组化显示的NOS定位是一致的。因此，应用ND法显示组织器官局部的NO变化则更简便而有效。
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二、急性缺氧时胃壁内NOS变化
正常新生鼠胃窦、胃底肌层均可见明显的NOS阳性反应产物，粘膜层及粘膜下层较少。急性缺氧时胃壁各层NOS分布改变不明显，分析其原因：(1)内皮细胞损伤程度不重。体内NO合成需有氧的存在，缺血或缺氧时内皮细胞内Ca2+增加，且NADPH生成增加，有NO的大量合成提供了适宜的辅助条件。当内皮细胞进一步损伤时，则出现膜转运L-精氨酸功能障碍。利弊取决于两者的净效应[5]。(2)本组中急性缺氧仅10～15分钟，NOS无明显变化可能与时间太短、NOS基因来不及表达有关。
三、HIE组胃壁内NOS变化
本组显示：HIE组胃壁肌层NOS阳性纤维及胞体明显增多。这些NOS阳性神经属于非肾上腺素能非胆碱、(NANC)神经，其释放的递质为NO[6]。生理学和药理学实验证明NO具有抑制性递质的作用，能引起胃肠道壁平滑肌舒张[7，8]。HIE时肌层NOS阳性纤维增多，局部NO合成和释放增多，可能是导致临床窒息新生儿易出现胃储留、呕吐、腹胀等胃肠动力障碍的原因之一。
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另外，还发现HIE组胃壁粘膜及粘膜下层NOS分布变化不明显。这些NOS阳性反应产物有一部分是NOS纤维与胞体，另一部分分布在血管壁周围，推测它们可能参与粘膜的血流调节。NO除扩张血管外，还与抑制胃粘膜微循环的血小板凝集、改变血管通透性有关，以增强胃粘膜上皮的保护功能及完整性[9，10]。这些部位的NOS阳性产物在HIE时无明显变化，说明HIE新生鼠胃粘膜上皮保护功能代偿不全，当窒息损伤时易引起应激性溃疡、坏死性小肠结肠炎等消化道疾病。
新生鼠窒息时胃动力降低及胃粘膜病变与NO在胃壁内的改变有关，进一步研究其机理，具有重要的理论价值和实际意义。
参考文献
1 徐三清，刘皖君，赵锡慈.窒息新生儿血浆内皮素和一氧化氮水平的动态变化及其临床意义.中华儿科杂志，1996，34：327-329.
2 吴皖芳，徐放生，张莉莉，等.建立新生儿缺氧缺血性脑病动物模型.新生儿科杂志，1992，7：265-267.
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3 Nichols KIM, Staines W, Krantis A. Nitric oxide synthase distribution in the rat intestine: a histochemical analysis. Gastroenterol, 1993, 105:1651-1661.
4 Dowson TM, Bredt DS, Fotuhi M, et al. Nitric oxide synthase and neuronal NADPH diaphorase are identical in brain and peripheral tissue. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88:7797-7801.
5 吴志坚，钱学贤.一氧化氮与心肌缺血-再灌注损伤.国外医学心血管疾病分册，1994，5：262-265.
6 Mckirdy ML, Mckirdy HC, Johnson CD. Non-adrenergic non-cholinergic inhibitory innervation shown by electrical field stimulation of isolated strips of human gall bladder muscle. Gut, 1994, 35:412-416.
, 百拇医药
7 Alm P, Larsson B, Anderson KE. NADPH diaphorase activity and non-adrenergic, non-cholinergic relaxation of the human gastrointestinal tract. Acta Physiol Scand, 1992, 146:285-287.
8 Stark ME, Bauer AJ. Sarr MG, et al. Nitric oxide mediates inhibitory nerve input in human and canine jejunum. Gastrocntcrol, 1993, 104:398-409.
9 Deng A, Baytis C. Locally produced EDRF controls preglomerular resistance and ultrafiltration coefficient. Am J Physiol, 1993, 264(2 Pt 2):F212-215.
10 Moncada S, Palmer RMJ, Higgs EA. Nitric oxide: physiology, pathophysiology and pharmocology. Pharmacol Rev, 1991, 43:109-142.
(收稿：1997-02-04 修回：1997-04-30), 百拇医药
单位：430022 武汉，同济医科大学附属协和医院儿科(王琳、黄绍敏)，普外科(吴河水)；同济医科大学环境毒理教研室(吴建平)
关键词：一氧化氮；氨基酸氧化还原酶炎；脑缺氧；脑缺血
中华儿科杂志980203.htm 【摘要】 目的 探讨缺氧缺血性脑病新生鼠胃壁局部一氧化氮(NO)的改变及窒息对消化系统的影响。方法 采用二氢硫辛酰胺脱氢酶NADPH组织化学方法，检测24只正常或缺氧新生鼠胃壁各层一氧化氮合成酶(NOS)的分布变化。结果 急性缺氧组与正常对照组相比，NOS阳性产物无论在分布、染色深浅、纤维密度及NOS阳性胞体数目上，差异均无显著意义(P>0.05)。但在缺氧缺血性脑病组，其肌层的NOS阳性纤维无论是密度还是染色深浅，均明显强于正常对照组，NOS阳性胞体亦明显多于正常对照组，其差异有非常显著意义(P<0.01)；而粘膜和粘膜下层的NOS分布与正常对照组相比，差异无显著意义(P>0.05)。结论 窒息时胃动力降低及胃粘膜病变与一氧化氮在胃壁内的改变有关。
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Changes in gastric nitric oxide in neonatal rats with hypoxic-ischemic encephalopathy Wang Lin, Huang Shaomin, Wu Heshui, et al. The Union Hospital of Tongji Medical University, Wuhan 430022
【Abstract】 Objective To study the changes in nitric oxide (NO) in gastric wall in neonatal rats with hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE) and the influence of asphyxia on digestive system. Methods NADPH distribution of histochemistry analysis was taken to show the distribution of nitric oxide synthase (NOS) in the gastric wall of 24 neonatal rats. Results There was no significant difference in the number of NOS-positive neuronal bodies and the density of NOS positive fibers between acute hypoxic rats and the normal controls (P>0.05). However, in HIE neonatal rats, the NOS-positive reaction products were markedly increased in the gastric muscle (P<0.01) but not in the mucosal and submucosal layers compared with the control rats (P>0.05). Conclusion Decreased gastric motivation and the gastric mucosal lesion caused by asphyxia are associated with the changes in NO in gastric wall.
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【Key words】 Nitric oxide Amino acid oxidoreductases Cerebral anoxia Cerebral ischemia
一氧化氮(nitric oxide, NO)是近年来发现的一种新的胃肠道动力强抑制性神经递质，还具有舒张血管、保护胃肠粘膜的作用。已有报道，窒息新生儿血中NO代谢产物亚硝酸/硝酸根离子(NO-2/NO-3)的浓度呈下降趋势[1]。但窒息时NO在胃壁局部是否改变，是否与新生儿窒息时消化系统受影响有关尚不清楚，本研究应用二氢硫辛酰胺脱氢酶NADPH组织化学方法(ND法)对此进行初步探讨。
材料和方法
一、实验动物
正常7日龄、体重18～22g的SD 新生鼠24只。随机分成3组(每组8只)：(1)正常对照组；(2)急性缺氧组：吸入8%浓度氧10～15分钟；(3)缺氧缺血性脑病(HIE)组：结扎左颈动脉并吸入8%浓度氧2小时[2]。
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二、采用ND法观察一氧化氮合成酶(NOS)在胃壁内的分布[3]。
1.上述各组动物以2%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后开胸，经左心室插管，灌注4℃、4%多聚甲醛约20 ml后立即切下全胃，以0.01 mol/L PBS(pH值 7.4)洗去胃内容物后置上述固定液内固定12小时(4℃)，再移入20%蔗糖缓冲液中过夜(4℃)。
2.将胃切成胃底及胃窦两部分，置-20℃冰冻，以冰冻切片机在-20℃下切片，厚15 μm，铺平，贴于涂有明胶的干净载玻片上，室温晾干。
3.ND组化反应：将切片边缘以蜡笔画圈(防止液体流失)，然后滴加NOS反应液(取还原型辅酶Ⅱ NADPH 4 mg，硝基四氮唑蓝(NBT)0.4 mg，0.3% Triton-X100 4 ml，充分搅拌直至完全溶解于圈内，盖满切片，装于湿盒内，置37℃反应60分钟；各组取2张玻片不加NADPH反应液作阴性对照。反应完毕后均以0.01 mol/L PBS冲洗，终止反应，晾干，逐级脱水、透明、封固，光镜下观察NOS阳性纤维分布、数NOS阳性细胞数，并且照相，相片经MPIAS-500多媒体彩色病理图文分析系统在1.75×105μm2测量窗口下测面密度及平均灰度(面密度反映阳性纤维分布的密度，其值越大，纤维分布越密；平均灰度反映阳性纤维染色深浅，其值越大，染色越浅)。
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三、统计学方法
急性缺氧组或HLE组与正常组之间NOS阳性细胞数、面密度及平均灰度的比较采用t检验。
结果
ND法显示的阳性反应产物呈蓝色均质沉淀。正常新生鼠胃壁各层均可见NOS阳性产物分布，粘膜及粘膜下层可见少量NOS阳性物质及散在NOS阳性纤维，呈串珠状；粘膜下层血管壁周围有NOS阳性分布，高倍镜下呈砂粒状。其面密度4.3±0.7，平均灰度161±10。肌层见大量NOS阳性纤维，染色较深，内层环肌多于外层纵肌，其面密度6.7±0.5，平均灰度135±9；肌间可见较多的NOS阳性细胞，平均4.6个/HP。急性缺氧组与正常对照组相比，无论在分布、染色深浅、纤维密度及NOS阳性细胞数上，差异均无显著意义(P>0.05)。但在缺氧缺血性脑病组，其肌层的NOS纤维无论是密度，还是染色深浅均明显强于正常对照组，面密度、平均灰度分别为8.8±0.7、111±8；肌间的NOS阳性细胞亦明显多于正常对照组，平均12.5个/HP(P<0.01)；而在粘膜和粘膜下层的NOS分布与正常对照组相比，差异无显著意义(P>0.05)(表1，2)。
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表1 各组新生鼠胃壁NOS阳性产物分布 组别
粘膜
粘膜
下层
内环肌
外纵肌
肌间阳性细胞
数(个/HP)
正常对照组
-～+
+
+++
++
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4.6±0.5
急性缺氧组
-～+
+
+++
++
5.0±0.8*
HIE组
-～+
+
++++
+++
12.5±1.2* *
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注：-～+++为NOS阳性分布的分级：-示阴性，+示稀疏，++示中等，+++示密集，++++示特别密集，与正常组相比，*P>0.05，**P<0.01表2 各组新生鼠胃壁NOS阳性纤维彩色
病理图文分析结果 部位与组别
面密度
平均灰度
粘膜及粘膜下层
正常对照组
4±0.7
161±10
急性缺氧组
5±0.7*
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160±11*
HIE组
5±0.7*
159±11*
肌层
正常对照组
7±0.5
135±9
急性缺氧组
7±0.5*
135±11*
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HIE组
9±0.7**
111±8**
注：与正常组比较，* P>0.05，**P<0.01讨论
一、ND法的可靠性
NOS催化L-精氨酸分解生成NO和瓜氨酸，NOS活性变化间接反映了组织内NO含量的变化。已有研究表明，NOS在还原型辅酶Ⅱ(NADPH)存在的条件下能降解硝基四氮唑蓝(NBT)，生成蓝色化合物。本实验利用该原理，以显色程度深浅来间接表示NOS活性。Dowson等[4]证明，ND法显示的神经、血管定位与抗NOS免疫组化显示的NOS定位是一致的。因此，应用ND法显示组织器官局部的NO变化则更简便而有效。
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二、急性缺氧时胃壁内NOS变化
正常新生鼠胃窦、胃底肌层均可见明显的NOS阳性反应产物，粘膜层及粘膜下层较少。急性缺氧时胃壁各层NOS分布改变不明显，分析其原因：(1)内皮细胞损伤程度不重。体内NO合成需有氧的存在，缺血或缺氧时内皮细胞内Ca2+增加，且NADPH生成增加，有NO的大量合成提供了适宜的辅助条件。当内皮细胞进一步损伤时，则出现膜转运L-精氨酸功能障碍。利弊取决于两者的净效应[5]。(2)本组中急性缺氧仅10～15分钟，NOS无明显变化可能与时间太短、NOS基因来不及表达有关。
三、HIE组胃壁内NOS变化
本组显示：HIE组胃壁肌层NOS阳性纤维及胞体明显增多。这些NOS阳性神经属于非肾上腺素能非胆碱、(NANC)神经，其释放的递质为NO[6]。生理学和药理学实验证明NO具有抑制性递质的作用，能引起胃肠道壁平滑肌舒张[7，8]。HIE时肌层NOS阳性纤维增多，局部NO合成和释放增多，可能是导致临床窒息新生儿易出现胃储留、呕吐、腹胀等胃肠动力障碍的原因之一。
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另外，还发现HIE组胃壁粘膜及粘膜下层NOS分布变化不明显。这些NOS阳性反应产物有一部分是NOS纤维与胞体，另一部分分布在血管壁周围，推测它们可能参与粘膜的血流调节。NO除扩张血管外，还与抑制胃粘膜微循环的血小板凝集、改变血管通透性有关，以增强胃粘膜上皮的保护功能及完整性[9，10]。这些部位的NOS阳性产物在HIE时无明显变化，说明HIE新生鼠胃粘膜上皮保护功能代偿不全，当窒息损伤时易引起应激性溃疡、坏死性小肠结肠炎等消化道疾病。
新生鼠窒息时胃动力降低及胃粘膜病变与NO在胃壁内的改变有关，进一步研究其机理，具有重要的理论价值和实际意义。
参考文献
1 徐三清，刘皖君，赵锡慈.窒息新生儿血浆内皮素和一氧化氮水平的动态变化及其临床意义.中华儿科杂志，1996，34：327-329.
2 吴皖芳，徐放生，张莉莉，等.建立新生儿缺氧缺血性脑病动物模型.新生儿科杂志，1992，7：265-267.
, http://www.100md.com
3 Nichols KIM, Staines W, Krantis A. Nitric oxide synthase distribution in the rat intestine: a histochemical analysis. Gastroenterol, 1993, 105:1651-1661.
4 Dowson TM, Bredt DS, Fotuhi M, et al. Nitric oxide synthase and neuronal NADPH diaphorase are identical in brain and peripheral tissue. Proc Natl Acad Sci USA, 1991, 88:7797-7801.
5 吴志坚，钱学贤.一氧化氮与心肌缺血-再灌注损伤.国外医学心血管疾病分册，1994，5：262-265.
6 Mckirdy ML, Mckirdy HC, Johnson CD. Non-adrenergic non-cholinergic inhibitory innervation shown by electrical field stimulation of isolated strips of human gall bladder muscle. Gut, 1994, 35:412-416.
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7 Alm P, Larsson B, Anderson KE. NADPH diaphorase activity and non-adrenergic, non-cholinergic relaxation of the human gastrointestinal tract. Acta Physiol Scand, 1992, 146:285-287.
8 Stark ME, Bauer AJ. Sarr MG, et al. Nitric oxide mediates inhibitory nerve input in human and canine jejunum. Gastrocntcrol, 1993, 104:398-409.
9 Deng A, Baytis C. Locally produced EDRF controls preglomerular resistance and ultrafiltration coefficient. Am J Physiol, 1993, 264(2 Pt 2):F212-215.
10 Moncada S, Palmer RMJ, Higgs EA. Nitric oxide: physiology, pathophysiology and pharmocology. Pharmacol Rev, 1991, 43:109-142.
(收稿：1997-02-04 修回：1997-04-30), 百拇医药